手性配體交換色譜的研究進展

王小平，沈芒芒，童勝強

(浙江工業(yè)大學　藥學院，浙江　杭州　310032)

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手性配體交換色譜的研究進展

王小平，沈芒芒，童勝強*

(浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州310032)

手性藥物不同對映體的藥效活性與藥理毒性往往具有一定的差異，因此單一光學活性手性藥物的研究對人類健康具有十分重要的意義，并且已廣泛引起了人們的重視[1]。目前手性藥物分離與分析的方法較多，而手性配體交換色譜法是手性藥物研究最有效的方法之一，特別是氨基酸與羥基酸的手性分離。手性配體交換色譜法，是將配體交換原理與具有高速、高效、高靈敏度色譜技術(shù)相結(jié)合的方法。現(xiàn)階段較為常見的主要有手性配體交換液相色譜、手性配體交換電泳等。目前，關(guān)于手性配體交換色譜的綜述性文章主要介紹了手性配體交換色譜的基本原理[2-3]，手性配體交換液相色譜[4]，手性配體交換毛細管電泳[5-7]等，該類文章展現(xiàn)了數(shù)十年來手性配體交換色譜的發(fā)展歷程。本文主要以各種手性試劑、配位體系進行分類，綜述了近年來手性配體交換液相色譜、手性配體交換電泳以及手性配體交換逆流色譜等領(lǐng)域的最新研究進展，包括手性配體交換色譜的原理、影響因素以及相關(guān)數(shù)據(jù)模擬機制，并對手性配體交換色譜的研究前景進行了展望。

手性配體交換通常基于手性配體、金屬離子與待測手性物質(zhì)之間形成非對映體的三元配合物，根據(jù)不同對映體形成的三元配合物之間空間位阻、熱力學穩(wěn)定性與動力學可逆性等差異導致的保留時間與保留體積的差異，達到分離的目的[8-9]。主要機理如下：

[CL]n M+ l-R→[CL]n-1Ml-R+CL(n>1)

(1)

[CL]n M+ d-R→[CL]n-1Md-R+CL(n>1)

(2)

其中，[CL]n表示配體，M為金屬原子，R為外消旋化合物，形成的三元配合物[CL]n-1Ml-R和[CL]n-1Md-R均為非對映體體系。

1手性配體交換液相色譜法

高效液相色譜(HPLC)是20世紀70年代快速發(fā)展起來的一種分離分析技術(shù)，具有高效、高靈敏度等優(yōu)點，是現(xiàn)階段物質(zhì)檢測與分析不可缺少的檢測方法之一。Davankov首次將配體交換的原理應(yīng)用于液相色譜技術(shù)中，并對α-氨基酸進行了手性分析[10]，隨后部分學者展開了相關(guān)研究[11-13]。目前手性配體交換液相色譜法主要有固定相涂漬法以及流動相添加法。

1.1固定相涂漬法

固定相涂漬法是將配體交換的原理運用于固定相中，對固定相進行一定的改性，利用不同手性類型的物質(zhì)與固定相形成的三元配合物的穩(wěn)定性差異，達到分離的目的，在物質(zhì)的手性分離上具有很好的應(yīng)用。對固定相的改性主要通過在固定相機體上引入手性化合物以及金屬離子等實現(xiàn)。

1.1.1手性配體涂漬法固定相涂漬最常用的手性配體主要有氨基酸、青霉胺等。經(jīng)改性后的固定相，與流動相中的金屬離子以及分析物之間形成三元配位體系，而形成的不同配合物因其穩(wěn)定性差異可達到分離。Song等[14]采用L-脯氨酸和L-羥脯氨酸對經(jīng)鏈端延長的巰丙基硅膠進行改性，合成了兩種手性配體色譜柱，對6種氨基酸對映體進行了分離；Su等[15]通過在Phenomenex chirex 3126手性色譜柱上鍵合D-青霉胺，使其與流動相中的Cu2+、肌肽對映體形成三元配合物，利用兩種配合物之間穩(wěn)定性的差異，實現(xiàn)了肌肽對映體的有效分離。

除了采用常規(guī)的氨基酸及其衍生物鍵合外，采用N-((R)-2-羥基-1-苯乙基)-N-十一碳氨基乙酸鹽及其類似物等鍵合的新型手性固定相也逐漸被用于多種手性物質(zhì)的分離。Gecse等[16]采用鍵合N-((R)-2-羥基-1-苯乙基)-N-十一碳氨基乙酸鈉的手性色譜柱，成功地對β-氨基酸進行了手性分離。而該鍵合手性固定相，除了可對氨基酸進行手性分離外，還可對質(zhì)子泵抑制劑進行手性分離，如奧美拉唑、泮托拉唑、蘭索拉唑以及雷貝拉唑等[17-18]。另外，鍵合了N-((S)-1-羥甲基-3-甲基丁基)-N-十一碳氨基乙酸鈉的手性固定相也可對質(zhì)子泵抑制劑進行手性分離[19]。

1.1.2金屬離子涂漬法液相色譜中最常用的固定相是硅烷鍵合硅膠，以往最為常用的改性固定相的金屬離子為Cu2+，近年來，Ti4+也常作為固定相的改性金屬離子進行應(yīng)用。Tan等[20]采用二氧化鈦填料色譜柱，對硫胺素進行了手性分離；Zhao等[21]采用經(jīng)鈦離子改性的色譜柱對大豆卵磷脂中的磷脂酰胺進行了測定。Wei等[22]采用二氧化鈦改性的固定相，利用配體交換與親水作用的原理對食物中的苯甲酸與香草醛進行了檢測。

1.1.3混合涂漬法混合涂漬法主要是指采用手性物質(zhì)與金屬離子形成的化合物對色譜柱固定相進行共同改性，該法對物質(zhì)的手性分離同樣具有很好的效果。Mayani等[23]采用經(jīng)氨基乙醇改性的固定性與醋酸銅反應(yīng)，形成新型的氨基乙醇-銅固定相，采用配體交換原理對扁桃酸等進行了手性分離。

1.2流動相添加法

(3)

圖1　手性配體交換流動相添加法HPLC的保留模型Fig.1　Retention model for HPLC with chiral ligand exchange mobile phaseAm,As：analytes in mobile and stationary phase(流動相與固定相中的被分析物);CuLm,CuLs：copper(Ⅱ)-L-amino acid complex in mobile and stationary phase(流動相和固定相中的Cu(Ⅱ)-L-氨基酸混合物)；KA,KCuL，KACuL：partition coefficient for A,CuL and ACuL(物質(zhì)A、CuL和 ACuL的吸附平衡常數(shù))；：chemical equilibrium constant in mobile and stationary phase(流動相和固定相中配體交換過程的化學平衡常數(shù))

采用添加手性配體流動相的方法，可對多種手性物質(zhì)進行分離。Keunchkarian等[25]采用金雞納堿與等摩爾的Cu2+為手性配體劑，對幾種α-氨基酸及其衍生物的外消旋體進行手性分離。氨基酸離子是目前使用最為普遍的手性添加劑。采用L-苯丙氨酸作為手性添加劑可對雌三醇與3,4-二甲氧基-α-甲基苯甲酸進行手性分離[26]。Bi等[27]采用L-亮氨酸與Cu2+作為添加劑加入到流動相中，對氧氟沙星制劑藥物中的氧氟沙星對映體進行了手性分離，同時對離子溶液的手性與非手性進行了探討，指出手性離子溶液的分離效果更加明顯。Zhou等[28]采用異亮氨酸作為手性添加劑，對扁桃體酸進行了手性分離。筆者所在課題組則對常規(guī)的氨基酸進行了結(jié)構(gòu)改造，將合成的N-二甲基苯丙氨酸作為手性添加劑，對扁桃酸進行了手性分離[24]。

Jeong等[29]采用配體交換液相色譜技術(shù)對糖尿病進行了診斷，通過測定試驗者干血清中L-別異亮氨酸與L-苯丙氨酸的比例對其進行判斷。

1.3手性配體交換液相色譜法的影響因素

手性配體交換液相色譜技術(shù)對手性物質(zhì)的分離與諸多因素有關(guān)，如溫度、金屬離子類型及濃度、色譜柱類型、流動相pH值等。不同金屬離子與手性物質(zhì)形成的配合物不同，配合物的穩(wěn)定性存在一定差異，因此，實驗中對金屬離子種類與濃度的考察至關(guān)重要。目前，最為常用的金屬離子是絡(luò)合穩(wěn)定性較好的Cu2+。此外，有研究者提出，金屬離子的成鹽形式對物質(zhì)的手性分離同樣具有影響。Natalini等[30]使用不同的銅鹽形成的配體交換體系，對多種氨基酸的分離因子進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用不同的銅鹽，氨基酸的分離因子大致趨勢為：硝酸鹽>甲酸鹽>溴化鹽>硫酸鹽>三氟化鹽>氯化鹽>高氯酸鹽>醋酸鹽。發(fā)生上述情況的具體原因尚不明確，但有研究者認為可能與體系的表面靜電平衡(ESPbal)有關(guān)[31]。另外，對于不同分析物質(zhì)，選擇合適的色譜柱至關(guān)重要。Alizadeh等[32]使用配體交換液相色譜法對阿替洛爾進行手性分離時，發(fā)現(xiàn)使用C8柱比C18柱具有更好的分離效果。流動相pH值對手性分離的影響較大，通常堿性條件下絡(luò)合物的形成較為容易，但pH值過大時則會對色譜峰的峰形產(chǎn)生影響。

2手性配體交換電泳法

2.1手性配體交換電泳法的應(yīng)用

手性配體交換電泳法結(jié)合了配體交換技術(shù)與電泳技術(shù)的優(yōu)點，具有分離模式多、樣品消耗少、操作簡便等優(yōu)點，是近年來手性分離中較為常用的方法。目前，最常用的手性配體為氨基酸類，一些新型的手性配體試劑也逐漸被合成[33]。而金屬離子主要有Cu2+，Zn2+，Al3+，Co2+，Cd2+等。按照金屬離子的不同，表1分別列出了手性配體交換電泳近幾年的配體交換體系以及被分離物質(zhì)。

2.2手性配體交換電泳法的影響因素

電壓是電泳的重要參數(shù)，分析時間隨著電壓的增高而縮短，而分離度則先增加后減小。緩沖溶液的pH值對溶液的離子化程度具有直觀影響，因而對分離度的影響也尤其重要。pH值的增高有利于金屬離子與配體形成的物質(zhì)更加穩(wěn)定，但pH值過高則會造成配合物過于穩(wěn)定，使得其與被分析物之間難以交換，從而導致分離度下降。金屬離子的種類與濃度也是影響手性配體交換電泳法的重要因素，不同的手性物質(zhì)配位的金屬離子不同。Liu等[34]分別采用Cu2+，Zn2+，Mg2+和Ni2+與四甲基銨L-羥脯氨酸作為手性添加劑，對色氨酸與3,4-二羥基苯丙氨酸進行了手性拆分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有Cu2+起到了很好的分離作用。同時，其還對Cu2+濃度進行了考察，發(fā)現(xiàn)Cu2+濃度過高或過低均會降低分離度，實驗過程中應(yīng)篩選合適的Cu2+濃度，以達到較好的分離效果。Aizawa等[45]研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子與手性配體以及待測物之間不同的濃度比對物質(zhì)的手性分離亦具有一定影響。離子溶液的種類與烷基鏈的長度對手性分離同樣具有一定的影響。Zhang等[46]采用Zn2+與L-精氨酸作為配位體系，使用幾種不同結(jié)構(gòu)的離子溶液對丹酰氨基酸的手性分離進行考察，發(fā)現(xiàn)適宜結(jié)構(gòu)的離子溶液對手性分離的影響很大，為科研工作者的進一步研究提供了有效的參考。

表1　手性配體交換電泳法中的各種配位體系與分離物質(zhì)

3手性配體交換逆流色譜

逆流色譜屬于液液分配色譜，與液相色譜相比其突出優(yōu)勢在于固定相不使用固體載體，樣品回收率為100%。現(xiàn)代逆流色譜儀器簡單易維護、運行成本低，且屬于制備色譜技術(shù)范疇，在手性分離領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。目前，關(guān)于手性配體交換逆流色譜的相關(guān)報道較少。Takeuchi等[47]首先將手性配體交換原理與液液色譜原理相結(jié)合，采用逆流色譜技術(shù)，以Cu2+作為金屬離子，N-n-十二烷基-L-脯氨酸為手性配體試劑，對異亮氨酸進行了手性分離。隨后，Takeuchi等[48]又采用該技術(shù)對纈氨酸進行了手性分離。筆者所在課題組研究了手性配體交換逆流色譜技術(shù)的原理與應(yīng)用[49]，制備拆分了5種扁桃酸系列外消旋體。研究中發(fā)現(xiàn)采用同樣的手性配體與金屬離子作為中心離子，液相色譜無法拆分的某些外消旋體，采用手性配體交換高速逆流色譜技術(shù)可以獲得良好的拆分。

4結(jié)論與展望

將手性配體交換技術(shù)與色譜技術(shù)聯(lián)用，結(jié)合了配體化學與色譜分離兩個領(lǐng)域的特征，該方法無需衍生化，分析檢測方便快捷，顯著提高了對映體物質(zhì)的分離效率，對手性藥物的研究具有十分重要的意義。本文介紹的3種手性配體交換色譜中，目前研究較為普遍的是手性配體交換液相色譜與手性配體交換電泳，而關(guān)于手性配體交換逆流色譜的報道較少，仍具有廣泛的研究空間。

現(xiàn)階段關(guān)于手性配體交換色譜的研究主要有兩個方向：首先，手性配體試劑是手性配體交換色譜法的關(guān)鍵因素，更加高效且通用的手性配體試劑是手性配體交換色譜最重要的研究方向。目前最為常用的手性配體試劑主要為一些氨基酸、羥基酸及其衍生物等，且分離的手性物質(zhì)也較為狹隘。而其他手性試劑的不斷嘗試，必將拓寬手性配體交換色譜的分離空間。其次，手性配體、金屬離子與對映體之間形成三元絡(luò)合物的穩(wěn)定性受多種因素的綜合影響，如空間位阻、熱力學穩(wěn)定性以及動力學可逆性等，尋求眾多因素之間的平衡點會使手性分離更加高效快速，現(xiàn)階段各種模擬保留機制軟件的利用則會使未來的手性配體機制更加清晰。

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摘要：手性配體交換色譜技術(shù)將配體交換原理與色譜技術(shù)相結(jié)合，拓寬了液相色譜、電泳以及逆流色譜的應(yīng)用層面，為部分難分離手性物質(zhì)提供了有效的分離與檢測方法。該文參考了近年來國內(nèi)外的相關(guān)文獻，綜述了手性配體交換技術(shù)在液相色譜、電泳與逆流色譜等領(lǐng)域中的應(yīng)用進展；總結(jié)了手性配體交換色譜技術(shù)的基本原理、影響因素、優(yōu)缺點等，并對手性配體交換色譜技術(shù)的趨勢進行了展望。

關(guān)鍵詞：配體交換；液相色譜；電泳；逆流色譜；研究進展;綜述

Study Progress of Chiral Ligand Exchange ChromatographyWANG Xiao-ping,SHEN Mang-mang,TONG Sheng-qiang*

(College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou310032,China)

Abstract：Chiral ligand exchange chromatography is a kind of technique which combines ligand exchange principle with chromatography.The development of chiral ligand exchange strategy has extended the applications of high performance liquid chromatography,electrophoresis and high speed counter current chromatography.This method provides an effective way for the enantioseparation of racemates which are difficult to be enantioseparated by other methods.Applications of chiral ligand exchange in liquid chromatography,electrophoresis and high speed counter current chromatography are summarized.The basic principle，effecting factors,advantages and disadvantages of chiral ligand exchange chromatography are systematically reviewed.Finally,the development trends of chiral ligand exchange chromatography are proposed.

Key words：chiral ligand exchange;liquid chromatography;electrophoresis;high speed counter current chromatography;research progress;review

中圖分類號：O657.7;G353.11

文獻標識碼：A

文章編號：1004-4957(2015)12-1446-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.021

通訊作者：*童勝強，博士，副教授，研究方向：色譜技術(shù)在手性拆分上的應(yīng)用，Tel：0571-88320613，E-mail：sqtong@zjut.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(21105090)；浙江省高等學校中青年學科帶頭人攀登項目(pd2013031)

收稿日期：2015-04-14；修回日期：2015-05-18