清醒挪威褐鼠過敏性哮喘發(fā)作全程記錄模型

陶婧婧，徐燕鋒，韓云林，徐玉環(huán)，秦　川，高　虹，張星東

(衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京　100021)

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清醒挪威褐鼠過敏性哮喘發(fā)作全程記錄模型

陶婧婧，徐燕鋒，韓云林，徐玉環(huán)，秦川，高虹，張星東

(衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京100021)

【摘要】目的建立卵蛋白(OVA)致敏激發(fā)后，在挪威褐鼠無(wú)創(chuàng)且清醒的狀態(tài)下，可觀察和記錄到過敏性哮喘發(fā)作全過程(速發(fā)相和遲發(fā)相)的動(dòng)物模型。方法 66只挪威褐鼠按致敏液[OVA和Al(OH)3]不同平均分為11組，單純注射OVA的4組(0.01、0.1、1.0和10.0 mg/只)；OVA混合Al(OH)3干粉的5組(0.1+100、1.0+100、10.0+100、1.0+52和1.0+4 mg/只)；OVA 混合Al(OH)3膠體的1組(10.0+4 mg/只)；正常對(duì)照組1組。10個(gè)致敏組分別于第0天和第5天背部皮下2點(diǎn)注射相應(yīng)致敏液，每點(diǎn)注射0.2 mL，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。在第37天霧化吸入5% OVA激發(fā)10 min。然后立即放入體積描記器中連續(xù)記錄16 h 呼氣相延長(zhǎng)參數(shù)(penh)值。采集第0、7、14、21、28、35、38天血清，ELISA法檢測(cè)特異性IgE含量。HE染色觀察肺病理變化。結(jié)果除單純注射OVA 0.01 mg組外，其他各組大鼠血清特異性IgE含量均比正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，且在致敏1周后IgE開始大量產(chǎn)生，直到第5周均呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。觀察到了哮喘發(fā)作的速發(fā)和遲發(fā)雙相氣道反應(yīng)，其特點(diǎn)表現(xiàn)在Penh值的顯著增高，且與正常對(duì)照組相比，模型組(以O(shè)VA 10.0 & Al(OH)3100、OVA 10.0 & Al(OH)3gel 4組為例)的速發(fā)相/遲發(fā)相峰值、面積均顯著增大(P<0.05)。模型組(以O(shè)VA 10.0 & Al(OH)3100組為例)有以氣道周圍嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥表現(xiàn)。結(jié)論 成功建立了無(wú)創(chuàng)、清醒狀態(tài)下挪威褐鼠過敏性哮喘發(fā)作全程記錄模型。

【關(guān)鍵詞】過敏性哮喘；挪威褐鼠；呼氣相延長(zhǎng)參數(shù)；速發(fā)相反應(yīng)；遲發(fā)相反應(yīng)

過敏性哮喘(以下簡(jiǎn)稱哮喘)，是一種以可逆性支氣管痙攣和氣道高反應(yīng)性為特點(diǎn)的氣道慢性炎癥。臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性喘息、帶有哮鳴音的呼氣性呼吸困難、胸悶、咳嗽等。臨床上給患者做特異性抗原激發(fā)試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)作時(shí)可出現(xiàn)速發(fā)相(early-phase asthmatic response, EAR)和遲發(fā)相(late-phase asthmatic response, LAR)。EAR發(fā)生在接觸抗原數(shù)分鐘內(nèi)，一般持續(xù)1～2 h，肥大細(xì)胞釋放預(yù)合成的活性介質(zhì)從而導(dǎo)致支氣管痙攣和氣道黏膜水腫及血管通透性增加進(jìn)而引起喘息癥狀；LAR時(shí)喘息癥狀加重，持續(xù)時(shí)間比EAR長(zhǎng)，可達(dá)10 h甚至更久，主要是EAR時(shí)期趨化、募集來(lái)的以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)而形成的炎癥反應(yīng)過程[1]。

目前對(duì)哮喘的研究日益增多，但無(wú)論是機(jī)理研究還是藥物篩選，都需要先選擇合適的模型才能獲得有意義的研究成果。目前用于哮喘研究的模型有麻醉模型和清醒模型。麻醉模型的動(dòng)物需要在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行氣管插管，接呼吸機(jī)后進(jìn)行氣道阻力的檢測(cè)，主要分為麻醉哮喘模型和麻醉氣道高反應(yīng)性模型2種。二者的區(qū)別在于麻醉哮喘模型是用致敏時(shí)的抗原特異激發(fā)后進(jìn)行氣道阻力的檢測(cè)，麻醉氣道高反應(yīng)性模型在抗原特異激發(fā)時(shí)不作檢測(cè)，乙酰膽堿等非特異激發(fā)時(shí)檢測(cè)[2]。清醒模型中的動(dòng)物在檢測(cè)時(shí)為清醒狀態(tài)，氣道無(wú)機(jī)械損傷，主要以清醒氣道高反應(yīng)性模型為主。清醒氣道高反應(yīng)性模型在特異激發(fā)時(shí)亦不作檢測(cè)，乙酰膽堿等非特異激發(fā)后檢測(cè)[3]，與麻醉氣道高反應(yīng)性模型原理相同。氣道高反應(yīng)性模型關(guān)注的是哮喘發(fā)作后氣道過度敏感的狀態(tài)，而不是哮喘發(fā)作時(shí)的狀態(tài)，所以無(wú)法真正說明喘息的變化。而且氣道高反應(yīng)性不是哮喘獨(dú)有的特異性的反應(yīng)，在慢性阻塞性肺疾病等疾病中也可能發(fā)生，所以在未排除上述干擾因素的情況下，檢測(cè)精確度會(huì)降低。麻醉模型雖然觀察了哮喘發(fā)作時(shí)的變化，但動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)，可持續(xù)記錄時(shí)間短，主要用于EAR階段的研究，不易觀察到幾小時(shí)后的LAR[4-6]。而LAR持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，喘息更劇烈，是哮喘發(fā)作過程中的重要部分，對(duì)LAR的研究有利于進(jìn)一步探索哮喘發(fā)病機(jī)理和開發(fā)有效治療措施。

本工作正是基于LAR的研究需要，擬建立一個(gè)能連續(xù)觀察EAR和LAR的動(dòng)物模型。采用挪威褐鼠為模型動(dòng)物，卵蛋白(ovalbumin, OVA)為變應(yīng)原，記錄并分析OVA特異性激發(fā)后哮喘發(fā)作全過程(EAR和LAR)，評(píng)價(jià)不同造模方法的特點(diǎn)，確立挪威褐鼠過敏性哮喘發(fā)作全程記錄模型構(gòu)建方案。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)挪威褐鼠 66只，6 ～ 8周，體重140 ～ 150 g。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】，在本實(shí)驗(yàn)室屏障環(huán)境的飼養(yǎng)間【SYXK(京)2013-0014】飼養(yǎng)。飼喂無(wú)OVA的普通滅菌飼料。動(dòng)物購(gòu)入后，在屏障設(shè)施內(nèi)適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)涉及的動(dòng)物飼養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)【ILAS-PL-2013-001】。

1.2主要試劑和儀器

OVA、牛血清蛋白(albumin from bovine serum, BSA)、氫氧化鋁(Al(OH)3)、吐溫-20均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。氫氧化鋁膠體購(gòu)自美國(guó)Invivogen公司。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗大鼠IgE抗體購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司。TMB購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。PBS緩沖液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PARI Turbo BOY N壓縮霧化吸入機(jī)購(gòu)自德國(guó)百瑞公司。Buxco WBP大鼠體積描記器購(gòu)自美國(guó)DSI公司。FLUOstar Omega酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)BMG Labtech公司。

1.3動(dòng)物分組及致敏方法

66只挪威褐鼠按致敏液(OVA和Al(OH)3)不同平均分為11組，單純注射OVA的4組(0.01、0.1、1.0和10.0 mg/只)；OVA混合Al(OH)3干粉的5組(0.1+100、1.0+100、10.0+100、1.0+52和1.0+4 mg/只)；OVA 混合Al(OH)3膠體的1組(10.0+4 mg/只)；正常對(duì)照組1組。且于第0天和第5天，在每只挪威褐鼠背部皮下2點(diǎn)注射相應(yīng)致敏液，每點(diǎn)注射0.2 mL，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.4血液采集

正常對(duì)照組和OVA 10.0 & Al(OH)3100組于第0、7、14、21、28、35、 38 天 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，其余組于第35天，使用0.1 mL/只(10 mg)鹽酸氯胺酮麻醉后，剪尾采血200 μL/只，4℃，3 000 r/min離心10 min得血清。

1.5激發(fā)及取材

所有組于第37天，給予5 mL 5 % OVA霧化吸入10 min。激發(fā)后立即放入體積描記器中，每30 s記錄一個(gè)呼氣相延長(zhǎng)參數(shù)(enhanced pause, Penh)值，連續(xù)不間斷記錄16 h[7]。動(dòng)物于第38天記錄結(jié)束后，用0.5 mL/只(10%)戊巴比妥鈉過量麻醉處死，摘取左肺放入4 %中性甲醛溶液中固定。

1.6ELISA法檢測(cè)IgE抗體

先用OVA包被96孔板，再用BSA封閉抗原，然后結(jié)合1.4血清樣本(第35天樣本稀釋比例：正常對(duì)照組為1∶100，其余組為1∶4 000； 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本稀釋比例：正常對(duì)照組為1∶100，OVA 10.0 & Al(OH)3100組為1∶16 000)，再結(jié)合辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗大鼠IgE抗體(1:25 000)，然后用TMB顯色，最后用2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度(absorbance, A)，A值與板中結(jié)合的IgE含量成正比[8]。

1.7HE染色觀察肺病理變化

使用1.5中4%中性甲醛固定24 h后的左肺，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(5 μm)。HE染色后在光鏡下觀察肺組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況及其他病理變化。

1.8數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析方法

2結(jié)果

2.1 特異性IgE

由表1可以看出，除OVA 0.01組，OVA 0.1、OVA 1.0、OVA 10.0、OVA 0.1 & Al(OH)3100、OVA 1.0 & Al(OH)3100、OVA 10.0 & Al(OH)3100、OVA 1.0 & Al(OH)352、OVA 1.0 & Al(OH)34、OVA 10.0 & Al(OH)3gel 4組血清IgE含量與正常對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.05)，且隨OVA劑量增大，IgE含量升高，加入佐劑組比單一OVA組抗體含量高。OVA 10.0組與相當(dāng)于其1 % OVA含量但加入了一定佐劑的OVA 0.1 & Al(OH)3100組產(chǎn)生的抗體含量相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OVA 10.0 & Al(OH)3100組與OVA 10.0 & Al(OH)3gel 4組的IgE含量差異無(wú)顯著性，均較其他組高，以O(shè)VA 10.0 & Al(OH)3100組為最高。以O(shè)VA 10.0 & Al(OH)3100組為例，從圖1 IgE含量隨時(shí)間變化曲線可以看出，致敏后IgE水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴性增長(zhǎng)，在第1周內(nèi)與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異，1周后IgE水平開始快速升高，在第2周內(nèi)劇烈增長(zhǎng)，2周后漲幅變緩慢呈現(xiàn)穩(wěn)定的持續(xù)增長(zhǎng)，在第5周達(dá)峰值，第 38天時(shí)略有下降。

表1　不同致敏方法對(duì)第35天IgE含量的影響

注：前60 min Penh曲線(圖2B)，16 h Penh曲線(圖2A)。圖2　正常對(duì)照組Penh移動(dòng)平均曲線Note. 2A: 16 hours Penh curve, 2B: The first 60 minutes of Penh curve.Fig.2　The Penh running average curve of the normal control group

圖1　OVA注射后血清特異IgE水平變化Fig.1　Time course of serum specific IgE levels after OVA immunization

2.2 哮喘發(fā)作速發(fā)相和遲發(fā)相

正常對(duì)照組激發(fā)后的Penh曲線在16 h內(nèi)較穩(wěn)定，沒有明顯波動(dòng)(圖2A)。其Penh限值為1.14(0.90+3*0.08)，大于1.14即為Penh值升高。與正常對(duì)照組相比(圖2B)，致敏組(OVA 10.0 & Al(OH)3100組為代表)激發(fā)后Penh值立即升高，其Penh曲線在前1 h內(nèi)有明顯上升(圖3B)。之后曲線有輕度下降，再開始劇烈上升達(dá)峰值后劇烈下降再緩慢下降至基線水平(圖3A)。如表2所示，單一OVA 0.1 mg至10 mg致敏，激發(fā)后均出現(xiàn)氣道反應(yīng)。低劑量時(shí)僅有EAR，隨劑量增加，反應(yīng)加重，LAR發(fā)生的比例增加。加入Al(OH)3佐劑致敏后反應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)，EAR和LAR都出現(xiàn)的動(dòng)物可達(dá)半數(shù)以上。如表3所示，正常對(duì)照組和OVA 10.0 & Al(OH)3100、OVA 10.0 & Al(OH)3gel 4組的EAR峰值和LAR峰值都有差異，兩個(gè)模型組沒有差異。兩個(gè)模型組的EAR面積、LAR持續(xù)時(shí)間、LAR面積也無(wú)明顯差異。OVA 10.0 & Al(OH)3100組連續(xù)出現(xiàn)EAR和LAR的動(dòng)物數(shù)為整組6只，OVA 10.0 & Al(OH)3gel 4組為5只，另1只僅有EAR。

表3　OVA 10.0 & Al(OH)3 100、OVA 10.0 & Al(OH)3 gel 4組速發(fā)相和遲發(fā)相

2.3肺組織病理檢測(cè)結(jié)果

如圖4，與正常對(duì)照組相比(圖4C、D)，OVA 10.0 & Al(OH)3100組(圖4A、B)顯示血管充血，肺組織有灶性出血，肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)有滲出，分泌物增多(箭頭所示)，且以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞也增多(圖4見封二)。

3討論

哮喘造模動(dòng)物有大鼠、小鼠、豚鼠、羊和狗等[9]，以嚙齒類動(dòng)物最為常用，大鼠與豚鼠相比不易在哮喘發(fā)作中死亡，與小鼠相比更容易出現(xiàn)喘息癥狀，更利于進(jìn)行喘息的研究。近交系挪威褐鼠是哮喘研究中常用的大鼠品系，挪威褐鼠與人類在哮喘發(fā)作時(shí)具有很多類似的特點(diǎn)，如EAR和LAR狀態(tài)、對(duì)乙酰膽堿非特異激發(fā)的反應(yīng)、IgE的產(chǎn)生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等方面[10-11]，符合本研究關(guān)注哮喘發(fā)作全過程的特點(diǎn)，適合作為本研究的模型動(dòng)物。

OVA致敏激發(fā)引起動(dòng)物哮喘是現(xiàn)在哮喘動(dòng)物模型造模最常用的方法[12]，使用“通用變應(yīng)原”O(jiān)VA造模符合本研究擬建立普適性哮喘動(dòng)物模型的要求。文獻(xiàn)中報(bào)道的致敏方式多樣，有腹腔注射、足底注射、皮下注射等不同注射部位[13]、OVA多種不同濃度，Al(OH)3佐劑[14]和弗氏佐劑[15]等不同佐劑，致敏的次數(shù)也有不同。本研究以觀察到典型的EAR和LAR為目的，參考文獻(xiàn)資料，初步確立了采用OVA和Al(OH)3佐劑混合作為致敏液在第0天首次皮下注射，第5天再次強(qiáng)化致敏，第37天霧化激發(fā)的實(shí)驗(yàn)方案，探索最佳造模方法。

LAR時(shí)期是哮喘炎癥反應(yīng)的主要階段[16]?？煞€(wěn)定觀察LAR的動(dòng)物模型對(duì)哮喘機(jī)理研究和治療藥物研究的意義重大。鑒于目前沒有合適的穩(wěn)定觀察LAR的OVA致敏哮喘動(dòng)物模型，本研究建立了國(guó)內(nèi)首個(gè)OVA作為變應(yīng)原的無(wú)創(chuàng)、清醒挪威褐鼠過敏性哮喘發(fā)作全程記錄模型，可記錄和分析哮喘發(fā)作時(shí)EAR和LAR的變化，其主要指標(biāo)Penh的升高和氣道阻力的增加有很好的相關(guān)性[17-18]，可以間接反映支氣管的狹窄程度，而且和哮喘發(fā)作時(shí)呼氣相延長(zhǎng)也有一致性，本研究發(fā)現(xiàn)，Penh值的變化能很好的反映哮喘發(fā)作兩相的強(qiáng)弱，可將其作為呼氣相延長(zhǎng)參數(shù)，用于喘息狀態(tài)判定。

本研究對(duì)激發(fā)后哮喘發(fā)作狀態(tài)的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了16 h連續(xù)記錄，每只動(dòng)物獲得1920個(gè)Penh數(shù)值。根據(jù)哮喘發(fā)作時(shí)人類EAR的特點(diǎn)為變應(yīng)原吸入后10 min內(nèi)發(fā)生，持續(xù)1至2 h，和對(duì)挪威褐鼠激發(fā)后Penh曲線的分析，將本模型的EAR定義為激發(fā)后前1 h。在EAR結(jié)束后立即進(jìn)入LAR時(shí)期，可持續(xù)十幾小時(shí)，此時(shí)的Penh值開始劇烈升高，動(dòng)物喘息增加，達(dá)峰值后開始下降，喘息緩解，最后下降到基線或接近基線水平，降至基線水平以下為哮喘發(fā)作狀態(tài)完全緩解。本模型的LAR部分定義為EAR結(jié)束后至Penh曲線與基線交叉時(shí)止。基線定義為正常對(duì)照組16 h的Penh均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，EAR和LAR的有效Penh值為高于基線的部分。

IgE在哮喘激發(fā)中起重要作用，是致敏成功的關(guān)鍵，本研究發(fā)現(xiàn)加入Al(OH)3佐劑的致敏液比單純OVA致敏產(chǎn)生的IgE更多，在一定劑量范圍，IgE含量均隨OVA濃度增加而增加，與文獻(xiàn)報(bào)道相同[19-20]；還發(fā)現(xiàn)致敏液中加入等量Al(OH)3佐劑后，IgE含量亦均隨OVA濃度增加而增加。本研究發(fā)現(xiàn)，致敏后IgE含量在一定時(shí)間范圍內(nèi)，有時(shí)間依賴性增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在1周后IgE水平開始快速升高，2周后漲幅變緩慢呈現(xiàn)穩(wěn)定的持續(xù)增長(zhǎng)，第5周達(dá)到高峰后開始下降。所以在d 0致敏后，二次強(qiáng)化致敏的時(shí)間應(yīng)選擇在7 d以內(nèi)，此時(shí)IgE抗體水平較低，機(jī)體再次接觸OVA時(shí)仍屬于致敏階段，而不會(huì)激發(fā)哮喘發(fā)作。鑒于已有文獻(xiàn)證實(shí)高IgE含量對(duì)哮喘發(fā)作有促進(jìn)作用[21]，所以根據(jù)本模型觀察哮喘發(fā)作的特點(diǎn)，造模的激發(fā)時(shí)間應(yīng)控制在第5周左右，可在較高IgE水平下激發(fā)，以獲得較好的EAR和LAR反應(yīng)圖像。在第38天時(shí)IgE含量略有下降，可能是由于第37天激發(fā)時(shí)消耗了一些抗體，也可能是抗體在5周后就會(huì)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其具體原因還需要進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)在低IgE含量時(shí)，很難觀察到哮喘EAR和LAR，高IgE含量時(shí)，更易觀察到哮喘發(fā)作，且EAR和LAR更易連續(xù)出現(xiàn)，表明在一定范圍內(nèi)，隨IgE含量增長(zhǎng)，哮喘發(fā)作增強(qiáng)，與文獻(xiàn)報(bào)道的IgE含量對(duì)哮喘發(fā)作有促進(jìn)作用相符。但I(xiàn)gE并不是唯一影響因素，致敏除了產(chǎn)生IgE對(duì)哮喘發(fā)作造成影響外，致敏條件本身也會(huì)影響哮喘發(fā)作。本研究發(fā)現(xiàn)IgE含量相當(dāng)?shù)膬山M，其中添加Al(OH)3佐劑的組比未添加組更能促進(jìn)EAR和LAR的出現(xiàn)，本研究還發(fā)現(xiàn)添加了Al(OH)3佐劑致敏的6組中，每組有超過一半的動(dòng)物可連續(xù)觀察到EAR和LAR，未添加組則很難觀察到，說明Al(OH)3佐劑除了促進(jìn)IgE生成，加強(qiáng)致敏反應(yīng)外，也能促進(jìn)哮喘發(fā)作。與文獻(xiàn)報(bào)道的Al(OH)3能促進(jìn)Th2反應(yīng)增強(qiáng)，即Al(OH)3有利于哮喘發(fā)展[22]相一致。所以本模型適宜選擇能產(chǎn)生較高IgE且添加Al(OH)3佐劑的方法來(lái)致敏。

在最佳造模方法的確立方面，本研究發(fā)現(xiàn)OVA 0.01組顯示出低IgE水平，與正常對(duì)照組沒有明顯差異，提示單純使用0.01 mg OVA致敏效果欠佳，且激發(fā)后無(wú)法觀察到EAR和LAR，該方法不適合進(jìn)行造模。IgE含量高且添加Al(OH)3佐劑的OVA 10.0 & Al(OH)3100和OVA 10.0 & Al(OH)3gel 4組相比其他組更易連續(xù)觀察到EAR和LAR，兩組均能產(chǎn)生較好的EAR，但LAR部分，使用Al(OH)3膠體時(shí)有的動(dòng)物不能出現(xiàn)LAR，而使用干粉組全部出現(xiàn)LAR。二組雖然IgE水平相近，但使用的佐劑劑型和含量不同，膠體與OVA需按照一定體積比混合才能保證穩(wěn)定性，其最大使用量即為OVA 10.0 & Al(OH)3gel 4組的用量(含Al(OH)34 mg),干粉只能配成混懸液不受穩(wěn)定性限制可以按需使用，所以干粉組能全部出現(xiàn)LAR可能與其使用的Al(OH)3含量高，而使Th2反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。同時(shí)，在其他組中，OVA劑量相同佐劑劑量不同時(shí)，高劑量佐劑組更易連續(xù)觀察到EAR和LAR，也從一定程度上說明Al(OH)3佐劑含量高時(shí)更利于促進(jìn)哮喘發(fā)作。對(duì)于本研究的模型，想要觀察到好的EAR和LAR圖像，不僅要選擇較高的IgE含量同時(shí)還要選擇合適的佐劑。當(dāng)研究主要關(guān)注LAR，特別是關(guān)注炎癥反應(yīng)部分的研究時(shí)，推薦使用本研究中OVA 10.0 & Al(OH)3100組的造模方法。主要關(guān)注EAR時(shí)，也可將Al(OH)3干粉換成Al(OH)3膠體，使用OVA 10.0 & Al(OH)3gel 4組的造模方法，相比使用干粉，膠體使用量少，且易與OVA混合，方便注射，但某些動(dòng)物有無(wú)法產(chǎn)生LAR的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)EAR無(wú)影響，所以需根據(jù)實(shí)際情況選擇。

本研究發(fā)現(xiàn)，OVA混合Al(OH)3聯(lián)合致敏，其注射點(diǎn)處會(huì)形成持久性結(jié)節(jié)，一直到第38天處死時(shí)，仍不消退，透過皮膚觸摸時(shí)結(jié)節(jié)質(zhì)硬，不能移動(dòng)。切開皮膚后看到結(jié)節(jié)薄膜完整，剪開后內(nèi)部為濕潤(rùn)粉狀，可能是聚集在一起的Al(OH)3，起到對(duì)OVA緩釋的作用，減少注射后OVA擴(kuò)散，達(dá)到持久致敏的效果(圖5，見封二)，此現(xiàn)象也可能與文獻(xiàn)報(bào)道的鋁佐劑能吸附抗原，形成抗原貯存庫(kù)，增強(qiáng)抗原免疫原性[23]相關(guān)。

本研究遵循哮發(fā)病機(jī)制即I型超敏反應(yīng)，變應(yīng)原致敏激發(fā)后觀察到了哮喘發(fā)作全過程，和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)，成功建立了OVA致敏的，在挪威褐鼠無(wú)創(chuàng)且清醒的狀態(tài)下，可觀察和記錄到過敏性哮喘發(fā)作全過程的動(dòng)物模型。確立了最佳致敏液配比為OVA10 mg/只混合Al(OH)3100 mg/只，第2次致敏強(qiáng)化時(shí)間為7 d以內(nèi)，激發(fā)時(shí)間為第35天左右。

本模型作為國(guó)內(nèi)首個(gè)以O(shè)VA作為抗原，在動(dòng)物清醒狀態(tài)下記錄哮喘發(fā)作全過程的挪威褐鼠模型，彌補(bǔ)了以往哮喘動(dòng)物模型需要麻醉的不足，更加貼近人類患者進(jìn)行哮喘激發(fā)試驗(yàn)的情況，能完整模擬哮喘患者發(fā)病到緩解的全過程，可連續(xù)觀察EAR和LAR反應(yīng)，進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)16 h或更長(zhǎng)的記錄，其數(shù)值和圖像也可同步展示出來(lái)，方便進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)。而且，應(yīng)用該方法可對(duì)同一動(dòng)物進(jìn)行多次無(wú)創(chuàng)傷的檢測(cè)，可進(jìn)行手術(shù)、藥物等干預(yù)因素施加前后的自身對(duì)比。本模型不僅可用于哮喘機(jī)理研究，也為哮喘治療藥物研究提供了一種新的工具和方法。有望在將來(lái)的哮喘研究中發(fā)揮重要作用。

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〔修回日期〕2015-04-25

研究報(bào)告

Evaluation of asthma exacerbation in an ovalbumin-sensitized

conscious Brown Norway rat model

TAO Jing-jing, XU Yan-feng, HAN Yun-lin, XU Yu-huan, QIN Chuan, GAO Hong, ZHANG Xing-dong

(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health; Key Laboratory of Human Diseases Animal Model,

State Administration of Traditional Chinese Medicine; Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of

Medical Sciences (CAMS) & Comparative Medical Center, Peking Union Medical College (PUMC), Beijing 100021, China )

【Abstract】ObjectiveTo establish an animal model in which both early-phase asthmatic response (EAR) and late-phase asthmatic response (LAR) can be observed after sensitization and subsequent inhalation challenge with ovalbumin (OVA). Animals were conscious with no narcotic used, unrestricted, and fed ad libitum. Methods Sixty-six SPF 6-8-week old male Brown Norway rats were divided into eleven equal groups. All groups of rats except normal control group were injected subcutaneously with 0.4 mL (sc in back, 2 sites, 0.2 mL/site) OVA or OVA + Al(OH)3solution on day 0 and day 5. Four groups were given OVA only at the dose of 0.01, 0.1, 1.0 or 10.0 mg/rat, five groups were given OVA + Al(OH)3powder at the dose of 0.1+100, 1.0+100, 10.0+100, 1.0+52 and 1.0+4 mg/rat, one group was given OVA+Al(OH)3gel at the dose of 10.0+4 mg/rat. Normal control group was injected subcutaneously with the same volume of saline. All the groups were challenged for 10 minutes with 5 mL 5%OVA aerosol on day 37. Enhanced pause (Penh) was recorded for 16 hours in a whole-body plethysmography system after challenge. Specific IgE of the serum samples on day 0, 7, 14, 21, 28, 35, 38 were measured by ELISA. Pulmonary pathological changes were observed using HE staining. ResultsCompared with the normal control group, immunized rats except the group given 0.01 mg OVA produced specific IgE (P<0.05), and the content of IgE grew sharply after 7 days, and always kept growing until 5 weeks. The whole course of asthma exacerbation was recorded successfully. The rats developed EAR and/or LAR within 16 hours following OVA challenge. Especially the groups injected with 10 mg OVA and 100 mg Al(OH)3or 4 mg Al(OH)3gel showed steady pattern of biphasic airway responses and their EAR or LAR peak, and the area under the curve were increased significantly compared with those of the normal control group (P<0.05). Inflammation characterized by eosinophil infiltration was observed in the rat lung of model group (OVA 10.0 & Al(OH)3100 group as a representative case). ConclusionsIn this work we successfully developed a new model using conscious rats, and the whole time course of asthma exacerbation in this model can be observed after OVA challenge. This model may become a useful tool for further asthma research.

【Key words】Allergic asthma; Brown Norway rats; Enhanced pause; Early-phase asthmatic response; Late-phase asthmatic response

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.001

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 06-0001-08

[通訊作者]張星東，教授，Email： zhangxd@cnilas.org；高虹，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： gaohongdws@aliyun.com。

[作者簡(jiǎn)介]陶婧婧，女，碩士研究生，研究方向：過敏性哮喘治療研究。

[基金項(xiàng)目]中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所人才引進(jìn)基金(編號(hào): DWS201202);973計(jì)劃(2011CB504903)；863計(jì)劃(2013AA020106)。