肝纖維化的血清標志物篩查

邢文斌 劉威 朱承美

肝纖維化的血清標志物篩查

邢文斌 劉威 朱承美

目的探討與發(fā)現(xiàn)肝纖維化的血清標志物。方法采用高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜(UPLC/LTQ-Orbitrap MS)技術(shù)來分離并提取慢性乙型肝炎(14例)、代償期肝硬化(20例)、失代償期肝硬化(15例)患者及健康志愿者(20例)血清中的代謝產(chǎn)物。結(jié)果健康對照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化代償期組、肝硬化失代償期組代謝產(chǎn)物分布存在很大的差異,其中差異最大的代謝產(chǎn)物為羧乙基精氨酸、 輔酶Q1和甘氨脫氧膽酸,并隨著肝纖維化程度的加重而增加。結(jié)論羧乙基精氨酸、輔酶Q1及甘氨脫氧膽酸三種代謝產(chǎn)物可以作為肝纖維化的血清標志物。

肝纖維化；血清標志物

長期的慢性乙型肝炎病毒感染可以導(dǎo)致肝臟不同程度的肝纖維化甚至肝硬化,但肝纖維化的進展十分隱匿,很多臨床診斷為慢性乙型肝炎的患者其肝活檢組織學(xué)已為肝硬化,甚至許多慢性乙型肝炎病毒感染者一旦確診即為肝硬化,早期發(fā)現(xiàn)和診斷肝硬化對改善患者預(yù)后十分必要。本實驗采用高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜(UPLC/LTQOrbitrap MS)技術(shù)來分離并提取慢性乙型肝炎、代償期肝硬化以及失代償期肝硬化患者血清中的代謝產(chǎn)物,以期發(fā)現(xiàn)肝纖維化的代謝產(chǎn)物標志物群。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2011年10月～2013年9月于煙臺市傳染病醫(yī)院就診的慢性乙型肝炎患者34例,所有患者均接受了肝穿刺病理檢查,隨機選取于大連市第六人民醫(yī)院住院治療的失代償期肝硬化患者15例。同期選擇20例健康志愿者作為健康對照組,肝功正常、病原學(xué)檢查陰性。所有入組人員在知情同意的前提下,留取空腹血4ml,30min內(nèi)將血清分離,留取血清,-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)錂z。

1.2 方法 高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜(UPLC/LTQ-Orbitrap MS)技術(shù)檢測所有受檢者血清中的代謝產(chǎn)物。

1.2.1 樣品準備 室溫下靜置解凍血清,取100 μl血清加400 μl甲醇除蛋白,渦旋60 s,13000 rpm離心15min,取上清液400 μl置冷凍濃縮儀凍干。

1.2.2 超高效液相色譜分析 采用超高效液相色譜分析儀。沖洗柱采用10.0cm×2.1 mm×1.7 μm C18柱根據(jù)梯度不同而改變的乙腈溶液沖洗,根據(jù)物質(zhì)在柱內(nèi)停留時間的長短,完成各種代謝產(chǎn)物的分離。

1.2.3 高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜(UPLC/ LTQ-Orbitrap MS) 通過采用LTQ-Orbitrap質(zhì)譜分析儀,對已經(jīng)分離的代謝產(chǎn)物實行ESI+模式操作。

1.3 確定代謝產(chǎn)物名稱 根據(jù)精確分子量來分析、研究確定代謝產(chǎn)物名稱。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。通過Micromass Marker Lynx獲取每峰停留時間(tr)和m/z數(shù)據(jù)對,標準化輸出每峰離子密度后,進行主成分分析(PCA)；根據(jù)非參數(shù)檢驗結(jié)果,尋找差異比較大的代謝產(chǎn)物。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 本實驗對臨床診斷為慢性乙型肝炎的34例患者進行了超聲引導(dǎo)下肝臟穿刺術(shù)的組織病理學(xué)診斷結(jié)果發(fā)現(xiàn),S1期8例,S2期5例,S3期1例,S4期20例。其中慢性乙型肝炎(即組織學(xué)分期為S1～S3期)有14例,代償期肝硬化有20例(即組織學(xué)分期為S4期)。

2.2 在SIMCA-P軟件中采用自動匹配的方法處理質(zhì)譜原始數(shù)據(jù),建立了PCA模型(見圖1)。從模型圖中可以看出,健康對照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化代償期組、肝硬化失代償期組代謝產(chǎn)物分布存在很大的差異,質(zhì)量控制組(QC)聚合均良好,說明實驗較為穩(wěn)定。

2.3 在PCA的基礎(chǔ)上進行空間坐標軸旋轉(zhuǎn),以消除組內(nèi)變異對組間分類的負面影響,使組間的差異最大化,建立PLSDA模型(見圖2)。圖中顯示健康對照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化代償期組、肝硬化失代償期組有較為明顯的分開趨勢。

2.4 潛在標記物的篩選,對49個患者樣本和20個健康志愿者樣本做非參數(shù)檢驗,得到483個特征離子碎片,定性出40個差異物質(zhì)。RSD<20%。對患者組和健康組得到的40個特征離子做ROC曲線。擬合較好,得到三種代謝物：羧乙基精氨酸(octopine)、 輔酶Q1(coenzyme Q1)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)。

3 討論

長期的慢性乙型肝炎病毒感染可以導(dǎo)致肝臟不同程度的肝纖維化甚至肝硬化,實驗中對34例慢性乙型肝炎患者進行肝組織活檢,結(jié)果發(fā)現(xiàn),S1～S3期14例,S4期20例。即慢性乙型肝炎(即組織學(xué)分期為S1～S3期)有14例；代償期肝硬化有20例(即組織學(xué)分期為S4期),占59%,這與在選擇肝穿患者時更傾向于早期肝硬化的患者有關(guān)。如此可見,臨床診斷為慢性乙型肝炎的患者中確實部分存在組織學(xué)已達到肝硬化(組織學(xué)分期為S4期)診斷的患者,探索和發(fā)現(xiàn)肝纖維化的血清標志物是十分必要的。

本實驗采用高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜(UPLC/LTQ-Orbitrap MS)技術(shù)對慢性乙型肝炎、代償期肝硬化、失代償期肝硬化三組患者的血清中的代謝物進行檢測,建立了PCA和PLS-DA模型,結(jié)果找到三種代謝產(chǎn)物,分別是：羧乙基精氨酸、 輔酶Q1、甘氨脫氧膽酸。

精氨酸刺激溶解性鳥苷酸環(huán)化酶,降低鈣離子濃度,促進NO以自泌的方式調(diào)節(jié)肝內(nèi)阻力,使血管舒張,肝臟星形細胞(HSC)松弛,促使肝竇內(nèi)皮細胞會降低NO的釋放,使血管緊張劑與血管舒張劑失衡,導(dǎo)致肝纖維化的形成。輔酶Q是一種脂溶性醌類化合物,能在線粒體膜中迅速擴散,極易從線粒體膜中分離出來。甘氨脫氧膽酸鹽(GCDC)屬于疏水性膽汁酸,國內(nèi)外大量的研究表明,疏水性膽汁酸如甘氨脫氧膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸等對原代培養(yǎng)的大鼠肝細胞有明顯的凋亡作用［1-3］。膽汁酸通過死亡受體通路和線粒體通路介導(dǎo)可直接激活促進肝細胞調(diào)亡的Fas受體及Bax,可使線粒體膜通透性增加,細胞腫脹、溶酶體破壞,釋放蛋白酶、細胞因子等有毒物質(zhì)激發(fā)炎癥反應(yīng),對機體造成損壞,具有較大的細胞毒作用。GCDC可通過影響HL-7702細胞跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)鈣離子,導(dǎo)致鈣超載和鈣穩(wěn)態(tài)破壞,鈣離子濃度增加可以刺激PI3K/Akt,Rho激酶,核因子κ B(NF-κB)與MAPK通路,有促進纖維化的作用。甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)和甘氨膽酸(GCA)是共軛膽汁酸。高水平GCDCA和GCA出現(xiàn)在患者血清中表明患者發(fā)生嚴重的肝損傷。

羧乙基精氨酸、 輔酶Q1及甘氨脫氧膽酸三種代謝產(chǎn)物隨著肝纖維化程度的加重,呈明顯上升趨勢,說明與肝纖維化密切相關(guān),可以作為肝纖維化的血清標志物,但三種代謝產(chǎn)物在體內(nèi)濃度水平?jīng)Q定肝纖維化程度,有待于進一步研究。

［1］Ramm GA,Shepherd RW,Hoskins AC,et al.Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate andhepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cellrecruitment.Hepatology,2009,49(2):533-544.

［2］Higuchi H,Miyoshi H,Bronk SF,et al.Bid antisense attenuates bile acid-induced apoptosis and cholestatic liver injury.J Pharmacol Exp Ther,2001,299(3):866-873.

［3］Takikawa Y,Miyoshi H,Rust C,et al.The bile acid-activated phosphatidylinositol 3-kinase pathway inhibits Fas apoptosisupstream of bid in rodent hepatocytes.Gastroenterology,2001,120(7):1810-1817.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.23.038

2016-11-04］

116031 大連市第六人民醫(yī)院(邢文斌 劉威)；煙臺市傳染病醫(yī)院(朱承美)