NPPB在大鼠肝細(xì)胞分離中的應(yīng)用效果及其機(jī)制

梁珊，石詠中，聶盛丹，黃韌，徐偉，李灼日(湖南省人民醫(yī)院，長沙410005)

NPPB在大鼠肝細(xì)胞分離中的應(yīng)用效果及其機(jī)制

梁珊，石詠中，聶盛丹，黃韌，徐偉，李灼日
(湖南省人民醫(yī)院，長沙410005)

摘要:目的觀察5-硝基-2( 3-苯丙胺) -苯甲酸( NPPB)在大鼠肝細(xì)胞分離中的應(yīng)用效果，并探討其可能的機(jī)制。方法將12只SD大鼠隨機(jī)分為觀察組和對照組各6只。兩組分離肝細(xì)胞后，采用改良的四步膠原酶分離技術(shù)進(jìn)行消化，制備肝細(xì)胞懸液。觀察組在使用灌注液進(jìn)行消化的過程中加入NPPB。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算肝細(xì)胞收獲量，PAS染色后計(jì)算純度，0.4%臺盼藍(lán)染色后計(jì)算成活率。細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h后，采用全自動生化分析儀檢測上層清液中的白蛋白( ALB)、ALT。采用紫外線分光光度法檢測LDH吸光度，并計(jì)算LDH釋放率。采用RT-PCR法檢測細(xì)胞線粒體氯通道蛋白4( CLIC4) mRNA表達(dá)，Western blotting法檢測細(xì)胞CLIC4蛋白表達(dá)。結(jié)果觀察組與對照組肝細(xì)胞收獲量分別為( 4.41±0.20)×108、( 4.40±0.26)×108個(gè)，純度分別為90%±1%、89%±2%，成活率分別為88%±2%、85%±1%;兩組比較，P均＞0.05。觀察組與對照組ALB分別為( 43.8± 5.0)、( 25.2±3.0) g/L，ALT分別為( 47.8±6.0)、( 104.3±11.7) U/L，LDH釋放率分別為21.0%±2.7%、34.0% ±2.4%;兩組比較，P均＜0.05。觀察組與對照組CLIC4 mRNA相對表達(dá)量分別為1.01±0.02、1.62±0.01，CLIC4蛋白相對表達(dá)量分別為0.38±0.02、0.52±0.03;兩組比較，P均＜0.05。結(jié)論肝細(xì)胞分離過程中應(yīng)用NPPB可以在不影響分離細(xì)胞收獲量、純度及成活率的情況下，減輕肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能損傷，其機(jī)制可能與抑制CLIC4表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:肝細(xì)胞分離;氯通道阻斷劑; 5-硝基-2( 3-苯丙胺) -苯甲酸;氧化應(yīng)激;線粒體氯通道蛋白4

Application effect and mechanism of NPPB during hepatocyte isolation of rats

LIANG Shan，SHI Yong-zhong，NIE Sheng-dan，HUANG Ren，XU Wei，LI Zhuo-ri

( People's Hospital of Hunan Province，Changsha 410005，China)

Abstract:Objective To observe the application effect and mechanism of 5-nitro-2-( 3-phenylpropylamino) benzoate acid( NPPB) during the hepatocyte isolation of rats.Methods Twelve Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups，6 in each group: the observation group and the control group，and the hepatocytes of the two groups were isolated by a collagenase perfusion with a modified four-step technique.In addition，we added NPPB to the observation group in the process of using perfusion fluid for digestion.The purity was determined by PAS staining，the hepatocyte yield was detected by cell count technique and the survival rate were determined after 0.4% Trypan blue staining.Cells were cultured in serum-free medium for 24 h，and we collected the supernatant at different times after isolation.LDH release rate content was detected，and the levels of ALB and ALT were detected by automatic biochemistry analyzer.The mRNA level of mitochondrial chloride intracellular channel 4 ( CLIC4) was determined by RT-PCR.CLIC4 protein level was detected by Western blotting.Results The hepatocyte yields of the observation group and the control group were( 4.41±0.20)×108and ( 4.40±0.26)×108，respectively; the purity was 90%±1% and 89%±2%，respectively; and the survival rates were 88%±2% and 85%±1%，respectively.Significant difference was found between the two groups ( all P＜0.05).The levels of ALB in the observation group A and the control group were ( 43.8±5.0) and ( 25.2±3.0) g/L，the levels of ALT were ( 47.8±6.0) and ( 104.3±11.7) U/L，and the release rates of LDH were 21.0%±2.7% and 34.0%± 2.4%，respectively; and significant difference was found between the two groups ( all P＜0.05).The relative expression levels of CLIC4 mRNA in the observation group and the control group were 1.01±0.02 and 1.62±0.01，the protein ex-

pression levels of CLIC4 were 0.38±0.02 and 0.52±0.03，respectively; and significant difference was found between the two groups ( all P＜0.05).Conclusions During the hepatocyte isolation，the application of NPPB does not affect the yield，purity and the survival rate and alleviates the membranous structure and the injury of function，which may be related with the inhibition of protein expression of CLIC4.

Key words:hepatocyte isolation; chloride channel blocker; 5-nitro-2-( 3-phenylpropylamino) benzoate acid; oxidative stress; mitochondrial chloride intracellular channel 4

生物工程學(xué)技術(shù)的進(jìn)步使肝細(xì)胞移植( HCT)有望成為臨時(shí)或較長期肝支持治療的有效方法。獲得大量高活力的游離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是HCT成功的先決條件［1，2］，其中分離技術(shù)是最關(guān)鍵的一步。線粒體氯通道蛋白4( CLIC4)是一種胞內(nèi)氯通道蛋白，主要分布在高爾基體、線粒體、細(xì)胞核等部位;其表達(dá)上調(diào)參與代謝/氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷過程，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3，4］。2010年1月～2013年1月，我們在大鼠肝細(xì)胞分離過程中應(yīng)用氯通道阻斷劑5-硝基-2( 3-苯丙胺) -苯甲酸( NPPB)，觀察其對分離肝細(xì)胞存活率及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料8～10周齡的SD大鼠12只，體質(zhì)量300～350 g，雌雄不限，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。Ⅳ膠原酶、臺盼藍(lán)、TRIzol試劑盒均購于Invitrogen公司，抗CLIC4多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購于美國Santa Cruz公司。

1.2肝細(xì)胞分離及干預(yù)大鼠飼養(yǎng)于清潔環(huán)境中，自由進(jìn)食水，12 h晝夜生活節(jié)律。按照隨機(jī)數(shù)字表法將12只大鼠隨機(jī)分為觀察組和對照組，各6只。兩組均參照以往的研究［5］行肝細(xì)胞分離，采用改良的四步膠原酶分離技術(shù)進(jìn)行消化，觀察組在使用灌注液進(jìn)行消化的過程中加入100 μmol/L的NPPB。消化完成后進(jìn)行提純，取下肝臟，于4℃含Hank's液的平皿中剪碎、過濾，DMEM洗滌; 500 r/min離心2 min，棄上清，向沉淀肝細(xì)胞中加入4℃William'E培養(yǎng)液，制備成肝細(xì)胞懸液。

1.3相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1肝細(xì)胞收獲量、純度、成活率兩組均參照以往的研究［5］，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算肝細(xì)胞收獲量，PAS染色后計(jì)算純度，0.4%臺盼藍(lán)染色后計(jì)算成活率。

1.3.2肝細(xì)胞功能取成活率90%以上的肝細(xì)胞，將密度調(diào)至5×105個(gè)/mL，接種于6孔板的William'E培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)。最初4 h換液1次(采用有血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng))，后改為24 h換液1次(采用無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng))。細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h后，收集上層清液，采用全自動生化分析儀檢測白蛋白( ALB)、ALT。

1.3.3肝細(xì)胞LDH釋放率細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h后，收集0.1 mL培養(yǎng)液，在堿性條件下用2，4-二硝基苯肼顯色，采用紫外分光光度法于440 nm處讀取LDH吸光度。再加入1 mL含70%乳酸鈉基質(zhì)液和0.2 mg的輔酶Ⅰ充分反應(yīng)，獲得相應(yīng)細(xì)胞裂解液采用同樣的方法檢測其LDH吸光度。肝細(xì)胞LDH釋放率=培養(yǎng)液LDH吸光度/相應(yīng)細(xì)胞裂解液LDH吸光度×100%。

1.3.4肝細(xì)胞CLIC4 mRNA表達(dá)采用RT-PCR法。無血清培養(yǎng)24 h后，采用TRIzol試劑提取兩組細(xì)胞總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。CLIC4及內(nèi)參基因GAPDH的引物序列、擴(kuò)增長度及退火溫度見表1。30個(gè)循環(huán)后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。電泳條帶密度=灰度×面積，CLIC4 mRNA相對表達(dá)以CLIC4與GAPDH電泳條帶密度的比值表示。

表1　 CLIC4及內(nèi)參基因GAPDH的引物序列、擴(kuò)增長度及退火溫度

1.3.5肝細(xì)胞CLIC4蛋白表達(dá)采用Western blotting法。提取兩組細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。應(yīng)用濕轉(zhuǎn)膜法，穩(wěn)流300 mA，2 h后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，PBST洗3次。加入1∶2 000稀釋的抗CLIC4多克隆抗體4℃過夜;洗膜后，加入1∶6 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，于37℃條件下孵育1 h。再次洗膜后，用ECL發(fā)光試劑盒暗室顯像，灰度掃描儀檢測相應(yīng)條帶灰度及面積。以β-actin為內(nèi)參，電泳條帶密度=灰度×面積，CLIC4蛋白相對表達(dá)以

CLIC4與GAPDH電泳條帶密度的比值表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組肝細(xì)胞收獲量、純度及成活率比較見表2。

表2　兩組肝細(xì)胞收獲量、純度及成活率比較(珔x±s)

2.2兩組肝細(xì)胞功能及LDH釋放率比較觀察組與對照組ALB分別為( 43.8±5.0)、( 25.2±3.0) g/L，ALT分別為( 47.8±6.0)、( 104.3±11.7) U/L，LDH釋放率分別為21.0%±2.7%、34.0%± 2.4%;兩組比較，P均＜0.05。

2.3兩組肝細(xì)胞CLIC4 mRNA及蛋白表達(dá)比較觀察組與對照組CLIC4 mRNA相對表達(dá)量分別為1.01 ±0.02、1.62±0.01，CLIC4蛋白相對表達(dá)量分別為0.38±0.02、0.52±0.03;兩組比較，P均＜0.05。

3　討論

HCT是治療嚴(yán)重肝衰竭、各種終末期慢性肝病和遺傳性代謝性肝病的有效方法，選擇最佳狀態(tài)的肝細(xì)胞則是保證HCT成功的重要基礎(chǔ)［1，2］。但肝細(xì)胞分離過程中普遍存在代謝及氧化應(yīng)激損傷，為HCT術(shù)后移植肝細(xì)胞無功能或功能不良的重要原因之一。

在正常情況下，LDH只存在于細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)代謝及氧化應(yīng)激引起細(xì)胞膜損傷時(shí)，LDH就會被釋放到細(xì)胞外。因此，細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平可以反映細(xì)胞損傷嚴(yán)重程度［6，7］，LDH釋放率被認(rèn)為是判斷細(xì)胞膜是否完整的重要標(biāo)準(zhǔn)［8］，而ALB水平降低以及ALT水平升高均可反映肝細(xì)胞功能損傷。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，觀察組ALB水平顯著升高，而ALT水平、LDH釋放率則顯著降低。說明NPPB可減輕大鼠肝細(xì)胞分離造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能損傷，可能與NPPB抑制膜通透小孔的開放，抑制代謝及氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞膜對大分子通透性的增加，以及在一定程度上影響細(xì)胞膜功能作用方式和途徑有關(guān)。但是兩組肝細(xì)胞收獲量、純度及成活率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明NPPB可能不影響肝細(xì)胞代謝及氧化應(yīng)激的其他作用途徑［9］。

CLIC家族是新近發(fā)現(xiàn)的、具有7個(gè)家族成員的細(xì)胞內(nèi)氯通道。Berryman等［10］發(fā)現(xiàn)，CLIC4也可能在細(xì)胞周期內(nèi)細(xì)胞骨架的形成中起著重要作用，說明CLIC4及其他CLIC蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的機(jī)制可能與傳統(tǒng)的氯通道有所區(qū)別。本研究結(jié)果顯示，觀察組CLIC4 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯低于對照組推測在肝細(xì)胞分離過程中，NPPB可能通過下調(diào)細(xì)胞CLIC4表達(dá)而在一定程度上減輕肝細(xì)胞分離造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能損傷，并不會影響分離細(xì)胞的收獲量、純度及成活率。

本研究從離子通道方面進(jìn)行研究，為獲得最佳狀態(tài)的高活性肝細(xì)胞開拓了新的路徑，同時(shí)也為臨床獲得高質(zhì)量的游離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞提供了新的理論依據(jù)。NPPB下調(diào)細(xì)胞CLIC4表達(dá)的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，比如肝細(xì)胞分離過程中氯離子通道的開放是瞬間的還是相對持續(xù)的，其動作電位是如何產(chǎn)生又是如何損傷肝細(xì)胞的，以及NPPB的關(guān)鍵作用時(shí)間點(diǎn)等。

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收稿日期:( 2015-04-17)

通信作者簡介:李灼日( 1959 -)，男，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槠胀ㄍ饪聘文懸燃膊〉脑\斷及治療。E-mail: lzr59@ hotmail.com

作者簡介:第一梁珊( 1982-)，女，主治醫(yī)生，研究方向?yàn)椴±韺W(xué)。E-mail: liangshan5460@126.com

基金項(xiàng)目:湖南省科技廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目( 2008sk2004)。

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0014-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R329

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.005