珍稀藥用植物三葉青種質(zhì)資源研究現(xiàn)狀△

彭昕，吉慶勇，梁雅清，張煜炯，樓天靈

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100；2.麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000)

珍稀藥用植物三葉青種質(zhì)資源研究現(xiàn)狀△

彭昕1*，吉慶勇2，梁雅清1，張煜炯1，樓天靈1

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100；2.麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000)

三葉青是珍稀中藥材，臨床應(yīng)用廣泛，其野生資源瀕危，人工栽培難度大，品種選育落后，導(dǎo)致生產(chǎn)中種質(zhì)退化，品系混雜，嚴(yán)重影響了臨床用藥的安全穩(wěn)定。本文綜述了近年來三葉青種質(zhì)資源分類、繁育、保存、鑒定及評價等方面取得的研究進(jìn)展，分析了目前其種質(zhì)資源研究與利用中存在的問題，以期為三葉青產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供參考。

三葉青；人工繁育；種質(zhì)鑒定；資源評價

三葉青Tetrastigmahemsleyanum是我國浙江、江西等南方部分地區(qū)的珍稀藥用植物品種。中文學(xué)名為三葉崖爬藤，又名金線吊葫蘆，為葡萄科崖爬藤屬植物，以地下塊根或全草入藥。是抗腫瘤常用藥物，也具有抗炎、解熱、護(hù)肝等作用[1-3]，是多種中成藥(如華佗風(fēng)痛寶膠囊、排石利膽膠囊、結(jié)石康膠囊、金絲地甲膠囊、金芪片等)的主要藥味，也被開發(fā)成保健品。藥理研究顯示總黃酮、總氨基酸和多糖為其主要活性物質(zhì)[3-5]。目前三葉青野生資源瀕臨滅絕，人工栽培難度大，其藥用部位地下塊根生長慢，需要3～5年才能達(dá)到商品藥材的要求。2011年三葉青被列入“浙江省首批農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)名錄”。不同產(chǎn)區(qū)、不同種質(zhì)三葉青的外觀性狀(大葉/小葉，紫藤/青藤)、地下塊根產(chǎn)量以及有效成份含量存在明顯差異。由于資源稀缺而需求量大，偽混品眾多，近年來杭州等地先后出現(xiàn)多起患者服用混入烏頭子根的含三葉青飲片中藥中毒事件。另一方面，三葉青種子產(chǎn)量少或無，且是多年生植物，有性繁殖慢，農(nóng)家生產(chǎn)歷來采用扦插等無性繁殖，只種不選，自繁自用的狀況加重了性狀退化，嚴(yán)重影響了臨床療效，因此資源保護(hù)開發(fā)與評價、品種選育是三葉青生產(chǎn)及應(yīng)用上亟待解決的重要課題。筆者結(jié)合本課題組近年來的相關(guān)研究成果就三葉青種質(zhì)資源分類、繁育、保存、鑒定及評價等方面取得的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)和分析，以期為三葉青資源的進(jìn)一步研究及開發(fā)利用提供參考。

1 種質(zhì)資源研究現(xiàn)狀

1.1 種質(zhì)類型和產(chǎn)地分布

三葉青種質(zhì)類型主要從葉片大小和形狀、表面革質(zhì)程度，葉邊鋸齒、藤顏色和形狀上區(qū)分，一般大致分為紫藤和青藤兩種[6]：青藤三葉青老藤的表面青白色，藤本較粗壯，葉片較大，塊根個體較大，主要分布于我國湖南、福建、廣西、云南的部分地區(qū)。紫藤三葉青新藤為綠色，一般2～3年后植株下部老藤逐漸變成紫色或褐色。藤本較細(xì)小，有棱角，葉片較小，塊根多呈葫蘆狀，主要分布于浙江、江西等地。相比之下，青藤三葉青分布地域較廣，生長旺盛，產(chǎn)量較高，數(shù)量較多。但一般認(rèn)為青藤三葉青塊根性寒，藥用功效不及紫藤三葉青。

1.2 人工繁育技術(shù)

1.2.1 組培快繁 鐘毓倩等[14]以三葉青莖尖、葉片及帶腋芽的莖段為外植體，認(rèn)為其誘導(dǎo)愈傷最佳的外植體為莖尖，并篩選出適合不定芽繼代增殖的培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基類型。錢麗華[15]通過篩選比較愈傷誘導(dǎo)、增殖以及不定根誘導(dǎo)的主要影響因子，初步摸索了三葉青不定根擴(kuò)繁的激素條件，為今后通過三葉青不定根培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)其藥用活性成分奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。史清英[16]對三葉青莖段外植體組織培養(yǎng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，并發(fā)現(xiàn)在其組培苗根部定殖印度梨形孢，可明顯促進(jìn)組培苗的生長發(fā)育，其株高和干鮮重都顯著高于未接種的三葉青幼苗。杜蘇瑞[17]利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染三葉青實(shí)生苗或組培苗的葉片，成功誘導(dǎo)出轉(zhuǎn)基因毛狀根，為利用三葉青毛狀根作為生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)三葉青次生代謝物提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

本課題組在三葉青組培快繁[7-8]、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)[9-10]及次級代謝調(diào)控[11-12]方面研究確定了促進(jìn)愈傷組織生長、最利于黃酮積累的最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，確定了通過腋芽增殖的三葉青快繁育苗技術(shù)[7-8]；比較了兩種三葉青細(xì)胞懸浮體系中細(xì)胞增殖和總黃酮積累的動態(tài)，構(gòu)建了增殖系數(shù)大，繼代后性能穩(wěn)定，總黃酮含量高于原植株的三葉青懸浮細(xì)胞系[9，12]。研究了稀土元素對三葉青懸浮細(xì)胞代謝相關(guān)酶活性及同工酶表達(dá)的影響，結(jié)果顯示100 μM Ce3+和 Nd3+最有利于其生物量及黃酮的積累，50～200 μM稀土離子對CAT，POD，PAL，EST等酶表達(dá)情況有顯著影響；稀土離子誘導(dǎo)生物量及黃酮積累的機(jī)理與其激發(fā)初生及次生代謝途徑中關(guān)鍵酶的合成，誘發(fā)脅迫防御反應(yīng)，提高細(xì)胞代謝水平有關(guān)[10]。通過對稀土離子的誘導(dǎo)效應(yīng)和Ca2+信號通路的關(guān)系進(jìn)行研究顯示，在培養(yǎng)基中加入金屬誘導(dǎo)子與降低鈣離子濃度或增加鈣離子阻斷劑相結(jié)合的方式，能促進(jìn)三葉青懸浮細(xì)胞增殖及提高其黃酮產(chǎn)量[11]。通過對繼代多次的三葉青愈傷組織的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，研究表明繼代4次以內(nèi)的愈傷組織遺傳穩(wěn)定，但繼代次數(shù)增加，增加了DNA點(diǎn)突變和種性退化的機(jī)率，提出為避免保存的原始種質(zhì)基因丟失，盡可能采用試管苗方式繼代保存[13]的建議。

1.2.2 人工栽培 浦錦寶等[20]利用500 mg·L-1的生根粉溶液浸泡插穗的下切口，實(shí)現(xiàn)了人工繁育三葉青的目的。程良綏[21]從選地與整地、幼苗繁育、林下種植、林地管理、病蟲害防治、塊根采收等方面總結(jié)三葉青林下栽培技術(shù)。Dai[22]對在自然光照和不同程度遮蔭處理條件下栽培30天的三葉青光合能力，葉綠素?zé)晒庑院腿~綠素含量進(jìn)行了比較研究，實(shí)驗結(jié)果顯示 67%的遮陰處理時三葉青苗葉子最大，且光合作用最強(qiáng)，為栽培三葉青提供了最佳光照條件的參考依據(jù)。

本課題組研究了生根劑、插穗年齡和基質(zhì)對三葉青插穗生根的影響，顯示2～3 年生老枝于1000 mg·L-1IBA 浸漬 10s 后扦插于黃土中生根效果最佳[18]。并收集11 個浙江、江西、湖南等產(chǎn)地三葉青種質(zhì)資源，進(jìn)行扦插試驗，比較其農(nóng)藝性狀與生長特點(diǎn)，結(jié)果表明，不同種源三葉青插穗生長速度、新梢長、莖粗及葉長、葉寬均存在極顯著差異 (P<0.01)[19]。本課題組負(fù)責(zé)的“珍稀藥用植物三葉青資源收集及人工種植技術(shù)研究”、“三葉青經(jīng)濟(jì)林下套種關(guān)鍵栽培技術(shù)”分別于2013、2014年通過了浙江省科技成果鑒定。

1.3 種質(zhì)鑒定

1.3.1 外部形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)或理化鑒別方法 由于三葉青野生資源瀕臨滅絕，藥材市場上偽混品盛行，嚴(yán)重影響了其臨床用藥的安全性和有效性。李水福[23]從原植物形態(tài)、藥材性狀和顯微鑒別三方面總結(jié)了三葉青與其常見偽品土圞兒的區(qū)別特征。殷紅妹[24]通過性狀觀察、理化鑒別和高效液相色譜法成功鑒別了三葉青及其偽混品烏頭。黃真[25]從藥材外部性狀、顯微特征及一般理化鑒別等方面對浙江及廣西產(chǎn)地的三葉青進(jìn)行生藥學(xué)鑒別，為三葉青藥材品種鑒別提供了實(shí)驗依據(jù)。

然而傳統(tǒng)中藥材外部形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)或理化鑒別方法由于產(chǎn)地粗加工和飲片炮制導(dǎo)致外部性狀、顯微特征破壞，且同一藥材的化學(xué)成分含量受生長周期、貯存條件、炮制方法和生長環(huán)境等多方面的影響會有明顯變化，因此傳統(tǒng)鑒別方法均存在一定局限性。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒別方法 近年出現(xiàn)的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)不受供試部位、生長發(fā)育階段以及環(huán)境條件的影響，直接利用DNA序列進(jìn)行物種的鑒定，具有獨(dú)一無二的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，實(shí)驗過程標(biāo)準(zhǔn)化，操作簡單快速。王一涵[26]通過選擇具有多態(tài)性的 ISSR 通用引物擴(kuò)增三葉青及其近緣種和市場上常見偽品土圞兒后產(chǎn)生的三葉青特異性條帶，設(shè)計了特異性擴(kuò)增該片段的特異性三葉青 SCAR 分子探針引物，在12個不同種源的三葉青中均能產(chǎn)生陽性擴(kuò)增，而與三葉青偽品土圞兒和16個近緣物種的 DNA 均不反應(yīng)。符淵淼[27]對多段DNA條形碼在三葉青及其它崖爬藤屬植物鑒別中的應(yīng)用基礎(chǔ)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)rbcL+matK+ITS是鑒定三葉青和其它崖爬藤屬植物的最佳條形碼，通過對待測樣品該DNA條形碼區(qū)測序后，計算遺傳距離聚類鑒別。

本課題組在前期以ITS2序列為基因標(biāo)記探討三葉青與其近緣物種親緣關(guān)系及其多種偽混品ITS2區(qū)測序的研究基礎(chǔ)上，建立了一種快速、可靠鑒別三葉青的PCR-RFLP方法[28]，可直觀判斷藥材三葉青的真?zhèn)渭笆欠駬饺肓藗位炱?。與前述方法相比能有效縮短三葉青的鑒定時間；結(jié)果為共顯性，可以區(qū)別出正品三葉青、非三葉青以及摻入了偽品的三葉青；且該方法擴(kuò)增的ITS2片斷僅為400～500 bp，因此受模板質(zhì)量及PCR擴(kuò)增條件的影響較小，不易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，大大提高了鑒定的準(zhǔn)確性。

以上三葉青種質(zhì)鑒別的分子生物學(xué)方法克服了感官或理化分析等方法難以鑒別三葉青真?zhèn)蔚募夹g(shù)問題，保障了三葉青藥材用藥安全，具有重要的實(shí)用價值。

1.4 種質(zhì)資源類型的評價

1.4.1 不同種質(zhì)資源類型的農(nóng)藝性狀及經(jīng)濟(jì)性狀評價 對三葉青藥用原植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行評價和群體遺傳學(xué)的研究，對制定其種質(zhì)資源保護(hù)利用的策略以及指導(dǎo)其遺傳育種工作顯得尤為重要。蹇京蓉[6]通過標(biāo)本查閱、野外考察和其它相關(guān)數(shù)據(jù)分析，確定了野生三葉青產(chǎn)地主要包括了13個省區(qū)，選取了生長速度、栽培難度、繁殖難度、抗病蟲害、抗逆性、多糖含量、總黃酮含量等指標(biāo)構(gòu)建評價體系，對不同產(chǎn)區(qū)三葉青藥用原植物種質(zhì)資源現(xiàn)狀進(jìn)行了全面評價。結(jié)果表明：來自浙江地區(qū)的種質(zhì)資源具有顯著的優(yōu)越性，其次是來自江蘇和江西的，而湖北的種質(zhì)資源綜合評價得分最低。然而，一些綜合評估中等甚至較低的種質(zhì)，如：西藏、重慶的種質(zhì)資源在某些指標(biāo)，如抗寒性、耐高溫性、抗旱性等方面具有極高的優(yōu)勢。該種質(zhì)資源評價分析結(jié)果對于今后的遺傳育種工作將具有重要的指導(dǎo)意義。金月山[29]調(diào)研了野生三葉青資源的自然分布現(xiàn)狀，收集了福建、湖南、廣西3地三葉青種質(zhì)，通過性狀特征對比和塊根成分檢測，認(rèn)為廣西三葉青藥用效果相對較低，呼吁規(guī)范三葉青藥材市場，合理利用三葉青資源。本課題組測定了人工種植和野生三葉青中總黃酮含量，結(jié)果顯示浙江麗水人工種植三葉青品質(zhì)優(yōu)良適于推廣種植[30]。鄭軍獻(xiàn)等[31]測定了浙江和廣西產(chǎn)地10份三葉青樣品中總黃酮的含量，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地藥材黃酮含量差異最大可達(dá)7倍。許文等[32]采用UPLC-MS/MS 定量分析測定30 批不同產(chǎn)地三葉青中 10 種黃酮類成分結(jié)果表明，各類成分含量差異懸殊，甚至有些批次中未檢測出。因此，不同產(chǎn)區(qū)、不同品種的三葉青有效成分含量及藥理活性均差異懸殊，多項研究表明浙江產(chǎn)區(qū)三葉青提取物在解熱[2]、抑制肝癌細(xì)胞增殖[33]的活性等方面都占有明顯的優(yōu)勢。

1.4.2 種質(zhì)資源的遺傳多樣性評價 袁帶秀[34-35]研究發(fā)現(xiàn)不同種源地的三葉青酯酶、POD同工酶存在表達(dá)差異。本課題組分別對三葉青ISSR[36]、SRAP[37]反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化，建立了穩(wěn)定可靠、多態(tài)性好、可用于三葉青遺傳多樣性分析的遺傳分子標(biāo)記體系，并將其應(yīng)用于三葉青野生及人工栽培居群27份種質(zhì)資源的遺傳變異水平和結(jié)構(gòu)分析的研究[38]，結(jié)果表明三葉青種質(zhì)遺傳變異主要存在于地理居群間，群體間基因流低，野生居群遺傳多樣性顯著高于人工栽培群體，遺傳相似性與地理距離有一定的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上初步分析了三葉青野生資源瀕危的原因主要是低水平基因流、地理屏障、無性繁殖及資源過度開發(fā)，提出了保護(hù)其種質(zhì)資源的策略。

王一涵[39]采用petL-psbE和trnK-matK基因間隔區(qū)對 21 個三葉青群體共 223個個體進(jìn)行了群體遺傳學(xué)研究，結(jié)果顯示三葉青野生群體可劃分為西部、中部和東部三個地理居群，其遺傳變異主要存在于群體間，基因流極低。Wang[40]采用雙抑制PCR法從來自于重慶和福建產(chǎn)區(qū)的少量三葉青樣品中探索性地發(fā)掘了14個SSR位點(diǎn)，為開發(fā)三葉青特異性狀的遺傳標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)分子輔助遺傳育種奠定了基礎(chǔ)。

1.5 種質(zhì)資源保存

現(xiàn)有的常規(guī)植物離體快繁及保存技術(shù)需要頻繁繼代、工作量大、成本高，易導(dǎo)致材料的污染、混淆，且隨著繼代次數(shù)的增加，遺傳變異率提高，從而使保存的原始種質(zhì)基因丟失，出現(xiàn)代謝物含量變化、植株再生能力下降等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響試管苗的質(zhì)量和利用價值。

本課題組建立了一種穩(wěn)定高效的三葉青種質(zhì)資源離體保存及保存后恢復(fù)生長的方法[41-42]。通過適宜的培養(yǎng)條件和合理的抑制劑、破眠劑使用，建立三葉青試管苗的限制生長保存以及保存后復(fù)蘇培養(yǎng)技術(shù)體系，使其試管苗保存10個月期間不需繼代，植株生長正常，存活率為100%，大大延長繼代培養(yǎng)時間，且保存材料的后代經(jīng)DNA和蛋白質(zhì)分子標(biāo)記技術(shù)檢測均未發(fā)生遺傳變異。因此該方法可防止常規(guī)的傳代保存法由于多次傳代后造成的種性退化及病毒感染，保證種質(zhì)的優(yōu)良性和純潔性。

2 三葉青種質(zhì)資源與利用研究展望

三葉青種質(zhì)資源作為維持其產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的源頭，深入地開展種質(zhì)收集、鑒定和評價研究是提升三葉青良種化水平、種質(zhì)創(chuàng)新與利用的關(guān)鍵，但目前多數(shù)研究尚停留在形態(tài)學(xué)觀察、粗成份測定和簡單的分子標(biāo)記聚類上，為充分開發(fā)利用和合理保護(hù)三葉青種質(zhì)資源，今后的研究工作可在以下方面深入開展：

2.1 建立完善、系統(tǒng)的三葉青種質(zhì)鑒定、質(zhì)量評價體系

三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性研究目前已有形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子水平，盡管各種研究方法均在一定程度上體現(xiàn)出其遺傳資源的豐富程度，然而這些研究的聚類結(jié)果之間缺乏有機(jī)的統(tǒng)一，甚至個別研究結(jié)果間差異較大，這可能是因為各地引種的種質(zhì)類型本身的差異，或是由于不同生境引起的遺傳突變。目前，三葉青種質(zhì)的品質(zhì)評價一般根據(jù)農(nóng)藝性狀(如：塊根產(chǎn)量)和部分成分(如總黃酮)的含量來確定，缺乏對其功能性指標(biāo)成分或分子指紋等方面的準(zhǔn)確鑒定。不同產(chǎn)地不同種質(zhì)三葉青藥材的模式識別及系統(tǒng)評價尚未見報道。因此，構(gòu)建一個完善、系統(tǒng)的從遺傳基礎(chǔ)到藥效基礎(chǔ)，從基因型到表現(xiàn)型，從定性到定量的三葉青基原種質(zhì)的科學(xué)評價體系的工作亟待開展。

2.2 開展特異遺傳性狀的分子水平深度評價，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)分子輔助遺傳育種

本課題組目前雖然已有較成熟的三葉青栽培示范苗圃，但在近年來的栽培繁育過程中，也出現(xiàn)了抗病抗寒性差、黃酮含量不穩(wěn)定、遺傳特征逐年退化等現(xiàn)象。因此建立三葉青抗寒性、抗病性評價體系，并對其抗性機(jī)制進(jìn)行分析，篩選抗性種質(zhì)和抗性基因，開展三葉青功能性成分的評價，篩選優(yōu)異種質(zhì)資源，將有利于三葉青種質(zhì)資源的高效利用。采用常規(guī)普通育種技術(shù)需觀察后代性狀分離現(xiàn)象，而其每一代的生長周期即長達(dá)數(shù)年，因此亟需開展與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的分子遺傳標(biāo)記的開發(fā)，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)分子輔助遺傳育種。

[1] Peng X，Zhuang D D，Guo Q S.Induction of S Phase Arrest and Apoptosis by Ethylacetate Extract from Tetrastigma hemsleyanum in Human Hepatoma Hep G2cells[J].Tumor Biology，2015，36(4)：2541-2550.

[2] 楊雄志，王翰華.不同產(chǎn)地三葉青提取物解熱作用及對大白鼠下丘腦5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺含量的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，30(3)：393-395.

[3] 馬丹丹，李偉平，馬哲龍，等.三葉青多糖抗肝損傷作用的研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41(1)：34-36.

[4] 林婧，黃澤豪，許文，等.不同產(chǎn)地三葉青總黃酮含量及對肝癌細(xì)胞增殖的抑制率比較[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，24 (5)：40-41.

[5] 黃真，毛慶秋.三葉青總氨基酸對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2007，24(3)：190-192.

[6] 蹇京蓉.中藥三葉青種質(zhì)資源調(diào)查及保護(hù)利用對策研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[7] 彭昕，林言娜，何軍邀，等.正交法優(yōu)化三葉青繼代增殖與生根培養(yǎng)的條件[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2012，26 (2)：10-12.

[8] 彭昕，林言娜，何軍邀，等.培養(yǎng)條件對三葉青愈傷組織生長及總黃酮含量的影響[J].藥物生物技術(shù).2012，19 (2)：138 -141.

[9] 彭昕，張劍，何軍邀，等.三葉青松散型和致密型愈傷組織懸浮培養(yǎng)及黃酮積累的比較研究[J].中草藥，2012，43(3)：577-580.

[10] Peng X，Zhou S L，He J Y，et al.Influence of Rare Earth Elements on Metabolism and Related Enzyme Activity and Isozyme Expression in Tetrastigma hemsleyanum Cell Suspension Cultures[J].Biological Trace Element Research，2013，152(1)：82-90.

[11] Peng X，He J Y.The inhibitory effect of Ca2+on the flavonoid production of Tetrastigma hemsleyanum suspension cells induced by metal elicitors[J].In Vitro Celluar and Developmental Biology，2013，49(5)：550-559.

[12] 彭昕，汪榮斌，何軍邀，等.三葉青顆粒狀愈傷組織懸浮培養(yǎng)系的建立及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].中成藥，2012，34(5)：961-964.

[13] Peng X，Zhang T T，Zhang J.Effect of subculture times on genetic fidelity，endogenous hormone level and pharmaceutical potential of Tetrastigma hemsleyanum callus[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2015，122，(1)：67-77.

[14] 鐘毓倩.三葉青的組織培養(yǎng)與快速繁殖研究[J].浙江中醫(yī)雜志，2007，42(6)：363-364.

[15] 錢麗華.三葉青不定根組培快繁體系的建立與應(yīng)用研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2013.

[16] 史清英.三葉青莖段外植體組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化及印度梨形孢對其生長的影響[D].杭州：浙江大學(xué)，2015.

[17] 杜蘇瑞.三葉青轉(zhuǎn)基因毛狀根的誘導(dǎo)繁殖及其分析[D].杭州：杭州師范大學(xué)，2013.

[18] 吉慶勇，程文亮，華金渭，等.三葉青扦插繁殖技術(shù)研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，25(2)：12-14.

[19] 華金渭，朱波，吉慶勇，等.不同種源三葉青生物學(xué)特性與扦插育苗試驗[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56(8)：1185-1188.

[20] 浦錦寶，鄭軍獻(xiàn)，梁衛(wèi)青.一種三葉青的人工栽培方法:CN102119625A[P].2011-07-03.

[21] 程良綏.藥用植物三葉青的生物學(xué)特性及林下栽培技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014，14：187-188.

[22] Dai Y J，Shen Z G，Liu Y，et al.Effects of shade treatments on the photosynthetic capacity，chlorophyll fluorescence，and chlorophyll content of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg[J].Environmental and Experimental Botany，2009，65(2)：177-182.

[23] 李水福，朱筱芬.三葉青與土圞兒的鑒別[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，1999，40：297.

[24] 殷紅妹.水蛭和三葉青的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別[J].中國藥業(yè)，2011，20(20)：78-79.

[25] 黃真，胡瑛瑛，王慶秋，等.浙江三葉青與廣西三葉青的生藥學(xué)鑒別[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，31(6)：759-760.

[26] 王一涵，陳川，姜維梅，等.一種鑒定藥用植物三葉青的方法:201310373809.4[P].2013-12-04.

[27] 符淵淼.藥用植物三葉青的種質(zhì)鑒定和組培快繁研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2011.

[28] 彭昕，吉慶勇，張煜炯，等.快速鑒別三葉青及其多種偽混品的PCR-RFLP方法:201510016355.4[P].2015-05-13.

[29] 金月山.三葉青的種類、分布與現(xiàn)狀[J].養(yǎng)生保健指南，2012(1)：70.

[30] 吉慶勇，華金渭，程文亮，等.人工種植和野生三葉青中總黃酮含量的比較[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(1)：37-38.

[31] 鄭軍獻(xiàn)，胡軼娟，梁衛(wèi)青，等.紫外可見分光光度法測定三葉青中總黃酮的含量[J].中國中醫(yī)藥科技，2009，16(5)：386-387.

[32] 許文，傅志勤，林婧，等.UPLC-MS/MS 法同時測定三葉青中 10 種黃酮類成分[J].藥學(xué)學(xué)報，2014，49 (12)：1711-1717.

[33] 陳麗蕓.三葉青化學(xué)成分及抗腫瘤活性研究[D].福州：福建中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[34] 袁帶秀，侯娟.3個不同種源地三葉青酯酶同工酶比較研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，21：34-36.

[35] 袁帶秀，呂江明.不同種源地三葉青的POD同工酶比較[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(7)：50-51.

[36] 彭昕，吉慶勇，李玉蘭，等.瀕危藥用植物三葉青 ISSR 分子標(biāo)記的建立[J].中成藥，2015，37(7)：1507-1514.

[37] 紀(jì)其雄，彭昕，吳曉菁，等.三葉青相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].中成藥，2015，37(3)：564-568.

[38] Peng X，Ji Q Y，F(xiàn)an S W，et al.Genetic diversity in populations of the endangered medicinal plant Tetrastigma hemsleyanum revealed by ISSR and SRAP markers：implications for conservation[J].Genetic Resources and Crop Evolution，2015，62：1069-1078.

[39] 王一涵，傅承新.藥用植物三葉青特異性 SCAR 分子探針的研發(fā)和群體遺傳學(xué)研究:中國植物學(xué)會第十五屆會員代表大會暨八十周年學(xué)術(shù)年會論文集[C].南昌：[出版者不詳]，2013.

[40] Wang Y H，Chen N，Zhang Y C，et al.Development and characterization of microsatellite markers for the Chinese endangered medicinal plant Tetrastigma hemsleyanum[J].Genetics and Molecular Research，2014，13(4)：9062-9067.

[41] Peng X，Ji Q Y，Wu H，et al.Slow-growth conservation and clonal fidelity of Tetrastigma hemsleyanum microplants[J].In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant，2015，51：463-470.

[42] 彭昕.三葉青種質(zhì)資源的離體保存及保存后恢復(fù)生長的方法：20131021834 8.3[P].2013-09-18.

ResearchProgressinUtilizationofTetrastigmahemsleyanumGermplasms

PENGXin1*，JIQingyong2，LIANGYaqing1，ZHANGYujiong1，LOUTianling1

(1.ZhejiangPharmaceuticalCollege，Ningbo315100，China；2.LishuiAcademyofAgriculturalScience，Lishui323000，China)

Tetrastigmahemsleyanumis a precious and rare medicinal herb，which is widely used in clinic.The wild resources ofT.hemsleyanumare on the verge of extinction.The artificial cultivation ofT.hemsleyanumencountered great difficulties，such as a long growth period，andthe poor speciesbreeding.Allof the above lead to thatT.hemsleyanumnow has suffered from mix of variety and degeneration of genetic characterization，which would severely influence the safety and effectiveness for its clinical use.This paper reviewed the research progresses in classifications，breeding，identification，and conservation ofT.hemsleyanumgermplasms.the problems and future research fields of the development ofT.hemsleyanumgermplasms was also put forward.

Tetrastigmahemsleyanum；artificial breeding；germplasm identification；resource assessment

2015-09-20)

浙江省公益技術(shù)項目(2013C32103)；浙江省高校訪問工程師校企合作項目(FG2014008)；寧波市農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(2014C10031)；寧波市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(2015C110027);浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目(2013ZA119)；浙江省新苗人才計劃(2013R433007)

*

彭昕，副教授，研究方向：中藥生物技術(shù)；E-mail：px4142@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.034