植物組培技術(shù)常見問題及其預(yù)防措施

任輝麗

摘 要 主要對(duì)植物組培技術(shù)中常見問題如污染、材料褐變和玻璃化現(xiàn)象等方面進(jìn)行闡述，并在此基礎(chǔ)上提出相應(yīng)對(duì)策。

關(guān)鍵詞 植物組織培養(yǎng)技術(shù)；常見問題；預(yù)防措施

中圖分類號(hào)：S722 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1673-890X（2015）36-0-02

植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為當(dāng)代生物科學(xué)中最有生命力的一門學(xué)科，應(yīng)用廣泛，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥業(yè)等行業(yè)均有涉及，且產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，但由于組培育苗操作程序復(fù)雜，各種技術(shù)難題仍受到廣大科研工作者的困擾，如污染、材料褐變、瓶苗玻璃化等常見問題屢見不鮮，試驗(yàn)組培成功的植物多樣，但利用組培規(guī)?；a(chǎn)的植物并不多見，下面對(duì)該技術(shù)中常見的三大問題（污染、材料褐變和玻璃化現(xiàn)象）及預(yù)防措施進(jìn)行闡述[1-4]。

1 污染問題

1.1 污染原因

污染是指在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基或培養(yǎng)材料上滋生真菌、細(xì)菌等微生物，使培養(yǎng)材料不能正常生長(zhǎng)和發(fā)育的現(xiàn)象。在實(shí)驗(yàn)室及規(guī)模化生產(chǎn)中，組織培養(yǎng)中污染時(shí)有發(fā)生，造成污染的原因主要有以下幾點(diǎn)：培養(yǎng)基以及在培養(yǎng)過程中的各種器具滅菌不徹底；培養(yǎng)時(shí)外植體消毒不徹底；接種和培養(yǎng)環(huán)境不清潔；接種人員無菌操作不嚴(yán)格；培養(yǎng)容器原因，包括蓋子和封口膜等。此外，材料滅菌不徹底同樣也會(huì)造成成批接種材料被細(xì)菌污染，而且培養(yǎng)過程不嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程也是造成細(xì)菌污染的重要原因。培養(yǎng)環(huán)境不清潔、超凈工作臺(tái)的過濾裝置失效、培養(yǎng)容器的口徑過大以及封口膜破損等主要引起真菌污染[5-9]。

1.2 污染的預(yù)防措施

1.2.1 滅菌徹底

嚴(yán)格各個(gè)環(huán)節(jié)的操作流程，特別是培養(yǎng)基及操作過程中的各種器具必須要嚴(yán)格滅菌。培養(yǎng)基滅菌有以下要求：耐高溫培養(yǎng)基在121～123 ℃條件下滅菌20～30 min。其次，接種用的器具除了經(jīng)過高溫霉菌外，在接種的過程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精燈火焰上灼燒滅菌，特別是在不慎接觸到污染物時(shí)，極易由于器具引起污染。最后，對(duì)于被污染的培養(yǎng)瓶和器皿要單獨(dú)浸泡，單獨(dú)清洗，有條件的滅菌后再清洗[10-14]。

1.2.2 選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w

要認(rèn)真地選擇外植體，減少外植體上的帶菌量。一般來說，培養(yǎng)時(shí)，田間生長(zhǎng)的材料帶菌會(huì)比在溫室生長(zhǎng)材料多；從帶菌數(shù)量多少來看：多年生木本材料多于一二年生的草本材料；老的材料多于幼嫩的材料。

莖尖外植體培養(yǎng)時(shí)注意的是：預(yù)培養(yǎng)，在室內(nèi)或無菌條件下進(jìn)行；沖洗，用水沖洗后插入無糖的營(yíng)養(yǎng)液；發(fā)枝，以新抽的嫩枝作為外植體；暗培養(yǎng)后取材，要求在無菌條件下暗培養(yǎng)，從抽出的徒長(zhǎng)黃化枝條上取材。以上措施均可明顯減少污染。

1.2.3 外植體消毒

外植體上可能附著外生菌和內(nèi)生菌。外生菌可以通過表面消毒方法殺滅；而內(nèi)生菌生長(zhǎng)的植物材料內(nèi)部，表面消毒難以殺滅，培養(yǎng)一段時(shí)間后，病原菌自傷口處滋生。防治內(nèi)生菌首先將欲取材的植株或枝條放在溫室或無菌培養(yǎng)室內(nèi)預(yù)培養(yǎng)，再在培養(yǎng)液中添加一些抗生素或消毒劑。

1.2.4 環(huán)境消毒

環(huán)境消毒在降低培養(yǎng)污染率中尤為重要，且在高溫高濕的條件下污染率會(huì)顯著增高，需要注意到的是，必須定期進(jìn)行熏蒸或噴霧消毒。各類消毒方法因人因環(huán)境而異：高錳酸鉀和甲醛熏蒸對(duì)人體有一定傷害，但是其消毒效果明顯，一般每年熏蒸2～3次。日常推薦使用的紫外線照射消毒以及臭氧消毒機(jī)消毒同樣可以有效降低污染率，而且對(duì)人體的傷害也不大。

1.2.5 嚴(yán)格無菌操作

在接種時(shí)，要嚴(yán)格無菌操作，避免人為因素造成污染。為了使超凈工作臺(tái)有效工作，防止操作區(qū)域本身帶菌，要定期對(duì)過濾器進(jìn)行清洗和更換。

2 材料褐變

在植物組織培養(yǎng)中，由于組織中多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞酚類物質(zhì)被氧化而產(chǎn)生棕褐色醌類物質(zhì)，從而出現(xiàn)了褐變這種現(xiàn)象。它嚴(yán)重地影響外植體的脫分化、再分化和生長(zhǎng)，對(duì)培養(yǎng)過程的損失顯而易見[15-17]。

2.1 產(chǎn)生機(jī)理

產(chǎn)生的機(jī)理分為2種：非酶促褐變和酶促褐變。在植物組織培養(yǎng)中，由酶促褐變引起的褐變被認(rèn)為是主要根源，其中引起褐變的酶有很多種，主要是由多酚氧化酶PPO、過氧化物酶POD、苯丙氨酸解氨酶等組成。在初次培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過程中，經(jīng)過測(cè)定試管苗的褐變程度和PPO的活性，有研究表明PPO活性與褐變程度的高低具有顯著的相關(guān)性。

2.2 抑制措施

在抑制褐變的方法上，目前已經(jīng)有了諸多有效的處理措施，主要從以下方面來展開：去氧化；抑制特異性酶；通過有效手段控制或減少中間產(chǎn)物的產(chǎn)生。具體措施如下。

2.2.1 預(yù)處理措施

外植體材料的預(yù)處理：沖洗外植體，在2～5 ℃的低溫下處理12～24 h，升汞或酒精消毒，取外植體浸泡10 min后培養(yǎng)（浸泡時(shí)采用0.1%漂白粉溶液）。

2.2.2 取材措施

在外植體的取材過程中需要注意以下幾點(diǎn)：褐變程度較小的品種和部位更適宜；幼苗褐變程度低；夏季材料褐變趨向性更明顯；早春和秋季的材料更合適取材。

2.2.3 培養(yǎng)基的質(zhì)量控制

培養(yǎng)基的狀態(tài)和類型與褐變程度具有明顯的相關(guān)性，因此，更要注意對(duì)培養(yǎng)基的成分的質(zhì)量控制，嚴(yán)格把關(guān)，減少污染率。

2.2.4 抑制劑和吸附劑的選擇

在長(zhǎng)期的組織培養(yǎng)過程中，目前已經(jīng)廣泛的使用了褐變抑制劑及部分吸附劑，目的是最大程度的降低褐變程度，以降低不必要的經(jīng)濟(jì)損失。由此，可以在培養(yǎng)基中加入PPO抑制劑以及部分抗氧化劑，如偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸等。常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮PVP。

2.2.5 細(xì)胞篩選措施

為剔除易褐變的細(xì)胞，經(jīng)常性進(jìn)行細(xì)胞篩選在組織培養(yǎng)過程中是很有必要的一項(xiàng)措施，在外植體接種環(huán)節(jié)里，在接種后的1～2 d立即轉(zhuǎn)移，使其再次轉(zhuǎn)移到其他新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，降低培養(yǎng)物的毒害作用，經(jīng)過連續(xù)轉(zhuǎn)移（一般5～6次），褐變程度顯著下降[18]。

3 玻璃化問題

“玻璃苗”在組織培養(yǎng)過程中不可避免，而且在大規(guī)模培養(yǎng)中玻璃化問題亟待解決。

3.1 玻璃化形成的機(jī)理

植物組織培養(yǎng)過程中，玻璃化現(xiàn)象是特有的一種生理性病變，目前有關(guān)玻璃化形成機(jī)理方面的研究主要集中在水勢(shì)過高的影響，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑平衡問題和礦質(zhì)元素平衡供應(yīng)問題3個(gè)方面，普遍認(rèn)為是培養(yǎng)環(huán)境中的各方面因子共同作用導(dǎo)致植物組織新陳代謝紊亂，進(jìn)而出現(xiàn)“玻璃苗”。

3.2 預(yù)防措施

目前主要采取以下幾方面措施來預(yù)防玻璃化的發(fā)生。

3.2.1 外植體的選擇

優(yōu)先考慮不易玻璃化的基因型及部位，且頂芽部位有助于減少玻璃苗的產(chǎn)生。

3.2.2 培養(yǎng)基成分的調(diào)整

第一，外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的添加很有必要。如添加IAA、GA3、ABA，可以減少玻璃苗的出現(xiàn)。第二，合理調(diào)整成分濃度。如降低銨態(tài)氮濃度的同時(shí)提高硝態(tài)氮含量，在預(yù)防玻璃苗的大規(guī)模生產(chǎn)實(shí)踐中成效顯著。第三，調(diào)整適宜瓊脂濃度。由于瓊脂雜質(zhì)中的部分元素（如Ca2+、Mg2+等）含量會(huì)影響培養(yǎng)基中礦質(zhì)元素的合理比例，因此一般瓊脂濃度不低于0.8%，并且針對(duì)條狀瓊脂會(huì)提前浸泡24 h；第四，添加有機(jī)物根皮苷、添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑合成前體如ACC或添加適宜濃度的活性炭等均可有效地抑制玻璃苗形成。

3.2.3 改變培養(yǎng)的環(huán)境條件

光照條件：盡量采取光照培養(yǎng)，在適宜的光照時(shí)間內(nèi)適當(dāng)提高光照強(qiáng)度。溫度條件：根據(jù)不同材料將溫度調(diào)整在適宜范圍，一般將溫度控制在24～28℃。濕度條件：為降低培養(yǎng)容器內(nèi)的空氣相對(duì)濕度，必要的通氣措施尤為重要，同時(shí)要注意改善氧氣供應(yīng)狀況，因此使用可調(diào)節(jié)通氣的組培專用瓶可以達(dá)到良好的通氣效果。pH值：一般條件下調(diào)整pH值于7.0左右。其他條件：繼代培養(yǎng)每間隔4～5代，一般20 d為一個(gè)周期，培養(yǎng)時(shí)采用無激素的培養(yǎng)基，可先培養(yǎng)一個(gè)周期，再用1/2含量激素的培養(yǎng)基進(jìn)行過度，過度一個(gè)周期后，再用原培養(yǎng)基培養(yǎng)。

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（責(zé)任編輯：趙中正）