飼用L—色氨酸添加劑的Ames試驗(yàn)

趙莎莎　周澤偉　鄭玲敏等

摘要：通過對(duì)飼用L-色氨酸進(jìn)行鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)），評(píng)價(jià)該飼料添加劑的潛在致突變性。飼用L-色氨酸在0.008～5.000 mg/皿的范圍內(nèi)分為5個(gè)劑量組，在加（+）S9、不加（-）S9的情況下，以TA97、TA98、TA100、TA102為試驗(yàn)菌株進(jìn)行Ames試驗(yàn)。以敵克松等作為陽性對(duì)照，滅菌水為空白對(duì)照，二甲基亞砜為溶劑對(duì)照，采用雙盲法計(jì)算回復(fù)突變菌落數(shù)。結(jié)果表明，陽性對(duì)照試驗(yàn)各菌株反應(yīng)合格；飼用L-色氨酸無論在加（+）S9、不加（-）S9的情況下，4株試驗(yàn)菌的平均回變菌落數(shù)均小于陰性（溶劑）對(duì)照組的2倍，未見劑量-反應(yīng)關(guān)系，且2次試驗(yàn)結(jié)果一致。飼用L-色氨酸的Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性，表明該飼料添加劑無體外致突變性。

關(guān)鍵詞：L-色氨酸；Ames試驗(yàn)；飼料添加劑

中圖分類號(hào)：S816.71文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0287-02

收稿日期：2015-03-23

基金項(xiàng)目：江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目；揚(yáng)州大學(xué)新世紀(jì)人才工程。

作者簡(jiǎn)介：趙莎莎（1979—），女，江蘇徐州人，講師，主要從事實(shí)驗(yàn)室教學(xué)工作。E-mail：157568300@qq.com。

通信作者：張雨梅，博士，教授。E-mail：zym@yzu.edu.cn。L-色氨酸是人和動(dòng)物的必需氨基酸之一，參與機(jī)體蛋白質(zhì)合成和營養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)。色氨酸在體內(nèi)合成極少，須從外界攝取滿足機(jī)體需要。國內(nèi)外在食品中已廣泛將L-色氨酸作為食品添加劑，以強(qiáng)化對(duì)蛋白質(zhì)的利用率，對(duì)于強(qiáng)化食品提高植物蛋白的利用率具有重要作用[1]。

L-色氨酸是繼賴氨酸、蛋氨酸之后的又一個(gè)重要的飼料添加氨基酸。色氨酸的代謝產(chǎn)物5-羥基色氨酸在動(dòng)物體內(nèi)有抗高密度、斷奶等應(yīng)激作用，還能促進(jìn)γ-球蛋白的產(chǎn)生、增強(qiáng)機(jī)體抗病能力[2-3]。在低蛋白飼料中添加色氨酸對(duì)改善飼料效率、提高畜禽增重和家禽生產(chǎn)性能[4-6]、增強(qiáng)免疫機(jī)能十分有效[7-10]。Li等在飼料中添加0.04% L-色氨酸可顯著提高蛋雛鴨平均日增質(zhì)量、飼料轉(zhuǎn)化率[6]。周斌等研究發(fā)現(xiàn)，在含0.06% L-色氨酸的日糧中額外添加0.03%、 0.06% 、0.09% L-色氨酸，可顯著提高0～3周齡肉仔雞平均日增質(zhì)量[7]。L-色氨酸有促進(jìn)骨髓T 淋巴細(xì)胞前體分化為成熟T 淋巴細(xì)胞，具有免疫增強(qiáng)作用[11-12]，L-色氨酸缺乏則會(huì)導(dǎo)致體液免疫功能降低[13]。雞飼料中添加L-色氨酸可顯著提高α干擾素、γ干擾素和IgG水平，同時(shí)在傳染性法氏囊病免疫方面作用顯著。

在蛋雛鴨飼料中添加0.04% L-色氨酸可顯著提高蛋雛鴨脾臟指數(shù)，添加 0.06% L-色氨酸可顯著提高蛋雛鴨胸腺指數(shù)。由于L-色氨酸生產(chǎn)工藝不斷改進(jìn)、生產(chǎn)成本逐漸降低，其作為飼料添加劑在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛。本研究通過鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）評(píng)價(jià)某企業(yè)新的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的飼用L-色氨酸的致突變性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1受試物及溶液配制飼用20%L-色氨酸，批號(hào)20130409，黃色顆粒，由浙江某生物股份有限公司提供。

飼用L-色氨酸充分研磨后，稱取5.00 g溶于100 mL滅菌蒸餾水中。用直徑50 mm 的無菌濾膜（孔徑0.22 μm）過濾除菌，用滅菌蒸餾水梯度稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

陽性對(duì)照物：2-氨基芴（2-AF），純度>99%，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；敵克松，純度98.8%，美國DIMA技術(shù)有限公司；4-硝基喹啉-N-氧化物、甲基磺酸甲酯，純度均大于98%，美國Amresco公司；多氯聯(lián)苯（Aroclor1254），美國Crescent Chemical 有限公司。陽性對(duì)照物均用二甲基亞砜作為溶劑配制成相關(guān)濃度。

1.1.2試驗(yàn)菌株TA97、TA98、TA100、TA102菌株由江蘇省疾病控制中心提供，-80 ℃保存。試驗(yàn)菌株生物學(xué)特性按GB 15193.4—2003《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定，符合試驗(yàn)要求。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S9的制備雄性成年Wistar大鼠2只，多氯聯(lián)苯（Aroclor1254）溶于玉米油中制成200 mg/mL溶液，按500 mg/kg腹腔注射作為誘導(dǎo)劑。按GB 15193.4—2003《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)》方法制備S9，生物活性鑒定合格后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2平板摻入法Ames試驗(yàn)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，受試物飼用L-色氨酸的劑量設(shè)置分別為5.00、1.00、0.20、0.04、 8.0 0 μg/皿 ；另設(shè)陰性（溶劑）對(duì)照組和陽性對(duì)照組，每個(gè)試驗(yàn)組分加（+）S9、不加（-）S9等2個(gè)系列，每個(gè)系列設(shè)3個(gè)平行平皿。陽性對(duì)照組：加S9 時(shí)，4株菌株均用2-氨基芴（2-AF），濃度為100 μg/mL[0.1 μg/（μL·皿）]；不加S9時(shí)，TA97、TA98用敵克松，濃度為0.5 mg/mL[0.5 μg/（μL·皿）] ，TA100用4-硝基喹啉-N-氧化物，濃度為5 μg/mL[0.005 μg/（μL·皿）]，TA102用甲基磺酸甲酯，濃度為 10 μg/mL[0.01 μg/（μL·皿）]。

雙盲法記錄每皿回變菌落數(shù)。按GB 15193.4—2003《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)》的標(biāo)準(zhǔn)判定Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性或陽性。

1.2.3觀察指標(biāo)整個(gè)試驗(yàn)過程中需觀察試驗(yàn)菌是否正常生長(zhǎng)，陰性對(duì)照組每皿自發(fā)回變菌落數(shù)是否在正常范圍，陽性對(duì)照試驗(yàn)各菌株反應(yīng)是否合格。

雙盲法記錄受試物各劑量組、陽性對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照（自發(fā)回變）的每皿回變菌落數(shù)。

1.2.4結(jié)果判定如果受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照組回變菌落數(shù)的2倍或2倍以上、受試品的回復(fù)突變數(shù)的增加與劑量相關(guān)并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、某一劑量組呈現(xiàn)可重復(fù)的回復(fù)突變數(shù)增加并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則判為誘變陽性（有致突變作用），反之為陰性。

2結(jié)果與分析

4種試驗(yàn)用鼠傷寒沙門氏菌株菌苔生長(zhǎng)正常，陽性對(duì)照試驗(yàn)各菌株反應(yīng)合格。2次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。

3結(jié)論與討論

在本研究中，飼用L-色氨酸飼料添加劑的鼠傷寒沙門氏菌突變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陰性，表明飼用L-色氨酸飼料添加劑對(duì)鼠傷寒沙門氏菌試驗(yàn)株無致突變性。

Ames試驗(yàn)是遺傳毒理學(xué)的一種體外試驗(yàn)，遺傳學(xué)終點(diǎn)是基因突變，用于檢測(cè)受試物能否引起鼠傷寒沙門氏菌基因組堿基置換或移碼突變。如果對(duì)飼用L-色氨酸進(jìn)一步進(jìn)行小鼠微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)、染色體畸變?cè)囼?yàn)、姊妹染色體交換試驗(yàn)或顯性致死試驗(yàn)，則可以更全面地評(píng)價(jià)其致突變作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]李劍欣，張緒梅，徐琪壽.色氨酸的生理生化作用及其應(yīng)用[J]. 氨基酸和生物資源，2005，27（3）：58-62.

[2]徐洪利，趙斐，左良成，等. 飼用色氨酸應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（ 13）：5750-5752.

[3]Leuchtenberger W，Huthmacher K，Drauz K. Biotechnological production of amino acids and derivatives：current status and prospects[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2005，69（1）：1-8.

[4]Ettle T，Roth F X. Specific dietary selection for tryptophan by the piglet[J]. Journal of Animal Science，2004，82（4）：1115-1121.

[5]王榮發(fā)，李敏，賀喜等. 低蛋白質(zhì)飼糧條件下生長(zhǎng)豬對(duì)色氨酸需要量的研究[J]. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011（23）：1669-1676.

[6]Li Y Z，Kerr B J，Kidd M T，et al. Use of supplementary tryptophan to modify the behavior of pigs[J]. Journal of Animal Science，2006，84（1）：212-220.

[7]周斌，李慧，鄒曉庭，等. 色氨酸對(duì)產(chǎn)蛋雞脂肪代謝的影響[J]. 中國畜牧雜志，2011，47（7）：50-53.

[8]韓旭峰，高玉鵬，侯水生，等. 1～14 日齡北京鴨色氨酸需要量的研究[J]. 中國飼料，2009（22）：22-23.

[9]劉肖挺，王安，楊小燕，等. 色氨酸對(duì)蛋雛鴨生長(zhǎng)性能和營養(yǎng)物

質(zhì)代謝影響[J]. 中國飼料，2012，（19）：22-25.

[10]王鵬，王安，李麗娟.飼糧中色氨酸對(duì)0～3 周齡肉仔雞生長(zhǎng)性能及血液生化指標(biāo)的影響[J]. 飼料工業(yè)，2010，31（20）：8-11.

[11]程鎮(zhèn)燕，陳韶陽，喬秀亭.魚類功能性氨基酸營養(yǎng)免疫研究進(jìn)展[J]. 飼料研究，2014（9）：52-57.

[12]Lepage O，Tottmar O，Winberg S. Elevated dietary intake of L-tryptophan counteracts the stress-induced elevation of plasma cortisol in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）[J]. The Journal of Experimental Biology，2002，205（Pt 23）：3679-3687.

[13]Koopmans S J，Ruis M，Dekker R，et al. Surplus dietary tryptophan reduces plasma cortisol and noradrenaline concentrations and enhances recovery after social stress in pigs[J]. Physiology & Behavior，2005，85（4）：469-478.尹柏雙，王秋竹，付連軍，等. 不同程度隱性乳房炎奶牛乳清中結(jié)合珠蛋白的變化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11

：289-290.