延邊黃牛和延黃牛脂肪組織FASN基因mRNA表達(dá)水平與肉質(zhì)的關(guān)系

宮 強(qiáng)，孟 影，馬文秀，延立勇，曹 雪，戢 爽　(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000)

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延邊黃牛和延黃牛脂肪組織FASN基因mRNA表達(dá)水平與肉質(zhì)的關(guān)系

宮 強(qiáng)，孟 影，馬文秀，延立勇，曹 雪，戢 爽*(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000)

延邊黃牛是吉林延邊地區(qū)役肉兼用黃牛品種，是國(guó)家級(jí)資源保護(hù)品種，是我國(guó)五大地方良種牛之一。延黃牛2006年在延邊區(qū)培育而成，含75%延邊黃牛血統(tǒng)和25%利木贊牛血統(tǒng)，采用了雜交—回交—自群繁育、群體繼代選育幾個(gè)階段。延黃牛是繼夏南牛之后由農(nóng)業(yè)部于2008年初宣布培育成功的我國(guó)第2個(gè)肉用型牛品種。

脂肪酸合成酶(FASN)是影響人和動(dòng)物脂肪沉積的關(guān)鍵酶，主要由脂肪細(xì)胞分泌，牛的FASN基因位于BTA19，已有報(bào)道BTA19上有與脂肪相關(guān)的QTL[1]，F(xiàn)ASN基因全長(zhǎng)18 693 bp，由43個(gè)外顯子組成，轉(zhuǎn)錄形成8 225 bp的mRNA，編 碼2 513個(gè)氨基酸[2]。研究表明，F(xiàn)ASN基因的表達(dá)量與IMF的含量相關(guān)[3]。FASN是一種復(fù)雜的同型二聚體酶，在酰基輔酶A和多聚酰輔酶A合成長(zhǎng)鏈脂肪酸的過(guò)程中起重要作用[4-5]。動(dòng)物體內(nèi)脂肪酸合成酶的數(shù)量和活性對(duì)動(dòng)物脂肪酸的合成及體脂的沉積具有重要意義。深入研究發(fā)現(xiàn)FASN基因的SNP位點(diǎn)與反芻動(dòng)物肌肉中脂肪酸組成有很強(qiáng)的相關(guān)性[6-8]。因此，可以通過(guò)調(diào)控FASN基因在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)有效控制脂肪酸的沉積，改善動(dòng)物品質(zhì)。筆者以延邊黃牛和延黃牛為研究對(duì)象，采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)不同品種牛不同脂肪沉積部位的FASN 基因mRNA表達(dá)水平，探討FASN在脂肪沉積過(guò)程中的作用，旨在為不同部位脂肪沉積的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物為24月齡延邊黃牛和延黃牛各9頭，來(lái)自龍井犇福牛業(yè)，屠宰后分別取其皮下脂肪、腹部脂肪、腎周脂肪、背最長(zhǎng)肌、心臟、肝臟、肺臟、腎臟和小腸共9個(gè)組織和器官，迅速投入液氮，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱中凍存。

1.2主要試劑TRIzol，購(gòu)自Invitrogen公司；RNeasy Lipid Tissue Mini and Midi Kits，購(gòu)自Qiagen公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with a gDNA Remover kit，購(gòu)自Toyobo公司；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix，購(gòu)自Toyobo公司；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、DEPC等購(gòu)自Sigma公司。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank收錄的?；騀ASN mRNA(NM_001012669)和GAPDH mRNA(NM_001034034)序列，利用Primer 5.0和Oligo 7軟件按照引物設(shè)計(jì)的基本要求設(shè)計(jì)FASN基因定量PCR引物及內(nèi)參引物，F(xiàn)ASN(5′-3′) Sense: CTGGAGCGTGAGCACAACCTG，Anti-sense: GTGTGGAGTCCGTCAGCTCAT；GAPDH(5′-3′)，Sense: CGTGTCTGTTGTGGATCTGACCTG，Anti-sense:CAACCTGGTCCTCAGTGTAGCCT(引物由上海生物工程有限公司合成)。

1.4方法

1.4.1脂肪及其他組織總RNA提取。以成年延邊黃牛和延黃牛脂肪組織及其他器官組織為材料，使用Trizol試劑盒提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，并檢測(cè)RNA的濃度，-80 ℃下保存待用。

1.4.2總RNA的反轉(zhuǎn)錄。按照日本東洋紡ReverTra Ace PCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒的要求進(jìn)行，將總RNA量統(tǒng)一調(diào)整到500 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，為了保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，在反轉(zhuǎn)錄體系中增加了去DNA的操作步驟,體系為RNA template 2 μl，4×DN Master Mix 2 μl， Nuclease-free Water 4 μl輕輕攪拌混勻后，在37 ℃條件下溫育5 min，將上述反應(yīng)液置于冰上加入2 μl的5×RT Master MixⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶，37 ℃條件下溫育15 min，在50 ℃條件下溫育5 min，在98 ℃條件下酶失活，以上述反應(yīng)液為模板進(jìn)行Real-time PCR。

1.4.3Real-time定量PCR。利用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x檢測(cè)mRNA表達(dá)水平，熒光定量PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μl、SYBR qPCR Mix 12.5 μl、上下游引物各1 μl、超純水9.5 μl,充分混勻。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，并生成溶解曲線。

1.4.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。試驗(yàn)結(jié)果采用相對(duì)比較Ct法，即通過(guò)計(jì)算2-ΔΔCt值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為參比基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算每組數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。為了保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，重復(fù)3次。應(yīng)用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果通過(guò)GraphPad軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA提取結(jié)果從延邊黃牛和延黃牛各組織器官中提取總RNA，結(jié)果如圖1所示。電泳檢測(cè)結(jié)果表明，總RNA的完整性較好，基本沒(méi)有降解，微型紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，無(wú)DNA或蛋白污染，可滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2FASN基因mRNA的PCR擴(kuò)增將擴(kuò)增所得不同品種牛FASN基因和GAPDH基因的PCR產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增大小與設(shè)計(jì)引物片段相符(圖2)。

2.3FASN基因mRNA在延邊黃牛不同組織和器官中表達(dá)水平分析從圖3可以看出，F(xiàn)ASN基因 mRNA在延邊黃牛的不同組織和器官中均有表達(dá)，F(xiàn)ASN基因在不同脂肪組織中表達(dá)量均高于背最長(zhǎng)肌。內(nèi)臟組織中，F(xiàn)ASN基因在肺中的表達(dá)量高于其他器官，在小腸、心臟、肝臟和腎臟中微弱表達(dá)，表達(dá)差異不顯著。

2.4FASN基因mRNA在延黃牛不同組織和器官中表達(dá)水平分析從圖4可以看出，F(xiàn)ASN mRNA在延黃牛的不同組織和器官中均有表達(dá)，F(xiàn)ASN mRNA在皮下脂肪和腹部脂肪表達(dá)量均顯著高于腎周脂肪和背最長(zhǎng)肌。FASN基因在肺中的表達(dá)量高于其他器官，在小腸、心臟、肝臟和腎臟中表達(dá)量微弱，而在腹部脂肪組織中表達(dá)量顯著高于肺臟、心臟、肝臟、腎臟和小腸。

2.5FASN基因mRNA在延邊黃牛和延黃牛相同組織器官中表達(dá)水平分析從圖5可以看出，F(xiàn)ASN基因mRNA在延黃牛的皮下脂肪和腹部脂肪中表達(dá)量都高于延邊黃牛。肺中FASN的表達(dá)量高于其他臟器，在小腸、心臟、肝臟和腎臟中表達(dá)量微弱，而其在延黃牛的皮下脂肪和腹部脂肪中的表達(dá)量均顯著高于肺臟、肝臟、腎臟和小腸。

3討論

3.1FASN基因在脂類代謝中作用脂肪組織是能量貯存和釋放的主要組織，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡。一直以來(lái)，脂肪組織被認(rèn)為是不活躍的組織，而越來(lái)越多的研究表明脂肪組織可通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌的形式分泌重要代謝因子，這些因子通過(guò)自分泌或者旁分泌途徑調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞自身代謝，而通過(guò)內(nèi)分泌的方式調(diào)節(jié)其他組織的代謝。FASN是一種多功能酶，對(duì)脂類的生成起著重要作用，從而調(diào)節(jié)脂肪組織蓄積和發(fā)育[9]。不同基因型FASN與印第安人體脂蓄積比例顯著相關(guān)，腹脂中FASN表達(dá)量較高[10]。這表明FASN基因是對(duì)脂肪儲(chǔ)存和代謝過(guò)程起重要作用的候選基因。脂肪組織作為一個(gè)主要的內(nèi)分泌器官，可以分泌大量的因子調(diào)節(jié)遠(yuǎn)處的靶組織[11]。該研究結(jié)果表明FASN在脂肪組織中表達(dá)量較高，而在其他組織中表達(dá)量低，F(xiàn)ASN是脂肪酸合成過(guò)程的關(guān)鍵酶，脂肪組織可能通過(guò)內(nèi)分泌作用，間接調(diào)控其他器官。

3.2脂肪不同沉積部位的氨基酸組成研究目前，關(guān)于在不同脂肪組織中與脂代謝相關(guān)基因的報(bào)道較少。日本和牛FASN基因的SNP研究結(jié)果表明不同F(xiàn)ASN基因型與肉質(zhì)相關(guān)，從而影響氨基酸的組成[12]。對(duì)烏龜?shù)南嚓P(guān)研究表明不同部位的脂肪組織氨基酸的組成存在差異[13]。體腔內(nèi)脂肪組織和腎臟脂肪組織由較高的飽和脂肪酸構(gòu)成，而皮下脂肪組織由較高的不飽和脂肪酸構(gòu)成。對(duì)延黃牛的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN基因在皮下脂肪和腹部脂肪中的表達(dá)量顯著高于腎周脂肪，這些差異也可能是由于不同牛脂肪酸的組成不同造成。研究表明，安格斯牛與日本和牛皮下脂肪和肌間脂肪的氨基酸組成不同[12]。以前研究報(bào)道表明FASN在脂肪型個(gè)體表達(dá)量高于瘦肉型個(gè)體[14]。這些研究結(jié)果表明脂肪酸的組成與動(dòng)物的品種有關(guān)，同時(shí)與脂肪蓄積過(guò)程相關(guān)。FASN在延黃牛皮脂中的表達(dá)量顯著高于延邊黃牛，而在腹部脂肪和腎周脂肪中差異不顯著，說(shuō)明延黃牛是由延邊黃牛選育而成，這2個(gè)品種有相同的遺傳基礎(chǔ)。

4結(jié)論

在延邊黃牛和延黃牛2個(gè)不同牛品種中，F(xiàn)ASN 基因mRNA在不同脂肪組織中的表達(dá)量均高于背最長(zhǎng)肌，而延黃牛中FASN基因mRNA在皮下脂肪、腹部脂肪表達(dá)量均顯著高于腎周脂肪和背最長(zhǎng)肌。通過(guò)對(duì)其他器官的研究發(fā)現(xiàn)，肺中FASN因mRNA的表達(dá)量高于其他臟器，在小腸、心臟、肝臟和腎臟中表達(dá)量微弱。這說(shuō)明FASN是影響脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，與肉質(zhì)相關(guān)，其中皮下脂肪和腹部脂肪是脂肪酸合成的主要部位。

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摘要為了探討不同品種牛不同脂肪沉積部位FASN基因mRNA表達(dá)水平與肉質(zhì)的關(guān)系，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)延邊黃牛和延黃牛皮下脂肪、腹部脂肪、腎周脂肪與其他器官的FASN基因mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，2個(gè)牛品種的FASN基因mRNA在不同脂肪組織中表達(dá)量均高于背最長(zhǎng)肌，而延黃牛皮下脂肪和腹部脂肪中FASN基因mRNA表達(dá)量都高于延邊黃牛。通過(guò)對(duì)肺、小腸、腎臟、肝臟和心臟中FASN基因mRNA研究發(fā)現(xiàn)，延邊黃牛和延黃牛肺中FASN基因mRNA的表達(dá)量高于其他臟器。由此可見(jiàn)，F(xiàn)ASN是影響脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，與肉質(zhì)相關(guān)，其中皮下脂肪和腹部脂肪是脂肪酸合成的主要部位。

關(guān)鍵詞延邊黃牛；延黃牛；脂肪組織；FASN基因；熒光定量PCR

mRNA Expression Levels of FASN Gene in Various Adipose Tissues from Yanbian Yellow Cattle and Yanhuang Cattle and Its Association with Meat Quality

GONG Qiang, MENG Ying, MA Wen-xiu, JI Shuang*et al(College of Agriculture, Yanbian University, Yanji, Jilin 133000)

AbstractThe objective of this study was to investigate the correlation between cattle breed and deposit of adipose tissues in different position and the mRNA expressions levels of fatty acid synthase (FASN), which are associated with meat quality. To understand this difference, the expression of FASN in different adipose tissues in these two breeds were analyzed using Real-time quantitative polymerase chain reaction method. The result showed that FASN mRNA expression levels was significantly higher in adipose tissue than in LD in both breeds. On the other hand, FASN mRNA expression levels in subcutaneous fat and abdominal fat in Yanhuang cattle were significantly higher than that in Yanbian yellow cattle. Furthermore, the mRNA expression levels of FASN gene in lung, colon, kidney, liver, heart of Yanbian yellow cattle and Yanhuang cattle were also investigated. The results showed that the highest mRNA expression levels of FASN gene were detected in the lung in both breeds. FASN as a critical enzyme in biosynthesis of fatty acids is associated with meat quality, subcutaneous fat and abdominal fat is a critical part in biosynthesis of fatty acids.

Key wordsYanbian yellow cattle; Yanhuang cattle; Adipose tissues; FASN; qRT-PCR

收稿日期2015-04-30

通訊作者

作者簡(jiǎn)介宮強(qiáng)(1990-)，男，吉林長(zhǎng)春人，本科生，專業(yè)：動(dòng)物科學(xué)。*，講師，博士，碩士生導(dǎo)師，從事分子遺傳與動(dòng)物育種研究。

基金項(xiàng)目吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目。

中圖分類號(hào)S 823.8+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)18-153-03