新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎動物模型建立方法改進

劉斌　閻靜江　李曉霞

[摘要] 目的 使用環(huán)境模擬實驗裝置建立一個更為標(biāo)準(zhǔn)及簡便易行的新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎動物模型造模方法。方法 75只新生24 h昆明小鼠隨機分為5組，A1、A2和A3組采用人工喂養(yǎng)+缺氧復(fù)氧冷刺激+LPS灌胃；B組單純?nèi)斯の桂B(yǎng)，C組為正常對照組。飼喂72 h后處死小鼠，進行腸道組織病理學(xué)評分。 結(jié)果 處理組新生鼠腸道組織與單純?nèi)斯の桂B(yǎng)組及正常對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且實驗結(jié)果重復(fù)性較好。 結(jié)論 使用環(huán)境模擬實驗裝置建立的NEC動物模型在病因?qū)W上符合NEC 的病理生理特點，并將動物模型造模裝置規(guī)范化，改善了自制裝置重復(fù)性較差的缺點，更適用于研究新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎。

[關(guān)鍵詞] 新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎；腸道損傷；動物模型；新方法

[中圖分類號] R725.7 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）35-0022-04

[Abstract] Objective To establish a standard and simple method of the neonatal necrotizing enterocolitis（NEC） animal model by the environment simulation equipment. Methods Seventy-five newborn mice at age of 24 hours were randomLy divided into 5 groups. Group A1 group， A2 group and A3 group were given artificial feeding， discontinuities cold/hypoxia exposure and LPS gavage. Group B was only given artificial feeding. Group C was a control group. Mice were sacrificed after being fed for 84 hours. Intestinal histopathology was scored. Results There was statistically significant between group A1， group B and group C （P<0.05）. In addition， all the repeated tests were obtained a same result. Conclusion The NEC animal model established by environmental simulation experiment was coincidence of the character of pathophysiology for NEC and improved the poor repeatability disadvantage， which made the NEC model device more normalizes. Thus， the model was very suitable to research NEC.

[Key words] Neonatal necrotizing enterocolitis； Injury of intestine； Animal model； New method

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是一種具有潛在致死性的新生兒胃腸道急癥，由于缺乏有效預(yù)防治療措施，患兒死亡率較高，對新生兒存活率有著嚴(yán)重影響，從而受到臨床醫(yī)生和研究人員的高度重視。近年來，由于小兒重癥監(jiān)護病房（PICU）的應(yīng)用及醫(yī)務(wù)人員綜合素質(zhì)的提高，許多早產(chǎn)兒和低體重兒得以存活，NEC的發(fā)病率也隨之有增加趨勢[1-4]。因此，在NEC的研究中迫切需要建立一種簡便易行、既高效又規(guī)范的新生兒NEC 動物模型建模方法，以進一步探求該疾病的發(fā)病機制并進行有效的預(yù)防治療。由于目前國內(nèi)外模型建立方法主要為自制實驗器材，器材尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[5-9]，故本研究目的是以國內(nèi)外研究為基礎(chǔ)，對建模器材及方法加以改進，建立一個標(biāo)準(zhǔn)且簡單易行的新生兒NEC 動物模型造模方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

本次實驗動物均購自山西醫(yī)科大學(xué)，符合國標(biāo)GB14922-94無特定病原體動物級質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。取用新生昆明小鼠75只，雌雄不限，體重約5～10 g。新生鼠出生24 h后即與母鼠分離，隨機分成5組，處理組A1、A2和A3參考多因素聯(lián)合造模方案[10]，持續(xù)處理72 h，并分別由不同實驗員對處理組A1、A2和A3組分別進行操作；處理組B采用單純?nèi)斯の桂B(yǎng)，持續(xù)處理72 h；對照組C采用母鼠乳喂養(yǎng)作為正常對照。

其中，處理組A1、A2、A3和處理組B出生后即置入環(huán)境模擬實驗裝置中通過鼠乳代用品進行人工喂養(yǎng)；對照組C測量體重并標(biāo)記后返回各自母鼠旁，繼續(xù)與母鼠同籠，鼠乳喂養(yǎng)。

實驗過程中新生鼠如發(fā)生死亡或嚴(yán)重實驗意外（如外傷、逃逸等）則進行排除，不計入實驗結(jié)果。

1.2 主要試劑及儀器

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），雀巢特別能恩早產(chǎn)/低出生體重配方奶粉，英脫利匹特脂肪乳注射液（C14-24），小兒復(fù)方氨基酸注射液（19AA-Ⅰ），BD 密閉式靜脈留置針24G，環(huán)境模擬實驗裝置（專利號201110214221.5）。

1.3 造模方法

1.3.1 人工喂養(yǎng) 新生鼠置于環(huán)境模擬實驗裝置內(nèi)進行人工喂養(yǎng)，配制人工代乳品（表1）[11]，采用留置針去芯軟針頭進行管飼。喂養(yǎng)前用脫脂棉球蘸生理鹽水對新生鼠口腔及面部皮膚進行清潔。人工喂養(yǎng)所使用的留置針每次使用完畢后即刻在流動水中清洗。清潔后使用75%醫(yī)用酒精消毒，并密封保存。再次使用前應(yīng)用滅菌生理鹽水進行沖洗以去除表面附著的酒精。試驗中使用的留置針每鼠一支，不重復(fù)使用。首日每次喂養(yǎng)量控制在不少于0.1 mL，以后每過24 h喂養(yǎng)量增加0.1 mL，每日喂養(yǎng)次數(shù)不少于8次，視新生鼠具體情況調(diào)整飼喂間隔，夜間新生鼠活動性下降，飼喂間隔可酌情延長。

1.3.2 缺氧復(fù)氧冷刺激 于實驗狀態(tài)的環(huán)境模擬實驗裝置內(nèi)充入純氮，箱內(nèi)氧氣濃度降至零后迅速將新生鼠由保育狀態(tài)的環(huán)境模擬實驗裝置中轉(zhuǎn)移至實驗狀態(tài)的環(huán)境模擬實驗裝置內(nèi)，持續(xù)以1.5 L/min通入氮氣，維持窒息 1 min后將提前4℃預(yù)冷處理的水袋放入環(huán)境模擬實驗裝置內(nèi)，并將裝置溫度調(diào)至4℃，將新生鼠放置在水袋上進行低溫處理，同時，持續(xù)以1.5 L/min流量通入氧氣，控制氧濃度大于50%，刺激10 min。處理后將新生鼠移回保育狀態(tài)的環(huán)境模擬實驗裝置，每日刺激3次。

1.3.3 LPS灌胃 LPS以10 g/kg稀釋于0.1 mL滅菌水中，使用去芯留置針頭通過口腔插管灌胃，每日1次，連續(xù)3 d。

1.4 標(biāo)本采集

各組乳鼠每日定時稱量體重，于造模開始后第72小時停止飼喂處死取標(biāo)本。在小鼠腹部正中切開腹腔，分離腸血管及系膜。取回盲部及其遠近端共5 cm腸管置入包埋盒進行石蠟包埋，所有標(biāo)本采集均在冰上完成。

1.5 腸組織病理學(xué)檢查與評分

回盲部及其遠近端共5 cm腸管石蠟包埋后，作4～5 μm 連續(xù)切片，常規(guī)HE 染色，采用隨機數(shù)法對每個切片進行隨機編號，觀片人員采用盲法對每個標(biāo)本進行腸道組織的病理學(xué)評分，病理學(xué)評分采用雙盲法，評分標(biāo)準(zhǔn)參考Nadler標(biāo)準(zhǔn)[12]。評分細則如下：0分：腸道組織結(jié)構(gòu)正常，腸道上皮、絨毛完整；1分：黏膜下或固有層輕有微腫脹分離；2分：黏膜下和（或）固有層中度分離，黏膜下和（或）肌層水腫；3分：黏膜下和（或）固有層重度分離，黏膜下和（或）肌層水腫，局部絨毛脫落；4分：腸絨毛消失并伴有腸壞死等。評分≥2分者視為模型動物發(fā)生了NEC病理改變。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析用SPSS11.5（SPSS公司，美國）軟件在Windows XP環(huán)境下進行。計量數(shù)據(jù)資料使用中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（Q）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗法進行分析，進一步根據(jù)平均秩次進行兩兩比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

處理組A1、A2、A3組新生鼠在實驗開始后24 h內(nèi)即出現(xiàn)主動活動減少，對外界刺激反應(yīng)減緩甚至消失。同時伴有排黃綠色甚至黑色稀便等大便性狀的改變。開始實驗后處理組A1、A2、A3組和處理組B組新生鼠均出現(xiàn)不同程度出現(xiàn)腹脹和胃潴留的癥狀。對照組C組生長發(fā)育無明顯異常，體重增長穩(wěn)定，主動活動及對外界刺激反應(yīng)良好，進食及排便正常，無消化道異常表現(xiàn)。

2.2 外觀改變

處理組A1、A2、A3組和處理組B組腸道組織均與對照組相比有明顯差異。處理組A1、A2和A3組腸道外觀改變較為明顯，回盲部近端大段腸管外觀呈黑紅色，光澤度及彈性明顯下降。處理組B 組可見回盲部近端腸管顏色呈黃紅色，部分腸管可見污黃色，光澤和彈性較正常組織有下降。此外，處理組A1、A2、A3組和處理組B組新生鼠腸腔內(nèi)均有不同程度積氣，少數(shù)重度者可呈串珠樣，尚無腸穿孔癥狀出現(xiàn)。對照組C組腸管顏色粉嫩，有光澤，彈性良好，未見積氣。

2.3 病理學(xué)改變

在處理組A1、A2、A3組新生鼠腸道組織病理可見明顯壞死。鏡下可見腸壁絨毛變性水腫，壞死、甚至脫落消失。腸壁內(nèi)腺體排列紊亂，甚至消失，腸道肌層不同程度變薄甚至部分?jǐn)嗔选Ｖ囟裙逃袑蛹梆つは聦铀[，伴有大量炎性細胞浸潤，病理學(xué)評分均為 3～4 分（封三圖1），與正常對照組新生鼠相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。處理組B組新生鼠鏡下可見中度絨毛充血水腫，腺體排列紊亂，個別可見輕度的壞死，部分伴有中性粒細胞浸潤，與處理組A1、A2、A3組新生鼠炎癥程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且與正常對照組C組新生鼠差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。正常對照組C組新生鼠的腸道結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理學(xué)改變。見表2。

3 討論

小腸及結(jié)腸的廣泛斑片狀壞死是NEC的主要特征，一旦發(fā)生即可在短期內(nèi)引發(fā)全身性敗血癥和多器官功能衰竭，進而導(dǎo)致死亡。迄今為止，NEC確切的病因及發(fā)病機制尚未被完全闡明，現(xiàn)階段的研究僅提示：不當(dāng)人工喂養(yǎng)、早產(chǎn)及感染等是NEC發(fā)病的危險因素。近年來國內(nèi)外大量研究也顯示：循環(huán)LPS濃度在NEC患者和NEC的動物模型中均呈升高趨勢[13]；而且循環(huán)LPS濃度的增加可進一步破壞腸道上皮細胞[14]，并激活白細胞，釋放大量炎性細胞因子[15]。綜合以上觀點認為NEC的主要病理生理過程為：多種因素相互作用下導(dǎo)致的黏膜損傷誘發(fā)患兒產(chǎn)生繼發(fā)性免疫應(yīng)答，進一步導(dǎo)致腸道黏膜內(nèi)抗炎—促炎因子平衡的失衡，從而引起一系列腸道壞死性改變。

目前大部分NEC動物模型造模采用的都是自制實驗裝備，因為裝備制作工藝和功能的限制，導(dǎo)致了NEC動物模型在造模過程中無法規(guī)范實驗條件，其他實驗室在進行重復(fù)實驗時無法還原參考文獻中的造模條件，導(dǎo)致NEC動物模型造模實驗條件實際上各不相同。特別是實驗中無規(guī)范的新生動物保育措施，容易導(dǎo)致模型動物本身處于非保育狀態(tài)，對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾，甚至出現(xiàn)意外死亡。本研究采用了環(huán)境模擬實驗裝置（專利號201110214221.5）替代大多數(shù)文獻中使用的自制新生鼠保育裝置，該裝置優(yōu)勢在于可以通過顯示器實時監(jiān)控保育箱溫度、濕度、氧濃度及氣壓等多項指標(biāo)，并可通過程序自動調(diào)節(jié)氣體排量，維持穩(wěn)定氣壓，可以避免實驗氣體大量快速進入而造成的實驗動物損傷，通過負壓排氣裝置配合內(nèi)部空氣循環(huán)裝置可以在短時間將氣體完全置換，且氣密性較好，不易發(fā)生漏氣或換氣不全等情況，特別適合于新生動物保育及缺氧窒息等特殊通氣條件下的動物實驗。本研究中還將多因素聯(lián)合造模實驗分為3次進行，由不同實驗人員在不同時間段進行，正式實驗前需通過幾次預(yù)實驗使實驗人員對人工喂養(yǎng)技術(shù)和環(huán)境模擬實驗裝置操作進行熟悉，減少因為操作生疏造成的實驗動物意外傷害，最終重復(fù)實驗結(jié)果之間并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（表2），證明使用環(huán)境實驗?zāi)M裝置制作的NEC動物模型可重復(fù)性較強，有利于實驗?zāi)Ｐ偷耐茝V和改進。

在本研究前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外文獻普遍提及的缺氧窒息時間為10 min甚至更長[10]，但實際使用環(huán)境模擬實驗裝置進行缺氧窒息2 min后動物死亡率就達100%，多次重復(fù)實驗均呈類似結(jié)果，因無法還原其他實驗室自制保育裝置難以具體分析其實際原因，因此根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果將本研究中缺氧窒息時間調(diào)整為1 min，在保證盡可能減少實驗動物意外死亡的前提下給予適當(dāng)?shù)娜毖踔舷ⅰ?/p>

在臨床實踐中，NEC 最常見的發(fā)病原因是早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不當(dāng)和缺氧，感染等導(dǎo)致的，其中喂養(yǎng)不當(dāng)往往是最主要的致病原因，部分患兒出生后僅有喂養(yǎng)不當(dāng)史而無缺氧窒息和感染史，因此本實驗將人工喂養(yǎng)作為單一條件進行造模，并與多因素聯(lián)合造模進行比較，病理結(jié)果顯示，人工喂養(yǎng)作為單一因素造模也會造成腸道損傷，但與多因素聯(lián)合造模結(jié)果相比腸道損傷程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），多因素聯(lián)合造模更接近NEC發(fā)病的臨床特征，更為科學(xué)合理。本研究中單純?nèi)斯の桂B(yǎng)的新生鼠病理評分為1（1）分[M（Q）]，腸道損傷程度較輕，且未發(fā)生意外死亡及其他疾病表現(xiàn)，新生鼠活動性及外觀狀況接近于鼠乳喂養(yǎng)新生鼠，說明環(huán)境模擬實驗裝置保育性能較好，在非實驗狀態(tài)可以給予動物較為穩(wěn)定的保育環(huán)境。

本研究中使用環(huán)境模擬實驗裝置建立的NEC動物模型采用多因素聯(lián)合造模方式，綜合了臨床常見的危險因素包括：早產(chǎn)、產(chǎn)后窒息、腸道致病菌感染、不當(dāng)人工喂養(yǎng)、缺血再灌注損傷等，符合NEC 的病理生理特點。本研究中使用的環(huán)境模擬實驗裝置將NEC動物模型造模裝置規(guī)范化，改善了自制裝置重復(fù)性較差的缺點，加強了非實驗狀態(tài)下的保育措施，更適用于新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎的研究。

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（收稿日期：2015-09-21）