蚯蚓凍干粉對高血脂小鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用

武金霞，武建，隋思強，王靜之，張賀迎

(1. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定　071002；2. 河北大學(xué)生物工程技術(shù)研究中心，河北保定　071002)

摘　要：以高脂飼料飼喂昆明種小鼠構(gòu)建高血脂小鼠模型，灌胃給予高、中、低劑量(0.4，0.2，0.1 g/kg)蚯蚓凍干粉，每天1次，同時飼喂高脂飼料，以僅飼喂高脂飼料組小鼠為對照，共飼養(yǎng)10周.提取小鼠肝臟總RNA，應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測實驗組與對照組小鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運相關(guān)基因卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(lecithin cholesterol acyltransferase, LCAT)和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)mRNA表達水平.結(jié)果表明，蚯蚓凍干粉極顯著提高實驗組小鼠LCAT mRNA表達水平(P<0.01)，顯著提高LPL mRNA表達水平(P<0.05)，提示這是蚯蚓凍干粉能夠降低高血脂小鼠血漿膽固醇水平的原因之一.

關(guān)鍵詞：蚯蚓凍干粉；高血脂癥；膽固醇代謝；卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶；脂蛋白酯酶

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.009

蚯蚓凍干粉對高血脂小鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用

武金霞1，武建1，隋思強1，王靜之1，張賀迎2

(1. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071002；2. 河北大學(xué)生物工程技術(shù)研究中心，河北保定071002)

摘要：以高脂飼料飼喂昆明種小鼠構(gòu)建高血脂小鼠模型，灌胃給予高、中、低劑量(0.4，0.2，0.1 g/kg)蚯蚓凍干粉，每天1次，同時飼喂高脂飼料，以僅飼喂高脂飼料組小鼠為對照，共飼養(yǎng)10周.提取小鼠肝臟總RNA，應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測實驗組與對照組小鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運相關(guān)基因卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(lecithin cholesterol acyltransferase, LCAT)和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)mRNA表達水平.結(jié)果表明，蚯蚓凍干粉極顯著提高實驗組小鼠LCAT mRNA表達水平(P<0.01)，顯著提高LPL mRNA表達水平(P<0.05)，提示這是蚯蚓凍干粉能夠降低高血脂小鼠血漿膽固醇水平的原因之一.

關(guān)鍵詞：蚯蚓凍干粉；高血脂癥；膽固醇代謝；卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶；脂蛋白酯酶

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.009

收稿日期:2014-09-25

基金項目：第一作者:武金霞(1966-)，女，河北曲陽人，河北大學(xué)教授，博士，主要從事生化藥物及基因工程藥物研究.;E-mail：wjx6@163.com

通信作者:張賀迎(1966-)，男，河北大城人，河北大學(xué)副研究員，主要從事生化藥物研究.E-mail：z660128@163.com

中圖分類號：Q507

文獻標志碼：志碼：A

文章編號：編號：1000-1565(2015)02-0159-06

Abstract:Kunming mice were fed with high-level lipid feeds to establish the hyperlipidemic mice models. The mice were treated with earthworm lyophilized powder at dosages of 0.4, 0.2 and 0.1 g/kg once a day and were fed with high-level lipid feeds at the same time for 10 weeks, the mice fed only with high-level lipid feeds were as the control. The total RNA of liver was extracted, and the changes of liver lecithin cholesterol acyltransferase and lipoprotein lipase gene expression were analyzed by RT-PCR. The results indicated that earthworm lyophilized powder up-regulated lecithin cholesterol acyltransferase and lipoprotein lipase mRNA expression markedly, suggesting it was one of the reasons for reducing serum cholesterol in hyperlipidemic mice of earthworm lyophilized powder.

Regulation of earthworm lyophilized powder on reverse cholesterol

transport genes expression in hyperlipidemic mice

WU Jinxia1, WU Jian1,SUI Siqiang1, WANG Jingzhi1, ZHANG Heying2

(1. College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002,China;

2. Research Center of Bioengineering,Hebei University, Baoding 071002, China)

Key words: earthworm lyophilized powder; hyperlipidemia; cholesterol metabolism; lecithin cholesterol acyltransferase; lipoprotein lipase

蚯蚓凍干粉(earthworm lyophilized powder，ELP)是將鮮活的蚯蚓洗凈、勻漿，經(jīng)冷凍干燥得到的活性干粉，含有蚯蚓全部的活性成分，具有抑制腫瘤、降血脂、抗氧化等多種功能[1-5].前期研究表明，飼喂ELP可以顯著上調(diào)膽固醇分解代謝關(guān)鍵酶CYP7α1和載脂蛋白AI mRNA表達[6]，下調(diào)載脂蛋白B mRNA表達[7].在復(fù)雜的膽固醇代謝網(wǎng)絡(luò)中，膽固醇從外周組織向肝臟的逆向轉(zhuǎn)運(reversecholesterol transfer, RCT)，是機體排出多余膽固醇的唯一途徑，是維持膽固醇平衡的重要方式.卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(lecithin cholesterol acyltransferase, LCAT)) 是合成血漿中大部分膽固醇酯的主要酶類，作為膽固醇逆轉(zhuǎn)運中的一個關(guān)鍵因子, 被認為具有抗動脈粥樣硬化(AS) 作用.用催化中心附近的突變體LCATG179R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293 細胞，發(fā)現(xiàn)突變引起蛋白質(zhì)非正常折疊，導(dǎo)致酶活力降低[8].脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)基因突變導(dǎo)致的功能缺失或分泌不足是患高血脂癥的重要因素之一，LPL肝臟特異性敲除小鼠表現(xiàn)出嚴重的脂代謝紊亂，脂質(zhì)清除能力缺失[9].LCAT和 LPL在膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程中起重要作用[10-12].本文報道了ELP對膽固醇代謝網(wǎng)絡(luò)中LCAT mRNA和LPL mRNA表達的影響，為蚯蚓作為多方位有效的降血脂中藥的應(yīng)用提供了理論支持.

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1儀器

HC-2518R型高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司)，UV/vis2802型分光光度計(優(yōu)尼科儀器有限公司)，PCR儀(杭州博日科技有限公司)，BG-power 600型電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)，SIM凝膠圖像成像系統(tǒng)(美國SIM儀器公司).

1.1.2實驗動物

昆明種小鼠30只(體質(zhì)量20~23 g)，河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供.

1.1.3實驗材料及試劑

ELP購自天津賈立明蚯蚓養(yǎng)殖公司，小鼠飼料購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物養(yǎng)殖中心，血脂指標和脂蛋白酯酶測定試劑盒購自中生北控生物科技有限公司，Taq DNA聚合酶和dNTPs 購自TaKaRa公司，TRIquick Reagent購自Solarbio公司，M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo d(T)15 和RNasin購自Promega公司，100 bp DNA ladder購自天根生化科技有限公司.

1.2　方法

1.2.1小鼠分組及飼喂

將30只雄性昆明小鼠隨機分為5組，每組6只，1組飼喂基礎(chǔ)飼料(記為NCG)，其余4組飼喂高脂飼料(記為HCG)，小鼠自由飲水，連續(xù)8周后取尾血測定血脂水平.

將24只造模成功的高血脂小鼠隨機分4組，每組6只，在飼喂高脂飼料的基礎(chǔ)上，灌胃不同劑量的ELP(生理鹽水溶解)，分別為高劑量ELP(0.4 g/kg，HDG)、中劑量ELP(0.2 g/kg，MDG)、低劑量組ELP(0.1 g/kg，LDG)、單純飼喂高脂飼料組(HCG)，與飼喂基礎(chǔ)飼料組(NCG)小鼠做對照.小鼠自由攝食和飲水，每組小鼠每周稱量1次總體質(zhì)量，依據(jù)體質(zhì)量變化重新計算灌胃ELP的量，且1周內(nèi)按此量灌胃，共飼養(yǎng)10周.

1.2.2LPL活性測定

按試劑盒說明進行操作，LPL分解甘油三酯為甘油及游離脂肪酸，用銅試劑測定生成的游離脂肪酸的量即可計算酶活力.

1.2.3引物設(shè)計

在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/necleotide.htlm)中檢索小鼠肝臟LCAT，LPL基因和內(nèi)參基因β-actin的全長序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計3條基因的成對引物(表1)，送北京三博遠志生物技術(shù)有限公司合成.

表1　PCR引物

1.2.4小鼠總RNA提取及鑒定

飼養(yǎng)結(jié)束后處死所有實驗組小鼠，迅速取出肝臟投入液氮中，-70 ℃冷凍保存.依據(jù)Solarbio公司提供的RNA提取試劑盒說明書，提取小鼠的肝臟總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢驗合格后冷凍保存.

1.2.5RT-PCR及產(chǎn)物檢測

反轉(zhuǎn)錄：每個樣本取2 μg總RNA，加入buffer(5×)4 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，Oligo(dT)152 μL，DEPC水補齊至18.5 μL.混勻后70 ℃變性10 min，后立即冰浴5 min.加入M-MLV(200 U/μL) 1 μL，RNasin(40 U/μL)0.5 μL，混勻，42 ℃ 反應(yīng)1.5 h，94 ℃ 5 min滅活殘存M-MLV，制備得到cDNA，4 ℃保存?zhèn)溆?

參照文獻[13]進行PCR，反應(yīng)體系及擴增條件見表2.

表2　PCR反應(yīng)體系

表2中引物名稱與表1中一致.

按表2加入各種成分，混勻，低速離心，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，49 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)27次后，72 ℃后延伸10 min，4 ℃保存.

在同一塊瓊脂糖凝膠上點樣每個實驗組的所有小鼠同一個基因的PCR產(chǎn)物，電壓5 V/cm條件下電泳，掃描電泳條帶，保存圖譜.

1.2.6統(tǒng)計分析

2結(jié)果

2.1　高血脂模型小鼠的建立

飼喂8周高脂飼料的小鼠，血漿總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇顯著高于飼喂基礎(chǔ)飼料的小鼠，而高密度脂蛋白膽固醇顯著低于對照(表3)，說明高血脂模型小鼠建模成功，可以用來進行實驗.

表3　高血脂小鼠的血脂指標

a.P< 0.01.

2.2　LPL活性變化

由圖1可知，3個ELP添加劑量組均可以不同程度地升高LPL活性，與NCG相比，HDG和MDG的LPL活性有極顯著性差異(P<0.01)，LPL活性在HCG和HDG 2組間表現(xiàn)為極顯著差異(P<0.01)，3個實驗組之間也有顯著差異(P<0.05).

組別a. P< 0.01, vs. NCG; b. P<0.05,vs HCG;c. P<0.05,vs. HDG.圖1　灌胃ELP對高血脂小鼠肝臟脂蛋白酯酶活性的影響Fig.1　Effect of earthworm lyophilized powderon LPL activity in mice

2.3　LPL基因 mRNA表達變化

圖2為灌胃低劑量ELP組小鼠肝臟LPL mRNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜(灌胃高劑量ELP組和中劑量ELP組的對應(yīng)圖譜略).

由圖3 可以看出，與HCG相比，3個實驗組LPL mRNA表達水平顯著提高，有顯著差異(P<0.05)，MDG和LDG表達水平略低于HDG，但3個實驗組之間無顯著性差異(P>0.05).結(jié)合圖1，表明飼喂ELP可以通過增強LPL的表達量來提高小鼠體內(nèi)LPL總活力，進而起到降低膽固醇的作用.

圖2　LDG(L1-L6)組小鼠肝臟LPL mRNA PCR 產(chǎn)物檢測Fig.2　Products of LPL mRNA PCR in LDG(L1-L6) mice

組別a. P< 0.01, vs. NCG; b<0.05, vs. HCG; c. P<0.05, vs. HDG.圖3　蚯蚓凍干粉對小鼠肝臟LPL mRNA表達的影響Fig.3　Effect of ELP on the LPL mRNA levelsin liver of mice

2.4　LCAT mRNA表達變化

圖4為灌胃高劑量ELP組小鼠肝臟LCAT mRNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電圖譜(灌胃中劑量ELP、低劑量ELP組的對應(yīng)圖譜略).

由圖5可以看出，HDG LCAT mRNA表達水平顯著提高，與HCG組有顯著差異(P<0.01)，并且與MDG，LDG組也具有顯著差異(P<0.05)；MDG和LDG與HCG相比無顯著差異，但MDG和LDG表達水平略高于HCG.

圖4　HDG (H1-H6)組小鼠肝臟LCAT mRNA PCR產(chǎn)物檢測Fig.4　Products of LCAT mRNA PCR in HDG(H1-H6)mice

組別a. P<0.01, vs NCG; b<0.05,vs HCG; c.P<0.05,vs HDG.圖5　蚯蚓凍干粉對小鼠肝臟LCAT mRNA表達的影響Fig.5　Effect of ELP on the levels of hepatic expression of LCAT mRNA in mice

3討論

前期研究發(fā)現(xiàn)ELP可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)CYP7α1 (P<0.01)基因表達，提示其可以促進膽固醇在體內(nèi)的分解代謝，ELP還上調(diào)載脂蛋白AI，下調(diào)載脂蛋白B基因表達，下調(diào)HMG-CoAR的基因轉(zhuǎn)錄水平，這些結(jié)果提示ELP可以通過多位點調(diào)節(jié)膽固醇代謝的關(guān)鍵蛋白基因表達，起到降血脂作用.膽固醇代謝網(wǎng)絡(luò)包括攝食吸收、體內(nèi)自身合成、逆轉(zhuǎn)運、排泄等多個代謝途徑.LPL在肝細胞中合成，是一種酰基甘油水解酶，能水解乳糜微粒(chylomicron，CM)中的甘油三酯(triglycerol，TG)，將CM轉(zhuǎn)化為富含膽固醇酯及載脂蛋白 E(apolipoprotein E，apoE)的殘粒，殘粒被肝臟攝取，其膽固醇則以非酯化的形式排入膽汁或用于膽汁酸的合成，從而加強了膽固醇的轉(zhuǎn)化與排泄.因此LPL在極低密度脂蛋白(VLDL)和CM的分解及高密度脂蛋白(HDL)形成中起關(guān)鍵作用.本研究結(jié)果表明，各劑量組小鼠的LPL活性水平均高于對照組，說明ELP中含有某種活性成分可以調(diào)高該酶的生成或提高其活性，并且顯示出一定的劑量效應(yīng).LCAT的主要功能是催化外周組織細胞、血液中的游離膽固醇結(jié)合于新生高密度脂蛋白(HDL)分子表面的磷脂形成膽固醇酯，促進HDL的成熟，HDL將多余膽固醇逆向轉(zhuǎn)運到肝臟轉(zhuǎn)化為膽汁酸形式排出體外.本研究結(jié)果顯示，灌胃各劑量ELP后，各組小鼠LCAT mRNA的表達水平均顯著上調(diào).

ELP可以從多靶點調(diào)節(jié)膽固醇代謝網(wǎng)絡(luò)，具有較全面而平衡的調(diào)脂作用，與單一成分降血脂藥物相比，可以避免單一作用位點造成的某代謝產(chǎn)物的過度積累或缺失而產(chǎn)生的副作用，這可能是蚯蚓作為傳統(tǒng)降血脂中藥應(yīng)用了幾千年的原因之一.ELP本身含有眾多活性成分，對其活性成分的分離分析及鑒定，明確具體成分的功能值得進一步研究.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)