落新婦苷對(duì)永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT增殖、凋亡的影響及機(jī)制探討

張春紅，楊帆，杜錫賢，范玉，張歡歡，張春敏，韓長(zhǎng)玉

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南 250033；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

?

落新婦苷對(duì)永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT增殖、凋亡的影響及機(jī)制探討

張春紅1，楊帆1，杜錫賢2，范玉2，張歡歡1，張春敏1，韓長(zhǎng)玉1

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南 250033；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

摘要：目的觀察土茯苓提取物落新婦苷對(duì)永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT增殖、凋亡的影響，并探討其機(jī)制。方法收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞，觀察組分別加入不同濃度落新婦苷、空白對(duì)照組加DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，采用MTT法測(cè)算細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率；收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞，觀察組分別加入不同濃度落新婦苷+20 ng/mL INF-γ、模型對(duì)照組加20 ng/mL INF-γ、空白對(duì)照組加DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB)p65、骨橋蛋白(OPN)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) mRNA。結(jié)果落新婦苷在25、50、100、200、400 μg/mL時(shí)，HaCaT細(xì)胞增殖抑制率分別為3.06%、26.53%、40.82%、60.20%及61.22%。落新婦苷在50、100、200 μg /mL時(shí)，觀察組HaCaT細(xì)胞早期凋亡率分別為3.26%、8.24%和15.38%；與空白對(duì)照組早期凋亡率(1.33%)比較，P均<0.05。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組NF-κB p65、OPN、VEGF mRNA表達(dá)增加(P均<0.01)；與模型對(duì)照組比較，觀察組隨落新婦苷濃度增加，NF-κB p65、OPN、VEGF mRNA表達(dá)逐漸降低(P均<0.05)。結(jié)論土茯苓提取物落新婦苷能抑制HaCaT細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與制抑細(xì)胞NF-κB p65、OPN、VEGF mRNA表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：銀屑病；HaCaT細(xì)胞株；核轉(zhuǎn)錄因子κB p65；骨橋蛋白；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；落新婦苷

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性復(fù)發(fā)性皮膚病。研究表明[1～3]，VEGF、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB) p65和骨橋蛋白(OPN)在尋常型銀屑病(PV)患者皮損中高表達(dá)，干擾素γ(INF-γ)可促進(jìn)上述因子的表達(dá)。落新婦苷即是從土茯苓中提取的黃酮類(lèi)化合物。2012年3月～2015年3月，我們以永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT(以下簡(jiǎn)稱(chēng)HaCaT)為研究對(duì)象，觀察落新婦苷對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖、凋亡及VEGF、NF-κB p65和OPN mRNA表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料HaCaT，由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院?jiǎn)问寇姴┦炕葙?zèng)；落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物科技有限公司(批號(hào)11/090721，純度≥98%),將落新婦苷溶入DMSO中，用DMEM稀釋配成1 mg/mL混懸液，0.22 μm濾膜抽濾滅菌，-20 ℃貯存?zhèn)溆?；VEGF、NF-κB p65、OPN及β-actin引物序列，由北京華大基因生物技術(shù)有限公司合成；MTT試劑盒和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均由KeyGEN公司提供；熒光定量PCR試劑由Fermentas公司提供。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及傳代將HaCaT置于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37 ℃、100%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中單層傳代培養(yǎng)，每隔48～72 h更換培養(yǎng)液1次。

1.3細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，配成1×104/mL細(xì)胞懸液后接種于96孔培養(yǎng)板(200 μL/孔)，分為6組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后加藥；吸棄舊培養(yǎng)基，觀察組換用終濃度分別為25、50、100、200、400 μg/mL落新婦苷的新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(加入DMEM培養(yǎng)液)。棄去上清液，用培養(yǎng)液洗3次；每孔加入含MTT 50 μL的培養(yǎng)基，37 ℃再培養(yǎng)4 h；棄上清液，每孔加DMSO 150 μL室溫震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；1 h后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)490 nm)測(cè)定各孔吸光度值(A值)，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率= (A對(duì)照-A觀察)/A對(duì)照×100%。

1.4細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞儀。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。接種12孔板中，培養(yǎng)24 h；觀察組換用含終濃度分別為50、100、200 μg/mL落新婦苷的新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(加入DMEM培養(yǎng)液)。收集貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，加入Annexin-V-FITC 和 PI，輕輕混勻后加入細(xì)胞；懸浮細(xì)胞后避光放置5～15 min，PBS洗1遍；用300 μL PBS重懸細(xì)胞，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5細(xì)胞VEGF、NF-κB p65、OPN mRNA表達(dá)檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。引物設(shè)計(jì)[4～6]如下：VEGF上游引物5′-CGCCTGTAATCCCAGCACT-3′，下游引物5′-GCCCGAAGTCATTGAGTA GTC-3′，232 bp；NF-κB p65上游引物5′-CACCACTACATCGT-CCGAGGT-3 ′，下游引物5′-CTCTGCCCCATTTCTCC-CCGT -3 ′，301 bp；OPN上游引物5′-CTCTGAAGAA-ACGGATGACT-3′，下游引物5′-CTGGGATGACCTTGATAGCC-3′，389 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物5 ′-ACCAACTGGGACGACAT-3′，下游引物5 ′-CGCTCGGTGA GGATCTTCAT-3′，389 bp。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。取2 mL接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，觀察組更換為含終濃度分別為50、100、200 μg/mL落新婦苷和20 ng/mL INF-γ[7]的新鮮DMEM培養(yǎng)液，另設(shè)空白對(duì)照組(加DMEM培養(yǎng)液)和模型對(duì)照組(加20 ng/mL INF-γ)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，采用TRIzol試劑盒提取總RNA。取10 μL RNA溶液，加990 μL DEPC水稀釋?zhuān)谧贤夥止夤舛扔?jì)內(nèi)測(cè)定RNA溶液在260 nm及280 nm處的光密度(OD)值。OD260/OD280>1.7時(shí)標(biāo)本可用，否則重新提取。經(jīng)M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，并以此為模板行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：室溫放置10 min，42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，-20 ℃保存。熒光定量 PCR 反應(yīng)過(guò)程：采用Promega Sybre Green Supermixture 2×體系，以2-ΔΔCT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1落新婦苷對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響當(dāng)落新婦苷濃度在25、50、100、200、400 μg/mL時(shí)，HaCaT細(xì)胞增殖抑制率分別為3.06%、26.53%、40.82%、60.20%及61.22%；400 μg/mL的落新婦苷處理細(xì)胞后產(chǎn)生輕微的細(xì)胞毒性作用，部分細(xì)胞死亡。

2.2落新婦苷對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響觀察組當(dāng)落新婦苷濃度在50、100、200 μg /mL時(shí)，HaCaT細(xì)胞早期凋亡率分別為3.26%、8.24%和15.38%。與空白對(duì)照組早期凋亡率(1.33%)比較，P均<0.05。

2.3落新婦苷對(duì)INF-γ誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞VEGF、NF-κB p65、OPN mRNA表達(dá)的影響見(jiàn)表1。

表1　各組細(xì)胞NF-κB p65、OPN及VEGF mRNA

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；模型對(duì)照組比較，cP<0.05，dP<0.01；與50 μg/mL比較，eP<0.05，fP<0.01；與100 μg/mL比較，gP<0.05。

3討論

銀屑病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，新生血管形成是其重要的病理特征之一。VEGF是一種作用最強(qiáng)、最特異的促血管生成因子，可加重銀屑病皮損處的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)銀屑病的發(fā)病過(guò)程。OPN是存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的一種磷酸化糖蛋白，參與細(xì)胞黏附、凋亡、血管形成、炎癥反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種病理過(guò)程；其屬于Th1型細(xì)胞因子，是免疫細(xì)胞募集及啟動(dòng)Th1型細(xì)胞免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子，能促進(jìn)Th1型反應(yīng)，在銀屑病和腫瘤細(xì)胞中均有較高表達(dá)。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)控多種與炎癥和免疫有關(guān)的基因表達(dá)。研究表明，NF-κB可以刺激OPN和VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)過(guò)度增殖。

土茯苓具有清熱利濕、解毒、祛風(fēng)止痛等功效，為治療銀屑病的常用中藥。藥理研究證實(shí)，土茯苓具有抗腫瘤[8]、抗凝血[9]、抗菌作用[10，12]及調(diào)節(jié)免疫功能[11]。落新婦苷是土茯苓最主要的單體成分。銀屑病表皮過(guò)度增殖的KC可分泌一系列細(xì)胞因子和炎性因子，參與本病的免疫學(xué)發(fā)生、發(fā)展。INF-γ能明顯誘導(dǎo)NF-κB p65、OPN和VEGF mRNA的分泌，可能與INF-γ作用于HaCaT細(xì)胞后，刺激局部炎癥反應(yīng)，使HaCaT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子或炎癥因子增加有關(guān)。VEGF能呈劑量依賴(lài)性地促進(jìn)KC的增殖和KC的遷移而抑制其黏附[12]。本研究顯示，隨著落新婦苷濃度升高，HaCaT細(xì)胞NF-κB p65、OPN和VEGF mRNA表達(dá)降低。TNF-α、INF-γ能誘導(dǎo)人皮膚KC分泌NF-κB增多，且二氫黃酮類(lèi)化合物柚皮苷能明顯降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、INF-γ誘導(dǎo)的趨化因子的分泌，其作用途徑之一可能是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)[7]。氧化苦參堿可下調(diào)HaCaT細(xì)胞NF-κB p65和VEGF表達(dá)，且兩者呈正相關(guān)[13]。而我們的研究結(jié)果表明，落新婦苷能抑制HaCaT細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞NF-κB p65、OPN和VEGF mRNA表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張春紅,張春敏,杜錫賢,等.祛銀湯聯(lián)合紫外線治療尋常型銀屑病的療效觀察及對(duì)外周血OPN和VEGF表達(dá)的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2010,32(4)：289-292.

[2] 張春紅,杜錫賢,張春敏.祛銀湯治療進(jìn)行期尋常型銀屑病的臨床觀察及對(duì)外周血OPN和VEGF表達(dá)的影響[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2011,25(3)：228-230.

[3] 孫兆軍,李延,吳艷,等.骨橋蛋白及膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1在尋常性銀屑病的表達(dá)[J].中華皮膚科雜志,2009,42(10)：715-716.

[4] 張瑞芳,王威,吳擁軍,等.熱療聯(lián)合紫杉醇對(duì)NCI H446細(xì)胞增殖和VEGF mRNA表達(dá)的影響[J].河南醫(yī)學(xué)研究,2010,19(3)：263-265.

[5] 袁勝山,余昌胤,張駿.阿托伐他汀對(duì)Livin、NF-κB、IL-1β在腦缺血再灌注大鼠腦組織中表達(dá)的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2010,30(10)：2804-2806.

[6] 揭偉,羅泊濤,姜漢國(guó),等.高糖上調(diào)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞骨橋蛋白表達(dá)[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2010,30(8)：852-856.

[7] 劉遼,賈萍,楊云霞,等.柚皮苷對(duì)人皮膚角質(zhì)細(xì)胞分泌趨化因子RANTES及其核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥房,2010,21(1)：40-42.

[8] 路又璐,秦建中.17味中藥對(duì)培養(yǎng)的表皮細(xì)胞增殖的影響[J].臨床皮膚科雜志,1996,25(4)：202-204.

[9] 艾尼瓦爾·吾買(mǎi)爾,新華,周承明,等.赤土獲等苷對(duì)血小板聚集及實(shí)驗(yàn)性血栓形成的影響[J].中草藥,1997,28(10)：97-98.

[10] 紀(jì)莉蓮,范怡梅.土茯苓體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)[J].中國(guó)生化藥物雜志,2002,2(5)：239-241.

[11] 徐強(qiáng),王蓉.土茯苓對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,1993,9(1)：39-42.

[12] 滿孝勇.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體在正常表皮和銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)與功能研究[D].杭州：浙江大學(xué),2007.

[13]張彩晴,郭宏林,馮婕,等.氧化苦參堿對(duì)HaCaT細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB表達(dá)及一氧化氮分泌的影響[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(20)：3849-3852.

Effects of astilbin on cell proliferation and apoptosis of human

keratinocytes HaCaT and the mechanism

ZHAGNChun-hong1, YANG Fan, DU Xi-xian, FAN Yu, ZHANG Huan-huan,

ZHANGChun-min,HANChang-yu

(1TheSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of astilbin on the cell proliferation and apoptosis of human keratinocyte cell line HaCaT and to investigate the mechanism. MethodsHaCaT cells in the logarithmic phase were selected. The observation group was incubated with different concentrations of astilbin, and the blank control group was cultured with DMEM solution for 24 hours. The proliferation and apoptosis of HaCaT cells were respectively measured by MTT and flow cytometry (FCM). HaCaT cells in the logarithmic phase were selected. The observation group was cultured with different concentrations of astilbin+20 ng/mL INF-γ, the model group was cultured with 20 ng/mL INF-γ and the blank control group was cultured with DMEM solution for 24 hours. Real-time fluorogenetic quantitative PCR (FQ-PCR) was employed to detect the expression of nuclear transcription factor-κB p65 (NF-κB p65), osteopontin (OPN) and vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA.ResultsWhen the concentrations of astilbin were 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL, the proliferation inhibition rates of HaCaT cells were 3.06%, 26.53%, 40.82%, 26.53% and 61.22%. When the concentrations of astilbin were 50, 100, 200 μg/mL, the early apoptosis rates of HaCaT cells in the observation group were 3.26%, 8.24% and 3.26%, respectively. Compared with the blank control group (1.33%), significant difference was found in the early apoptosis rate (all P<0.05). Compared with the blank control group, the expression of NF-κB p65, OPN and VEGF mRNA was increased in the model control group (all P<0.01). Compared with the model control group, the expression of NF-κB p65, OPN and VEGF mRNA was gradually decreased with the increased concentrations of astilbin (all P<0.05). ConclusionAstilbin can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of HaCaT cells, whose mechanism may be associated with the inhibition of VEGF, NF-κB p65 and OPN mRNA expression.

Key words:psoriasis HaCat cell line; nuclear transcription factor-κB p65; osteopontin; vascular endothelial growth factor; astilbin

收稿日期：(2015-07-12)

通信作者簡(jiǎn)介：張春敏(1963-)，女，博士,主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療皮膚病的臨床與基礎(chǔ)。E-mail:zhangch1976@163.com

作者簡(jiǎn)介：第一張春紅(1976-)，女，博士,副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療銀屑病的臨床與基礎(chǔ)。E-mail: aliu133@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81202700/H2709)；山東省自然基金青年基金項(xiàng)目(ZR2010HQ032)；山東省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2010G0020231)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2009-164)。

中圖分類(lèi)號(hào)：R758.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)46-0020-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.007