人腦膠質(zhì)瘤GDNF基因啟動(dòng)子Ⅰ區(qū)H3組蛋白乙?；揎椙闆r研究

戴燕燕　陳茂華

[摘要] 目的 分析GDNF基因啟動(dòng)子在人體膠質(zhì)瘤Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙?；╝cetylization）修飾情況以及人體膠質(zhì)瘤的GDNF基因啟動(dòng)子表達(dá)方式。 方法 選取正常腦組織20例，實(shí)施反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）的檢測(cè)方法來檢測(cè)GDNF基因啟動(dòng)子的相關(guān)表達(dá)方式，在實(shí)時(shí)定量熒光PCR（Real-time PCR）的基礎(chǔ)上建立好染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）。 選取人體膠質(zhì)瘤20例，實(shí)施反轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)方法來檢測(cè)GDNF基因啟動(dòng)子的相關(guān)表達(dá)方式，在此基礎(chǔ)上建立好CHIP方法分析GDNF基因啟動(dòng)子在Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙酰化的相關(guān)修飾情況。 結(jié)果 實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法在檢查人體膠質(zhì)瘤GDNF基因啟動(dòng)子方式的表達(dá)方面，隨著RT-PCR的檢測(cè)水平級(jí)別升高而升高，轉(zhuǎn)錄水平中的正常組以及高低級(jí)別組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 GDNF基因啟動(dòng)子在人體膠質(zhì)瘤Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙?；揎椙闆r很有可能會(huì)影響到GDNF基因的相關(guān)表達(dá)方式。

[關(guān)鍵詞] 人體膠質(zhì)瘤；GDNF；基因啟動(dòng)子；蛋白乙?；恍揎椙闆r

[中圖分類號(hào)] R739.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）35-0001-04

[Abstract] Objective To analyze the H3 protein histone acetylation modification conditions in I region of human gliomas GDNF gene promoter and to explore the expression of human glioma GDNF gene promoter. Methods A total of 20 cases of patients with normal brain tissue were chosen， and the detection method of reverse transcription （RT-PCR） was used to detect the associated expression method of GDNF gene promoter. On the basis of real-time quantitative fluorescent PCR （Real-time PCR）， Chromatin immunoprecipitation （CHIP） was established. 20 cases of patients with human glioma were chosen， and reverse transcription method was implemented to detect the relevant expression of GDNF gene promoter. On this basis， CHIP method was established to analyze the H3 protein histone acetylation modification conditions in I region of human gliomas GDNF gene promoter. Results By real-time quantitative fluorescent PCR method in checking human glioma GDNF gene expression， with the elevated detected levels of RT-PCR， the expression amount increased. There were statistically significant differences in comparing the normal-level transcription group， the low-level transcription group and the high-level transcription group （P<0.05）. Conclusion H3 protein histone acetylation modification conditions in I region of human gliomas GDNF gene promoter is likely to affect the related expression of GDNF-related genes.

[Key words] Human glioma； GDNF； Gene promoter； Histone acetylation； Modification conditions

人體膠質(zhì)瘤是人體顱腦內(nèi)比較常見的腫瘤，膠質(zhì)瘤的死亡率較高，僅次于肺癌。根據(jù)相關(guān)資料顯示，患膠質(zhì)瘤以后在3年的時(shí)間內(nèi)患者的死亡率達(dá)95.8%[1-3]。另外，膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，為了找出更理想的治療路徑，本文主要結(jié)合表觀遺傳學(xué)來分析其具體的治療方法。膠質(zhì)瘤的相關(guān)病因在目前尚不清楚，但是隨著細(xì)胞學(xué)、分子生物研究學(xué)以及遺傳學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，目前的相關(guān)研究資料表明，膠質(zhì)瘤的發(fā)生是一個(gè)繁瑣而又復(fù)雜的過程，其中主要包括一些進(jìn)行性的改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞失控性增長(zhǎng)。筆者將結(jié)合相關(guān)實(shí)際情況，分析GDNF基因啟動(dòng)子在人體膠質(zhì)瘤（Human glioma）Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙?；╝cetylization）修飾情況以及人體膠質(zhì)瘤的GDNF基因啟動(dòng)子表達(dá)方式，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

美國PE公司的擴(kuò)增儀（型號(hào)為Optima 8000），德國EKSHGN公司的核酸蛋白檢測(cè)儀（型號(hào)為ClearFirst-5000Process型），北京儀器廠的轉(zhuǎn)移電泳儀（型號(hào)為EPS-200）。

1.2 主要試劑

提取染色質(zhì)，聚合酶鏈反應(yīng)試劑（深圳生物科技有限公司），PCR試劑盒，凝膠電泳試劑（上海生物科技有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)，傳代試劑（北京生物科技有限公司）。

1.3 組織來源

采取蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批的40例標(biāo)本，選取正常腦組織20例（正常對(duì)照組，其中低水平10例，高水平10例），20例人體膠質(zhì)瘤組織，低水平10例，高水平10例，按照相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析。

1.4 試驗(yàn)方法

采用定時(shí)定量熒光水平檢測(cè)方法檢測(cè)人體膠質(zhì)瘤GDNF基因啟動(dòng)子，提取反轉(zhuǎn)錄以及RNA，按照相關(guān)實(shí)驗(yàn)的說明書進(jìn)行如下操作：先將0.5 μg/μL primer加入Real-time PCR試管中混勻，放入60℃孵育箱，保持10 min，10 min之后迅速降溫處理，之后再加入20 U/μL的FHVHJKHIHGVIOGHUIHYGU，在上述的一系列工作之后立即使用 PCR檢測(cè)。

制備標(biāo)準(zhǔn)線，針對(duì)GDNF基因啟動(dòng)子，合成PCR引物，以293細(xì)胞為主要模板，在此基礎(chǔ)上使用GDNF基因啟動(dòng)子以及HGVKSJHO基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。收回?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，在接連回收之后構(gòu)建好TA載體，轉(zhuǎn)化DH細(xì)胞組織。選取菌落鑒定克隆基因形態(tài)，培養(yǎng)質(zhì)粒次序并送去檢測(cè)順序，用計(jì)算機(jī)拷貝基因數(shù)。另外，將質(zhì)粒數(shù)按照10倍稀釋的拷貝數(shù)來進(jìn)行稀釋，稀釋鏈為1×101 COPIES/μL，1×103 COPIES/μL，1×107 COPIES/μL，1×105 COPIES/μL，1×106 COPIES/μL。將稀釋之后的樣品作為定時(shí)定量熒光水平檢測(cè)方法，再得到CT數(shù)值，制作好標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)方法（CHIP-PCR）

根據(jù)染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒的說明書來進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹，使用交聯(lián)方法，采用1%左右的甲醛溶液細(xì)胞固定液，在常溫下孵育5 min，在最終濃度為125 mM時(shí)，停止交聯(lián)反應(yīng)。去除含蛋白酶的抑制劑，分解細(xì)胞組織。用預(yù)冷的洗滌劑洗滌2次或者2次以上，每次均為10 mL左右。

采用超聲破碎DNA，將EP管注入到超聲破碎池中，保持10 min左右，保留上清。染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)方法（CHIP-PCR）：將樣品分為2份，每一份樣品取20 μL存放于零下1℃的冷藏室內(nèi)，做好相關(guān)標(biāo)記后往實(shí)驗(yàn)室的管中加入GWPOHGHN HIOISH 500 μL中。另外，轉(zhuǎn)移上清液放入到新的EP管中，每次均為250 μL，將記錄好的IP對(duì)應(yīng)細(xì)胞組織中，與此同時(shí)去掉元磁珠。采用JHGHOLGH SEPARATIONG RACK放置于零下1℃的冷藏室內(nèi)。除掉上清中的染色質(zhì)，如果有相關(guān)需要保存好持續(xù)分析。

PCR驗(yàn)證染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)方法（CHIP-PCR），按照相關(guān)試劑盒說明書來驗(yàn)證PCR，將DNA樣品配置到定時(shí)定量熒光水平檢測(cè)方法（Real-time PCR）的相關(guān)方法中。簡(jiǎn)而言之，就是把樣品加入之后進(jìn)行測(cè)量PCR的方法。需滿足以下3個(gè)方面的熱循環(huán)條件：其一，10 min 95℃預(yù)變性；其二，60 s 95℃變性；其三，30 s 72℃延伸性。

1.6 觀察指標(biāo)

觀察蛋白乙?；l(fā)生在N一端堿性氨基酸集中區(qū)的特定賴氨酸殘基，轉(zhuǎn)移到賴氨酸的sNH3+中和掉1個(gè)正電荷。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人體膠質(zhì)瘤組織中GDNF基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平與正常腦組織比較

GEHIGH結(jié)果顯示，正常腦組織以及人體膠質(zhì)瘤低高級(jí)別組中的表達(dá)量隨著級(jí)別的升高而顯著提高；實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法在檢查人體膠質(zhì)瘤GDNF基因啟動(dòng)子方式的表達(dá)方面，隨著RT-PCR的檢測(cè)水平級(jí)別升高而升高，轉(zhuǎn)錄水平中的正常對(duì)照組以及高低級(jí)別組之間差異比較大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF mRNA）的表達(dá)方面，正常組以及高低級(jí)別組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖1、2。

2.2 GDNF基因啟動(dòng)子H3組蛋白乙酰化情況

CHIP實(shí)驗(yàn)不僅能夠檢測(cè)蛋白以及相關(guān)的蛋白修飾，還能檢測(cè)到與DNA相互結(jié)合的蛋白。舉例來說，蛋白乙酰化以及蛋白磷酸化的上述特質(zhì)都以特異性抗體來進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，通過交聯(lián)方式來使DNA蛋白以及蛋白-蛋白之間的作用固定在活性狀態(tài)中。在超聲治療的基礎(chǔ)上把基因破摔成片段，片段大約在100～1200 BP大小，以此加入到抗體的沉淀中去，在此時(shí)，沉淀物的抗體有著特異的作用，將蛋白與蛋白-DNA之間的相互作用進(jìn)行合理的研究與聯(lián)系，最終將以DNA的模板進(jìn)行Real-time PCR分析方法，最終判斷為人體膠質(zhì)瘤GDNF基因啟動(dòng)因子在人體膠質(zhì)瘤（Human glioma）Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙?；╝cetylization）修飾情況，具體分析H3組賴氨酸殘基（Lysine residues）9位乙?；木唧w情況，見圖3。

3討論

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF mRNA）是一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的大家族，在發(fā)生人體膠質(zhì)瘤的過程中有著重要的地位和作用。本文的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GDNF基因啟動(dòng)子在人體膠質(zhì)瘤的組織表達(dá)中有著明顯升高的趨勢(shì)，這與張陽等[3]學(xué)者在慢病毒介導(dǎo)新型Tet-On系統(tǒng)調(diào)控大鼠GDNF和TH雙基因表達(dá)對(duì)帕金森病大鼠的實(shí)驗(yàn)研究一文中的相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果是保持高度一致的[4-6]。因此，對(duì)GDNF基因啟動(dòng)因子的相關(guān)研究是能夠有效發(fā)現(xiàn)人體膠質(zhì)瘤的重要指標(biāo)之一。因此，本文的主要研究目的是綜合分析并明確確定GDNF基因啟動(dòng)子在人體膠質(zhì)瘤（human glioma）Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙?；╝cetylization）修飾情況，具體分析H3組賴氨酸殘基（lysine residues）9位乙?；木唧w情況，從中研究出人體膠質(zhì)瘤（human glioma）的GDNF基因啟動(dòng)子表達(dá)方式以及相關(guān)影響。

在本次的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)CHIP（染色質(zhì)免疫共沉淀）方法對(duì)正常腦組織組以及高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤內(nèi)的GDNF基因啟動(dòng)子Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙酰化（acetylization）修飾情況進(jìn)行適度的檢測(cè)。表觀遺傳學(xué)（epigenetics）的相關(guān)研究是在核苷酸沒有發(fā)生任何改變的基礎(chǔ)上進(jìn)行一系列的研究分析，表觀遺傳學(xué)在發(fā)生可遺憾的變化時(shí)能夠系統(tǒng)地分析出遺傳學(xué)的相關(guān)分支，其主要分支包括以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：其一，基因甲基化；其二，蛋白質(zhì)乙酰化；其三，蛋白質(zhì)磷酸化；其四，蛋白質(zhì)糖基化；其五，蛋白質(zhì)泛素化。在真核細(xì)胞的相關(guān)研究中有82.5%～92.5%的蛋白質(zhì)存在著乙?；那闆r（這其中包括組蛋白以及非組蛋白）。采用比較高分辨率的研究質(zhì)譜可以有效檢測(cè)到蛋白上的對(duì)乙?；c(diǎn)。在檢查乙?；c(diǎn)之外，還可以檢測(cè)到DNA復(fù)制以及損傷的情況（主要以蛋白質(zhì)為主）。另外，與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的調(diào)節(jié)部分以及轉(zhuǎn)錄部分其代謝的酶以及蛋白等都存在乙?；?。從上述情況來看，乙?；诘鞍踪|(zhì)以及細(xì)胞組織的基本生理過程中有著非常重要的作用，與歐雅莉等[7]學(xué)者在靜脈移植轉(zhuǎn)染GDNF基因的人臍血CD34+細(xì)胞改善局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能一文中的相關(guān)研究結(jié)果是保持高度一致的。

本文的相關(guān)研究結(jié)果顯示實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法在檢查人體膠質(zhì)瘤GDNF基因啟動(dòng)子方式的表達(dá)方面，隨著RT-PCR的檢測(cè)水平級(jí)別升高而升高，轉(zhuǎn)錄水平中的正常組以及高低水平組之間差異較大，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF mRNA）的表達(dá)方面，正常組以及高低水平組之間差異較大，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由此我們可以得知GDNF的作用與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的相關(guān)組織細(xì)胞有著密切的關(guān)系，能夠有效提高GDNF的表達(dá)方式[8-10]。

人體膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)制目前尚不完全清楚，然而隨著遺傳學(xué)以及生物學(xué)科等相關(guān)研究在不斷的進(jìn)步，使人體膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)制能夠更加清晰。目前的相關(guān)研究表明，人體膠質(zhì)瘤中也包括了細(xì)胞失控性增殖，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF mRNA）被認(rèn)為是人體正常細(xì)胞組織中的重要介質(zhì)。經(jīng)過陳睿等學(xué)者在IRES序列連接的人GDNF基因和EGFP基因逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定一文中的相關(guān)研究結(jié)果顯示，GDNF具有促使細(xì)胞分化的相關(guān)作用，以其形式體被有機(jī)合成[11-13]。對(duì)于人類而言，很多營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)因子參與了膠質(zhì)瘤的相關(guān)生物學(xué)作用。在GDNF的相關(guān)形成因子中，GDNF的基因位于第五號(hào)染色體Ⅰ區(qū)（p12～p13），能夠提高1個(gè)啟動(dòng)因子和4個(gè)外顯子。啟動(dòng)子Ⅱ中活性高于Ⅰ區(qū)，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的作用；另外，在人體膠質(zhì)瘤的相關(guān)細(xì)胞組織中，GDNF的表達(dá)方式上升得比較明顯，GDNF的作用與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的相關(guān)組織細(xì)胞有著密切的關(guān)系[14-20]。

綜上所述，GDNF基因啟動(dòng)子在人體膠質(zhì)瘤（human glioma）Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙?；╝cetylization）修飾情況很有可能會(huì)影響到GDNF基因的相關(guān)表達(dá)方式。

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（收稿日期：2015-10-10）