正交實驗法優(yōu)選九味阿膠膏提取工藝研究

張潔　李成網(wǎng)

【摘要】目的優(yōu)選九味阿膠膏的最佳提取工藝。方法以黃芪甲苷的含量為指標，ELSD-HPLC法測定指標成分含量，采用正交試驗設(shè)計考察加水倍數(shù)（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數(shù)（C）三個因素的影響，確定九味阿膠膏的最佳提取工藝。結(jié)果煎煮因素按影響大小依次是煎煮次數(shù)（c）>加水倍數(shù)（A）>加醇倍數(shù)（B），最佳提取工藝條件為：A282C3。結(jié)論該制備工藝合理可行。

【關(guān)鍵詞】九味阿膠膏；正交試驗法；ELSD-HPLC；黃芪甲苷

【中圖分類號】R284.1 【文獻標識碼】B 【文章編號】2095-0616（2015）21-51-03

九味阿膠膏是安徽省中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床使用多年的經(jīng)驗膏方。該方由阿膠、黃芪、山楂、枸杞等九味中藥材加工精制而成。具有補肝腎，養(yǎng)精血，益氣健脾，養(yǎng)心安神，滋陰潤肺，溫經(jīng)散寒之功效。臨床上主要用于治療氣血兩虛證。本文采用正交試驗法，以黃芪甲苷的含量為指標，對九味阿膠膏的提取工藝進行考察，篩選最佳的提取工藝。

1儀器與試藥

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津），Sedex75 ELSD檢測器；梅特勒xp56型百萬分之一電子天平（瑞士）；梅特勒AG285電子分析天平（瑞士），黃芪甲苷（110781-200512）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），水（超純水），其他試劑均為分析純。黃芪等藥材購自合肥市中藥飲片廠義和堂藥店。

2方法

2.1正交工藝設(shè)計

選擇加水倍數(shù)（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數(shù)（C）為考察因素，種因素取3個水平，因素水平設(shè)置，見表1。

2.2黃芪甲苷含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Shim Pack CLCODS柱（250×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（32：68）；柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；ELSD漂移管溫度為83℃；氮氣壓力為2.0bar；理論板數(shù)按黃芪甲苷計算應(yīng)不低于4000。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品（110781-200512）10.077mg，加甲醇溶解并定容至25mL，搖勻，即得。

2.2.3供試品溶液的處理 按九味阿膠膏處方，稱取黃芪17.7g，山楂15g及其他煎煮藥材共111g，按L₉（34）正交表（見表2），以水平因素表（見表1）規(guī)定的加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)煎煮，濾過，合并濾液，適當濃縮并定容至500mL量瓶，搖勻。精密量取正交試驗1～9號溶液各25mL，置分液漏斗中，加水飽和的正丁醇溶液25mL，振搖提取4次，分取正丁醇液，合并4次提取液，加2%氫氧化鈉溶液25mL，萃取2次，棄去氫氧化鈉溶液，正丁醇液再加水25mL，萃取2次，棄去水液，正丁醇液水浴揮干，殘渣以適量甲醇溶解，定量轉(zhuǎn)移置5mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm濾膜濾過，即得正交試驗的9份供試品溶液。

2.2.4對照品溶液線性關(guān)系考察分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液（0.4031mg/mL）2、4、8、12、16、20μL，依法測定峰面積，以黃芪甲苷進樣質(zhì)量的常用對數(shù)值為橫坐標，黃芪甲苷峰面積的常用對數(shù)值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：IgA=1.38551gC+1.9782（r=0.9998，n=6）。結(jié)果表明：黃芪甲苷的質(zhì)量在0.8062～8.062μg之間質(zhì)量的常用對數(shù)值與峰面積的常用對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液（0.4031mg/mL）20μL，連續(xù)進樣6次，依法測定峰面積積分值，計算，RSD=0.65%，說明儀器的精密度良好。

2.2.6供試品溶液的測定依照上述色譜條件，精密吸取正交試驗1～9號供試品溶液各20μL，依法測定。色譜圖見圖1～2。

3結(jié)果

3.1正交試驗

根據(jù)上述色譜條件，依次測定9份供試品溶液中黃芪甲苷的峰面積，將峰面積積分值的常用對數(shù)代入標準曲線，計算黃芪甲苷的含量，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由方差分析結(jié)果可知，各因素顯著性差異依次為C>A>B，即煎煮次數(shù)>加水倍數(shù)>煎煮時間。方差分析顯示因素A和因素C的影響具有顯著性差異，其中A3>A2>A1，C3>C2>C1，因素B的影響無顯著性差異。因此，最終確定的最佳提取工藝為A382C3，即加10倍量水，煎煮3次，每次1.5h。

3.2驗證試驗

依照處方，稱取黃芪17.7g，山楂15g及其他煎煮藥材共111g，按上述優(yōu)選的工藝條件煎煮，平行試驗3次，結(jié)果黃芪甲苷平均含量為16.0212mg，RSD=1.39%。表明工藝條件穩(wěn)定可行。

4討論

九味阿膠膏由九味中藥材組成，阿膠為方中君藥，但因阿膠是烊化后與清膏合并，不參與煎煮，故本文未選擇君藥的有效成作為考察指標。而黃芪為方中成藥，其主要有效成分有多糖類、黃酮類、皂苷類和氨基酸等。2010版中國藥典收載了黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定，但由于毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量較低，僅為黃芪甲苷含量的一半，且黃酮類成分容易被干擾，故本研究未采用毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為含量測定指標。ELSD-HPLC法測定中藥復(fù)方中黃芪甲苷含量的論文報道較多，在參考文獻的基礎(chǔ)上，本研究選擇黃芪甲苷作為含量測定的查考指標。在正交試驗之前，還考察了藥材吸水率實驗，平均吸水率為1.1倍，故第一次煎煮的加水量多加1.1倍的水。

目前，大多數(shù)中醫(yī)院使用的院內(nèi)制劑工藝都比較簡單，多為生藥粉制備的丸劑或簡單的水煎劑，本研究方法和結(jié)果可以給醫(yī)院的制劑工藝優(yōu)化提供參考和依據(jù)，也可以給含黃芪的復(fù)方制劑的含量測定提供參考。

根據(jù)黃芪甲苷含量的測定結(jié)果，煎煮時間對結(jié)果的影響未見顯著性差異，故從節(jié)約成本的角度考慮，工業(yè)化生產(chǎn)時可選擇只煎煮1h。最后的驗證試驗也很好的說明了，本文篩選的工藝條件是合理的，可重復(fù)的，適合工業(yè)化生產(chǎn)的。endprint