神經(jīng)型一氧化氮合酶在心功能及其病理生理過程中發(fā)揮作用的分子機制

劉文博 崔蘭 趙光賢 金春子

綜述

神經(jīng)型一氧化氮合酶在心功能及其病理生理過程中發(fā)揮作用的分子機制

劉文博 崔蘭 趙光賢 金春子

神經(jīng)型一氧化氮合酶；一氧化氮；心功能；信號轉(zhuǎn)導通路

20世紀70年代末期，一氧化氮（Nitric oxide，NO）被認定為一種涉及廣泛生物學功能的信號分子[1-3]。這一發(fā)現(xiàn)使 Robert F.Furchgott、Louis J.Ignarro和FeridMurad在1998年獲得了諾貝爾生理學或醫(yī)學獎?，F(xiàn)在已經(jīng)證實，產(chǎn)生NO的酶，即一氧化氮合酶（NOS）包括三種亞型：神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS或NOS1）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS或NOS2）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS或NOS3）。一直以來，eNOS被認定是在心肌中NOS的唯一亞型。它在心臟中的多種功能調(diào)控也得到了證實[4,5]。1999年，Xu等人報道心肌肌質(zhì)網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum，SR）中表達nNOS。這種被表達的nNOS能夠控制肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵（SERCA）而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+的重吸收。nNOS也在心肌內(nèi)神經(jīng)元的自主神經(jīng)和神經(jīng)節(jié)中表達[6-8]，并通過交感和副交感神經(jīng)調(diào)節(jié)心律和心收縮力。此外，nNOS還能在人類冠狀動脈平滑肌細胞[9]中表達和維持基礎血流量[10]。總之，這些研究結(jié)果證實，nNOS在心臟中的作用是能夠在心臟內(nèi)所有至關(guān)重要的部分中表達，并在調(diào)節(jié)心律、心肌收縮力和微循環(huán)中起著重要的作用。

nNOS與eNOS在結(jié)構(gòu)和NO的產(chǎn)生上有相似之處。激活的nNOS是由一個N端含有氧化酶結(jié)構(gòu)域和C端含有還原酶結(jié)構(gòu)域的同源二聚體構(gòu)成的。在心肌細胞中，nNOS與eNOS在受到刺激后，存在部位和轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)錄后修飾，以及在心血管系統(tǒng)中介導發(fā)揮病理生理學功能的機制均有所不同[5,11-14]。例如，eNOS主要位于細胞膜的caveolae中[15]，并介導細胞內(nèi)Ca2+從ryanodine受體（RyR）中釋放[16]。nNOS位于心肌肌質(zhì)網(wǎng)[17,18]和細胞膜[19]中，并調(diào)節(jié)心肌細胞中Na+和Ca2+的平衡。由nNOS產(chǎn)生的NO能調(diào)節(jié)心肌細胞的收縮并通過作用于興奮-收縮耦聯(lián)的關(guān)鍵部位［例如受磷蛋白（PLN）或L型鈣通道（LTCC）］來促進心肌舒張。這時NO的半衰期很短（大約10 s）并且擴散區(qū)域有限，因此，nNOS或者移位到附近靶蛋白的nNOS發(fā)揮足夠的影響是必要的。本質(zhì)上講，nNOS和它的動態(tài)移位的空間限制，保證它能在正常和異常心臟中調(diào)節(jié)多種信號傳導通路和心肌功能。

1 nNOS調(diào)節(jié)心臟功能的作用機制

1.1 正常心臟中的nNOS 通過使用nNOS基因敲除和心肌細胞特異性nNOS表達模型與nNOS抑制劑的結(jié)合（比如SMTC、L-VNIO或7-NI），現(xiàn)已證實，基礎劑量的nNOS產(chǎn)生的NO對正常和異常心臟的收縮和舒張起著調(diào)節(jié)作用。在正常的心臟中，由nNOS產(chǎn)生的NO通過S-亞硝基化或者cGMP依賴機制，調(diào)節(jié)細胞膜中LTCC的活性，以減少細胞內(nèi)大量的一過性Ca2+內(nèi)流[20]，從而弱化心肌基礎收縮力。相比之下，心肌內(nèi)的Na+-Ca2+交換則不受影響[20]。在肌質(zhì)網(wǎng)中，nNOS源性NO促進心肌舒張，通過增加PKA-依賴（而不是cGMP/PKA依賴）PLN磷酸化位點16絲氨酸的磷酸化和Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ（CaMKⅡ）-依賴的PLN磷酸化位點17蘇氨酸磷酸化來促進SERCA對細胞內(nèi)Ca2+的重吸收，繼而抑制蛋白磷酸酶A2（PP2A）和蛋白磷酸酶1（PP1）的活性[21]。nNOS源性NO可能通過S-亞硝基化直接激活SERCA，或通過過氧亞硝基-依賴的S-谷胱甘肽化間接激活SERCA[22]。nNOS源性NO對RyR活性的影響是有爭議的，因為nNOS的基因缺失同RyR leak的增加[23]和RyR開放概率的減小[24]有關(guān)。此外，通過由α-syntrophin蛋白（SNTA1）聯(lián)合細胞膜鈣泵（PMCA4b）和心臟Na+通道（SCN5A），nNOS產(chǎn)生一個大復合體，并能被 PMCA4b緊張性抑制。nNOS同 PMCA4b在SNTA1的變異中分離，并刺激失活的nNOS進而增加S-亞硝基化的SCN5A和晚期Na+電流。因此nNOS與SCN5A-依賴型長QT間期綜合征有關(guān)[19]。越來越多的證據(jù)證明，nNOS源性NO通過靶蛋白而非鈣處理原理來調(diào)節(jié)心功能。例如，我們的前期工作和其他組的研究結(jié)果表明，nNOS控制心臟的氧化酶活性，如黃嘌呤氧化還原酶[25]和NADPH氧化酶[26]，并減輕細胞內(nèi)超氧化物和活性氧（ROS）的水平。作為活性氧（如過氧化氫）和反應性含氮物質(zhì)（RNS，如過氧亞硝酸鹽）的靶蛋白激酶/磷酸酶[27]，nNOS對離子通道活性和細胞內(nèi)鈣處理蛋白的調(diào)節(jié)可能是通過大量的轉(zhuǎn)錄后修飾，如NO-依賴的S-亞硝基化，ROS-依賴的氧化和激酶/磷酸酶依賴的磷酸化來介導的。本質(zhì)上講，nNOS源性NO的靶蛋白種類決定了下游的轉(zhuǎn)錄后修飾。此外，nNOS可能通過調(diào)節(jié)線粒體的蛋白來影響心肌的功能。已有研究指出，nNOS源性NO能抑制線粒體中的呼吸鏈，包括復合體Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ[28,29]，并減少線粒體的氧耗，影響心臟的代謝。這種調(diào)節(jié)對正?；虍惓Ｐ募」δ苡泻€是有利，還有待確定?？傊?，目前的證據(jù)表明，nNOS源性NO通過針對心肌細胞多種細胞器中蛋白的調(diào)控來影響心臟功能。

1.2 異常心臟中的nNOS 重要的是，在有心臟疾病如缺血再灌注損傷[30]、梗死[18,31]、肥大和心衰[32]的時候，心肌細胞內(nèi)的nNOS蛋白表達及活性均有所增高，并能在多方面發(fā)揮有利影響。nNOS源性NO保護心肌舒張功能，并增加β-腎上腺素的儲存，減輕左室肥大/擴張/梗死范圍，使心肌免受心律失常的損害。最近的研究證實了nNOS的上調(diào)是伴隨致病性損害和疾病發(fā)展過程中的一種早期事件。我們發(fā)現(xiàn)，在體外對單純左室在短時間內(nèi)進行血管緊張素Ⅱ處理后，顯著增加了mRNA/蛋白質(zhì)表達和nNOS的活性[26]。繼而，nNOS源性NO減少超氧化物產(chǎn)生NADPH氧化酶，并通過cGMP/PKG-依賴（和PKA-依賴）PLN-Ser16的磷酸化來促進左室舒張。類似的，在由血管緊張素Ⅱ誘發(fā)的患高血壓大鼠的左心室肌細胞中，nNOS蛋白表達和活性得到了增高（這是由于體內(nèi)灌注4周血管緊張素Ⅱ并不能引起心室肥大，且不能通過超聲心動圖檢測出心肌舒縮功能的異常）。nNOS不能改變心肌收縮力或LTCC的活性，但能夠通過cGMP/PKG-依賴的磷酸化TnI-Ser23/24和cMyBP-C-Ser273，進而通過肌絲鈣敏感性來促進左室舒張[33]。有趣的是，在患高血壓大鼠的左室細胞中，PLN-Ser16有所增加，并且Ca2+的瞬變減少（通過SERCA重吸收Ca2+）也變得更快。這些改變并不是依賴于nNOS或者cGMP/PKG-依賴的信號傳導方式。在有些研究中，對大鼠心肌灌注血管緊張素Ⅱ，3 d和6 d后，nNOS蛋白表達得到了增強[34,35]。這些結(jié)論證實了nNOS的上調(diào)在疾病發(fā)展中是一個早期事件，并且nNOS在應激條件下對心臟起保護作用。此外，在大鼠患高血壓前期（青年自發(fā)性高血壓），星狀神經(jīng)節(jié)細胞中nNOS的蛋白表達和活性有所減少，細胞內(nèi)的［Ca2+］i有所增多。相反，nNOS通過一個異常去甲腎上腺素激活的細胞特異性的載體傳遞到交感神經(jīng)元，以降低［Ca2+］i[36]。nNOS 作為調(diào)節(jié)交感神經(jīng)傳遞的重要方式[37]，這些結(jié)果表明，在高血壓早期自主神經(jīng)系統(tǒng)和收縮心肌中的nNOS可能協(xié)同促進心臟保護效應。在人類擴張性心肌病和鼠類心肌梗死心肌中，nNOS的上調(diào)與RyR相互作用的減少和與Cav3在心肌細胞質(zhì)膜結(jié)合的增多有關(guān)[18,38]。這種定位可能增加其在細胞膜對Ca2+流量的控制或者抑制NADPH氧化酶。的確，nNOS與Cav3的聯(lián)合隨著缺血再灌注損傷和nNOS減弱ICa的β腎上腺素興奮（通過增加S-亞硝基化的LTCC）而增強。nNOS還能減弱瞬變的Ca2+和SR中 Ca2+的含量，尤其是在雌鼠中[38]。這同樣表明，冠脈結(jié)扎后發(fā)生的心律失常中，nNOS通過S-亞硝基化、調(diào)節(jié)關(guān)鍵鈣處理蛋白（例如LTCCα1c、SERCA2和RyR2）的活性，減少Ca2+流入和舒張/收縮時Ca2+的瞬變振幅來保護心臟[31]。此外，nNOS通過加強對外周迷走神經(jīng)敏感的心率的調(diào)節(jié)來發(fā)揮抗心律失常作用[7]。事實上，對迷走神經(jīng)的刺激能增加左室nNOS產(chǎn)生NO，并發(fā)揮抗心律失常作用[39]。已知在心臟病中，全身的交感神經(jīng)興奮性增高，而nNOS通過迷走神經(jīng)調(diào)控心率在減少致命性室性心律失常上有著重要的臨床意義[40]。

在患病心臟中的線粒體和肌絲中，nNOS-依賴的傳導路徑的作用還并不是很清楚。有條件的nNOS過量表達小鼠中，nNOS蛋白表達在線粒體中有所提高，NO對心臟的效果也有所增強。因此，nNOS通過減少線粒體活性氧和黃嘌呤氧化還原酶（XOR）來減少氧化應激。nNOS還通過伴隨缺血再灌注過程減輕心肌梗死面積[41]。有趣的是，在類似的小鼠模型有條件的過度表達nNOS中，nNOS作用位置、下游靶蛋白、作用機理這些方面與之存在鮮明的對比。例如，主要位于SR的過表達的nNOS增加了 LTCC的活性和 PLN-SER16，并導致［Ca2+］i的加速衰減。相反，漿膜中過表達的nNOS能增加其與LTCC的結(jié)合，降低LTCC活性，減少對PLNSER16的影響，因此減緩了［Ca2+］i的衰減。這些結(jié)果進一步印證了nNOS的空間定位和其下游靶蛋白決定心肌疾病類型的重要性。

2 nNOS基因、轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)

2.1 nNOS基因、多啟動子/轉(zhuǎn)錄和nNOS剪接變異體 人類的nNOS（或者叫NOS1）基因位于12號染色體q24.2，這個位點分布在一個240 kb的區(qū)段中。負責轉(zhuǎn)錄出mRNA那條核苷酸序列由29個外顯子編碼，并翻譯出包含1434個氨基酸、推測質(zhì)量約為160 kDa的蛋白質(zhì)[29]。nNOS基因有9種獨特的外顯子1，在不同組織中的轉(zhuǎn)錄起始發(fā)生變異，每一個轉(zhuǎn)錄均從5′端的一個特別區(qū)段表達而來。這使得nNOS的轉(zhuǎn)錄/表達調(diào)控變得極其復雜。本質(zhì)上說，nNOS基因多樣的結(jié)構(gòu)各異的mRNA由大量的轉(zhuǎn)錄單元來轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)生多樣mRNA的機制包括分散啟動子、可變剪接、盒式外顯子、缺失或插入和可選擇性多聚腺苷酸化信號的運用。在神經(jīng)元和肌肉中，nNOS啟動子都被聚集在外顯子2基因區(qū)段的上游。多種mRNA是由不同酶特異性和結(jié)構(gòu)特點編碼nNOS蛋白而成的[42]。位于下游外顯子2的啟動子的啟動，使轉(zhuǎn)錄因子得以表達。它們利用多個轉(zhuǎn)錄起始部位，并產(chǎn)出截短蛋白（如nNOSβ或nNOSγ）；nNOSβ（而不是 nNOSγ）保留酶的活性，但是缺乏一種主要的PDZ蛋白——蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，而它負責使nNOS作用于漿膜或核膜[43]。不同的轉(zhuǎn)錄起始、加工處理、翻譯效率和穩(wěn)定性、定位使得nNOS的轉(zhuǎn)錄子容易受到多種因素的影響并產(chǎn)生多種亞型。到目前為止，5種結(jié)合的變異體已被發(fā)現(xiàn) （nNOSα、nNOSβ、nNOSγ、nNOSμ 和 nNOS2）。然而對它們在心肌中的特異性、功能相關(guān)性和機制方面卻知之甚少?，F(xiàn)已知，nNOSα和nNOSμ含有PDZ結(jié)構(gòu)域，并與α-syntrophin相連定位于質(zhì)膜上。nNOSμ相比于nNOSα，插入了34個氨基酸，這使得它與nNOSα在電子傳遞速率、通過CaM調(diào)節(jié)電子流速、形成血紅素-亞硝基復合體這些方面有所不同[44]。nNOSβ和nNOSγ不含PDZ結(jié)構(gòu)域，并且可能位于細胞質(zhì)中。

2.2 非心肌組織中nNOS基因的調(diào)控 盡管在左室或心房發(fā)生各種病理生理損害時，nNOS的mRNA和蛋白的表達有所增加，但是，心臟nNOS的基因調(diào)控（轉(zhuǎn)錄和翻譯機制）卻是很少的。理解nNOS的轉(zhuǎn)錄調(diào)控對于明確剪接變異體在正常心血管生理或疾病時的轉(zhuǎn)錄/翻譯是很重要的。在神經(jīng)元、骨骼肌、血管、胃腸道平滑肌，nNOS轉(zhuǎn)錄的調(diào)控通過轉(zhuǎn)錄因子如 CREB、SP/ZNF家族或 NF-kB來實現(xiàn)[29]。在神經(jīng)細胞中，CREB通過結(jié)合Sirt-1染色質(zhì)來調(diào)節(jié)sirtuin的轉(zhuǎn)錄；繼而Sirt-1被招募到DNA并提高CREB-依賴的nNOS的表達[45]。對人類nNOS基因5′端區(qū)域序列的分析揭示了AP-2、TEF-1/MCBF、CREB/ATF/cFOS、Ets、NF-1 和 NF-kB-like序列可能的結(jié)合位點[29]。所有這些轉(zhuǎn)錄因子均存在于心肌細胞，因此這些信息為尋找參與影響心肌細胞nNOS基因調(diào)控的機制提供了有價值的線索。

同樣，nNOS在非心臟組織中的存在也能增加對nNOS剪接變異體和其在心肌中的功能的了解。例如，眾所周知，在動物模型和人類中，骨骼肌運動后nNOSμ均發(fā)生上調(diào)，nNOSμ的mRNA表達和蛋白質(zhì)水平同運動后血管再生相關(guān)[46]。最近發(fā)現(xiàn)nNOSβ作用于高爾基體，并且在維持鼠類骨骼肌和運動后肌肉力量上起著至關(guān)重要的作用，對于增加肌肉抗疲勞也同樣起著至關(guān)重要的作用[47]。這些結(jié)果表明，nNOS剪接變異體的功能意義也適用于骨骼肌各種功能的調(diào)節(jié)。然而，nNOS變異體（nNOSα、nNOSβ和nNOSμ）在心肌細胞中是否存在特有的功能還并不是很清楚。在處于孕晚期大鼠的腎皮質(zhì)中，nNOSβ蛋白表達有所提升，而nNOSα卻有所下降；因此抗氧化能力有所提升，使得腎皮質(zhì)在氧化應激中得到保護。此外，高鹽飲食（0.4%～4.0%）增加nNOSβ在大鼠腎臟內(nèi)髓集合管的表達遠遠多于nNOSα[48]。nNOSβ的這種變化同樣發(fā)生在右腎切除、左腎2/3切除或梗死的模型和腎移植模型中[49]。同樣的，在小鼠近端結(jié)腸神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)弛緩素能增加nNOSβ的表達，但是減少nNOSα在平滑肌細胞的表達，致使肌張力減小，并增加肌肉隨意收縮的幅度[50]。這進一步表明了nNOS剪接變異體在應對病理生理刺激時有獨特的調(diào)節(jié)作用。

3 展望未來：nNOS在患病的心臟中可能產(chǎn)生的影響

在正常心臟中，nNOS調(diào)節(jié)基礎心肌收縮和舒張，這對于阻止疾病進展和致命性心臟病的發(fā)展來說是一種重要的保護機制。nNOS調(diào)控的轉(zhuǎn)錄后修飾是新興的研究方向，并能增加我們對nNOS在心血管疾病中發(fā)揮重要作用的理解。在多種生理系統(tǒng)中，nNOS基因調(diào)控對于病理生理的刺激、獨特的nNOS剪接變異體和各自的區(qū)域/結(jié)合伴侶這些方面是已知的，但是，在心臟方面認知的提高，還需要有效治療策略的進一步發(fā)展。

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Molecular mechanisms of nNOS in cardiac function and pathophysiology

Neuronal nitric oxide synthase；Nitric oxide；Cardiac function；Signaling pathways

國家自然科學基金（項目編號：81460039）；吉林省科技廳青年科研基金（項目編號：20140520024JH）；吉林省衛(wèi)生廳青年科研基金（項目編號：2014Q043）

133000 吉林省延邊市，延邊大學附屬醫(yī)院心內(nèi)科

金春子，E-mail：15526771826@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.08.001

R54

A

1672-5301（2016）08-0673-06

2016-01-17）