利用高通量測序技術(shù)篩選地方豬種遺傳特質(zhì)的研究進(jìn)展與啟示

文新望

（湖南省益陽市綜合職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校，湖南益陽413002）

利用高通量測序技術(shù)篩選地方豬種遺傳特質(zhì)的研究進(jìn)展與啟示

文新望

（湖南省益陽市綜合職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校，湖南益陽413002）

摘要：目前，新一代測序技術(shù)已逐漸受到廣大科研工作者的關(guān)注和認(rèn)可，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳研究和關(guān)鍵基因的篩選中，并在篩選我國地方豬種遺傳特質(zhì)的研究中展現(xiàn)出較強(qiáng)的挖掘能力。本文從當(dāng)前研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組和microRNA表達(dá)譜出發(fā)，綜述了利用高通量測序技術(shù)篩選地方豬種遺傳特質(zhì)的研究進(jìn)展，以期為評估地方豬種優(yōu)良種質(zhì)特性和挖掘優(yōu)異基因的工作提供參考。

關(guān)鍵詞：高通量測序技術(shù)；地方豬種；種質(zhì)特性；遺傳；研究

作者介紹：文新望，女，漢族，湖南益陽人，中教一級職稱，主要從事生物和計(jì)算機(jī)的教學(xué)工作

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國現(xiàn)有88個(gè)地方豬種，是豬種資源最豐富的國家之一。地方豬種根據(jù)體型外貌、生產(chǎn)性能、氣候條件等可大致分為華北、華中、華南、西南、江南和高原六個(gè)類型［1］，它們所具有的耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、肌內(nèi)脂肪含量高以及繁殖力強(qiáng)等優(yōu)良種質(zhì)特性，不僅受到國人的廣泛關(guān)注，還對世界豬種改良做出了較大貢獻(xiàn)；同時(shí)，它們也是研究豬的特定遺傳性狀的最佳素材。但在外來豬種生長速度較快、瘦肉率較高的優(yōu)點(diǎn)沖擊下，地方豬種的飼養(yǎng)受到很大影響，其飼養(yǎng)范圍逐步縮小。近年來，地方豬種資源的保護(hù)和利用越來越受到政府和社會(huì)各界的關(guān)注，在健全法律法規(guī)、推進(jìn)開發(fā)利用以及建設(shè)地方豬保種場等方面的工作取得了突出成效，如頒布實(shí)施了《中華人民共和國畜牧法》，建設(shè)保種場，劃定保護(hù)區(qū)，建立基因庫和培育配套系等［2］。與此同時(shí)，在科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展進(jìn)步的情況下，對地方豬種深入開展系統(tǒng)研究，利用分子生物學(xué)技術(shù)評估優(yōu)良種質(zhì)特性和挖掘優(yōu)異基因也是刻不容緩的一項(xiàng)工作。近年來，新一代測序技術(shù)因測序通量高、速度快及測序成本低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到廣大科研工作者的關(guān)注和認(rèn)可，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳研究和關(guān)鍵基因的篩選中，并在篩選我國地方豬種遺傳特質(zhì)的研究中展現(xiàn)出較強(qiáng)的挖掘能力。本文從當(dāng)前研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組和microRNA（miRNA）表達(dá)譜出發(fā)，綜述了利用高通量測序技術(shù)篩選地方豬種遺傳特質(zhì)的研究進(jìn)展，以期為評估地方豬種優(yōu)良種質(zhì)特性和挖掘優(yōu)異基因的工作提供參考。

1 高通量測序技術(shù)簡介

當(dāng)前的高通量測序技術(shù)是指在雙脫氧核苷酸末端終止法（Sanger法）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的具有測序通量高、速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)的第二代測序技術(shù)［3］。目前得以廣泛應(yīng)用的測序技術(shù)有三種，即羅氏公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLID技術(shù)，三者的原理、數(shù)據(jù)量產(chǎn)出、數(shù)據(jù)質(zhì)量和運(yùn)行成本均有不同，但其測序步驟大致相當(dāng)，依次為模板準(zhǔn)備、測序和成像、序列組裝和比對等［4］。由于目前測序技術(shù)多由各生物信息技術(shù)公司提供，本文僅對這三種測序技術(shù)做如下簡要介紹。454測序技術(shù)是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行cDNA序列分析的技術(shù)，在一系列酶的協(xié)同作用下使得引物的每一個(gè)dNTP聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光信號獲得DNA序列，其主要優(yōu)點(diǎn)為讀段較長，可達(dá)600～1 000 bp，但其通量最低［5，6］。Solexa技術(shù)的主要原理是邊合成邊測序，利用單分子陣列在小型芯片上進(jìn)行橋式PCR反應(yīng)，在采用新的可逆阻斷技術(shù)后，合理實(shí)現(xiàn)每次只合成一個(gè)堿基，其主要優(yōu)點(diǎn)是測序通量大，結(jié)果較為精確，但讀段通常僅為100～200 bp［5，6］。SOLID技術(shù)主要采用雙堿基編碼原理，通過寡核苷酸連接和檢測進(jìn)行測序，盡管其讀段僅為50 bp左右，但測序錯(cuò)誤率大大降低［5，6］。

2 地方豬種的轉(zhuǎn)錄組研究

轉(zhuǎn)錄組是生物體特定組織或細(xì)胞在某一特定時(shí)間（包括發(fā)育狀態(tài)或功能狀態(tài)）轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA集合。高通量測序技術(shù)可將這一RNA集合測序出來以從整體水平研究基因功能，從差異樣品中篩選出差異表達(dá)的基因，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析得到調(diào)控不同表型的關(guān)鍵基因，從而揭示導(dǎo)致不同表型的分子機(jī)理。

骨骼肌是動(dòng)物體內(nèi)最多的組織，約占體重的40%，其在骨和關(guān)節(jié)的配合下，通過收縮和舒張，完成各種軀體活動(dòng)，對其進(jìn)行發(fā)育和種間比較轉(zhuǎn)錄組研究以揭示分子機(jī)理尤為重要。Zhao等［7］采用Solexa測序技術(shù)對藍(lán)塘豬和長白豬35、49、63、77和91胚齡以及2、28、90、120和180日齡的骨骼肌進(jìn)行了發(fā)育和比較轉(zhuǎn)錄組研究，在藍(lán)塘豬肌肉生成早于長白豬卻慢于長白豬的情況下，共計(jì)鑒定出595個(gè)差異表達(dá)的基因，其中：GSK3B、IKBKB、ACVR1、ITGA和STMN1對后期肌肉的形成具有促進(jìn)作用，ID1、ID2、CABIN1、MSTN、SMAD4、CTNNA1、NOTCH2、GPC3和HMOX1高表達(dá)于藍(lán)塘豬的骨骼肌而致使其分化速度減慢。Zhao等［8］采用Illumina Hi-Seq2000對通城豬和大白豬30、40、55、63、70、90和105胚齡及0、7、21和35日齡的骨骼肌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究，在通城豬各發(fā)育階段骨骼肌中共鑒定出4 331個(gè)差異表達(dá)基因，而大白豬中僅有2 259個(gè)，表明通城豬的骨骼肌發(fā)育受到的調(diào)控更為復(fù)雜；此外，發(fā)現(xiàn)CXCL10、EIF2B5、PSMA6和FBXO32在通城豬骨骼肌發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用。Xu等［9］對梅山豬65胚齡及3、60和120日齡的骨骼肌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究，共計(jì)鑒定出338個(gè)差異表達(dá)的基因，蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)66個(gè)差異表達(dá)的基因，功能分析顯示其功能主要集中于代謝、肌原纖維細(xì)絲形成、細(xì)胞骨架形成、收縮活動(dòng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。陳偉［10］比較了280日齡萊蕪豬和大白豬骨骼肌的轉(zhuǎn)錄組，共計(jì)鑒定出10 482個(gè)基因表達(dá)于二者的骨骼肌中，其中739個(gè)基因僅表達(dá)于萊蕪豬，差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，98個(gè)基因在萊蕪豬中的表達(dá)上調(diào)，80個(gè)下調(diào)。趙栓平［11］比較研究了長白豬、通城豬和五指山豬33、65和90胚齡骨骼肌的轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長白豬、通城豬和五指山豬中分別有1 402、912和1 910個(gè)差異表達(dá)基因；三個(gè)品種豬中有190個(gè)共同的差異表達(dá)基因，長白豬和通城豬中有233個(gè)共同的差異表達(dá)基因，長白豬和五指山豬中有230個(gè)共同的差異表達(dá)基因，通城豬和五指山豬中有83個(gè)共同的差異表達(dá)基因。

地方豬種的肌內(nèi)脂肪含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外來豬種，對二者進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究不僅有利于篩選出調(diào)節(jié)肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)鍵基因，還能深入了解地方豬種高肌內(nèi)脂肪含量的分子機(jī)理。Yu等［12］研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)塘豬背最長肌L*值、肌內(nèi)脂肪含量顯著高于長白豬，pH45分鐘值、pH24小時(shí)值和剪切力值低于長白豬，轉(zhuǎn)錄組研究共鑒定出586個(gè)差異表達(dá)的基因，其中267個(gè)高表達(dá)于藍(lán)塘豬，并鑒定出SCD基因可顯著提高多不飽和脂肪酸比率而降低飽和脂肪酸比率。Wu等［13］比較研究了30、90和150日齡的金華豬和長白豬背最長肌的轉(zhuǎn)錄組，共計(jì)鑒定出2 001個(gè)差異表達(dá)的基因，分析發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)脂肪酸生成相關(guān)基因高表達(dá)于金華豬，其中在90日齡的金華豬背最長肌中高表達(dá)的pFLJ基因與脂肪沉積相關(guān)。此外，脂肪沉積相關(guān)基因的篩選也有助于深入了解地方豬種肌內(nèi)脂肪含量高的分子機(jī)理。Xing等［14］比較研究了不同背膘厚度的松遼黑豬的皮下脂肪轉(zhuǎn)錄組，共計(jì)鑒定出188個(gè)差異表達(dá)的基因，主要富集于脂肪酸合成代謝、脂質(zhì)合成和脂肪酸代謝過程。Li等［15］比較了脂肪型地方豬和瘦肉型外來豬皮下脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果表明1 596個(gè)基因差異表達(dá)，其中84個(gè)僅表達(dá)于地方豬。

此外，包括垂體和乳腺在內(nèi)的一些地方豬種的腺體發(fā)育轉(zhuǎn)錄組也有相關(guān)報(bào)道。Shan等［16］對45、120和180日齡的巴馬香豬和45、120和240日齡的藏豬垂體組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究，分別有1 382和1 162個(gè)基因僅表達(dá)于巴馬香豬和藏豬垂體組織，巴馬香豬中按日齡依次有1 123、64和172個(gè)基因高表達(dá)，而藏豬依次有1 379、210和132個(gè)基因高表達(dá)，4個(gè)激素基因（GH、PRL、LHB和FSHB）在兩個(gè)豬種的各發(fā)育時(shí)間段均高表達(dá)。Zhao等［17］研究了妊娠80、100和110天的母豬乳腺轉(zhuǎn)錄組，比較鑒定出1 409個(gè)差異表達(dá)的基因，富集于脂肪酸合成代謝、mTOR信號通路等，其中TP53、ARNT2、E2F4和PPARG對妊娠期乳腺的后期發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。

3 地方豬miRNA表達(dá)譜研究

microRNA（miRNA）是一系列長約22 nt的非編碼RNA，它們通過靶向mRNA的3’非翻譯區(qū)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，研究表明細(xì)胞過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞循環(huán)、分化和形態(tài)轉(zhuǎn)化中表達(dá)的基因，其中大于60%的基因受miRNA直接調(diào)節(jié)［18］。

在肌肉組織中，Hou等［19］等量混合通城豬18個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的背最長肌總RNA后，采用Solexa技術(shù)鑒定出275個(gè)已知的miRNA，新預(yù)測出78個(gè)miRNA。Zhao等［20］從通城豬33、65、90胚齡和180日齡的骨骼肌中共計(jì)鑒定出779個(gè)miRNA，差異表達(dá)的miRNA達(dá)214個(gè)。Zhou［21］以90胚齡和120日齡大白豬和二花臉豬雜交后代的骨骼肌中共計(jì)鑒定出47個(gè)miRNA，其中29個(gè)差異表達(dá)。

在脂肪組織的研究中，通過比較不同發(fā)育階段以及不同品種的miRNA表達(dá)譜，鑒定出大量新的miRNA。Li等［22］采用Solexa技術(shù)對7和240日齡的榮昌豬背部皮下脂肪組織進(jìn)行了miRNA表達(dá)譜研究，鑒定出227個(gè)miRNA，新預(yù)測出59個(gè)，其中有126個(gè)miRNA差異表達(dá)。Chen等［23］比較研究了150日齡大白豬和梅山豬背部皮下脂肪組織miRNA表達(dá)譜，鑒定出215個(gè)差異miRNA，新預(yù)測出140個(gè)，其中142個(gè)差異表達(dá)。Li等［24］通過比較藍(lán)塘豬和長白豬脂肪組織鑒定出171個(gè)miRNA，差異表達(dá)的miRNA達(dá)48個(gè)。

在生殖器官或組織中，Li等［25］采用Solexa技術(shù)比較了210日齡藏豬睪丸組織和卵巢組織miRNA表達(dá)譜，鑒定出732個(gè)miRNA，其中336個(gè)共表達(dá)于兩個(gè)組織，分別有115和222個(gè)miRNA僅表達(dá)于卵巢和睪丸組織，且24個(gè)位于X染色體上miRNA在卵巢中的表達(dá)量顯著高于睪丸組織。Liu等［26］比較研究20和210日齡藏豬睪丸組織的miRNA表達(dá)譜，鑒定出461個(gè)miRNA，新預(yù)測出121個(gè)miRNA，差異表達(dá)的miRNA數(shù)量達(dá)303個(gè)。Lian等［27］采用Solexa技術(shù)對30和180日齡軍牧-1豬睪丸組織miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了研究，共鑒定出469個(gè)miRNA，新預(yù)測56個(gè)，且有15個(gè)miRNA為豬特有，差異表達(dá)的數(shù)量達(dá)122個(gè)。

4 篩選地方豬種遺傳特質(zhì)的方向與啟示

綜上所述，近年來隨著分子遺傳學(xué)的迅速發(fā)展，地方豬種的種質(zhì)特性不斷被挖掘。高通量測序技術(shù)出現(xiàn)后，使得從整體水平全面解析地方豬種的這些種質(zhì)特性成為可能，這不僅有利于評估優(yōu)良種質(zhì)特性和挖掘優(yōu)異基因，還能為深入研究基因功能提供理論依據(jù)。但是，僅從轉(zhuǎn)錄組學(xué)和miRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究，相比于復(fù)雜的生理過程，其結(jié)果顯得較為單一，且現(xiàn)有數(shù)據(jù)仍可挖掘出很多有價(jià)值的信息，因此，在利用高通量技術(shù)挖掘種質(zhì)特性的遺傳信息時(shí)，可以引入蛋白組學(xué)和GWAS（全基因組關(guān)聯(lián)分析）進(jìn)行多組學(xué)研究，達(dá)到相互印證的效果，采用多種生物信息學(xué)方法深入挖掘現(xiàn)有數(shù)據(jù)以獲得更多有價(jià)值的遺傳信息；此外，對已挖掘出的優(yōu)異基因進(jìn)行深入的功能研究也是很有必要的；高通量測序技術(shù)這種從整體水平到單個(gè)基因功能的研究模式，為其進(jìn)一步應(yīng)用于豬遺傳改良、指導(dǎo)輔助育種工作、提高選擇的效率和準(zhǔn)確度提供了理論依據(jù)。

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中圖分類號：S813.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1673-4645（2016）05-0067-04

收稿日期：2016-03-31