魚粉蛋白與發(fā)酵酶解豆粕蛋白不同配比對日本沼蝦生長及免疫性能的影響

丁志麗張易祥葉金云?周志金杜震宇（．浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室，中國水產(chǎn)科學研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點實驗室，湖州師范學院生命科學學院，湖州000；．湖州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，湖州000；．華東師范大學生命科學學院，上海0006）

魚粉蛋白與發(fā)酵酶解豆粕蛋白不同配比對日本沼蝦生長及免疫性能的影響

丁志麗1張易祥1葉金云1?周志金2杜震宇3
（1．浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室，中國水產(chǎn)科學研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點實驗室，湖州師范學院生命科學學院，湖州313000；2．湖州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，湖州313000；
3．華東師范大學生命科學學院，上海200062）

摘 要：本試驗旨在評價補充微囊氨基酸條件下魚粉蛋白和發(fā)酵酶解豆粕蛋白不同配比對日本沼蝦生長和免疫性能的影響。試驗配制5組等氮等能飼料，以發(fā)酵酶解豆粕分別替代飼料中0（FM組）、25%（R25組）、50%（R50組）、75%（R75組）以及100%的魚粉（R100組）（魚粉蛋白與發(fā)酵酶解豆粕蛋白配比分別為1∶0、3∶1、1∶1、1∶3和0∶1），對平均體重為（0．103 0±0．000 2）g的日本沼蝦進行8周的飼養(yǎng)試驗，隨后對各組蝦進行嗜水氣單胞菌感染試驗。每組設(shè)5個重復，每個重復50尾蝦。結(jié)果表明：當魚粉蛋白與發(fā)酵酶解豆粕蛋白配比為1∶1時，日本沼蝦的增重率達到最大，顯著高于FM和R100組（P＜0．05），各組日本沼蝦的存活率無顯著差異（P＞0．05）；各組日本沼蝦的肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px）活力及丙二醛（MDA）含量無顯著差異（P＞0．05）；FM組日本沼蝦的血細胞總數(shù)及血淋巴吞噬活性均顯著高于R100組（P＜0．05）；肝胰腺中熱應(yīng)激同源蛋白70和熱應(yīng)激蛋白90的mRNA相對表達水平分別在FM和R25組達到最高，顯著高于其余各組（P＜0．05）；當發(fā)酵酶解豆粕替代魚粉比例超過50%時，嗜水氣單胞菌感染后日本沼蝦的累計死亡率顯著增加（P＜0．05）。由此可見，發(fā)酵酶解豆粕可作為日本沼蝦飼料中較好的蛋白質(zhì)源，在氨基酸平衡條件下魚粉蛋白和發(fā)酵酶解豆粕蛋白的最佳配比為1∶1。

關(guān)鍵詞：日本沼蝦；發(fā)酵酶解豆粕；魚粉；生長性能；免疫力

魚粉，由于具有較高的營養(yǎng)價值、良好的適口性，一直以來都作為水產(chǎn)飼料中的主要蛋白質(zhì)源［1］。然而，當前魚粉的供需矛盾、價格居高不下的現(xiàn)實已大大制約了其在水產(chǎn)飼料中的使用量［2］。因此，尋找質(zhì)優(yōu)價廉的蛋白質(zhì)源是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要課題。植物性蛋白質(zhì)源由于具有分布廣泛、產(chǎn)量穩(wěn)定、價格低廉等特點，其受到越來越多的關(guān)注［3］。其中，豆粕是當前使用最為廣泛的植物性蛋白質(zhì)源，這與其具有蛋白質(zhì)含量高、來源穩(wěn)定等優(yōu)點密不可分［3－4］。

值得注意的是，豆粕中存在的抗營養(yǎng)因子大大限制了其在飼料中的添加比例［5－6］。采用發(fā)酵、酶解、熱處理等技術(shù)可在一定程度上去除豆粕中的抗營養(yǎng)因子，提高豆粕的使用效率［7］。酶解豆粕可得到分子質(zhì)量較小的小肽，但存在苦腥味，而發(fā)酵與酶解相比，使豆粕的風味得到極大改善，并產(chǎn)生了大量生物活性物質(zhì)［8］。對高等陸生動物的研究表明，飼料中添加發(fā)酵豆粕具有較好的促生長效果［9－10］。對水產(chǎn)動物如魚類的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕可以一定比例的替代魚粉，如發(fā)酵豆粕替代60%的魚粉而不影響虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的生長性能［11］，且Yamamoto等［12］研究得出虹鱒飼料可以不使用魚粉，在添加3%的氨基酸時，飼料中的蛋白質(zhì)可以完全由發(fā)酵豆粕來供給。在其他魚類［13－16］和經(jīng)濟甲殼動物［17－18］的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵豆粕替代魚粉的優(yōu)良效果。

由此可見，發(fā)酵豆粕已經(jīng)在畜禽及水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中得到廣泛的應(yīng)用，但微生物發(fā)酵蛋白質(zhì)的能力有限，只能將蛋白質(zhì)水解成大分子的多肽［19］。因此，人們開始著手將豆粕發(fā)酵技術(shù)和酶解技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出具有芳香味、含有小肽的發(fā)酵酶解豆粕。已有的研究表明，發(fā)酵酶解豆粕能提高小鼠抗氧化能力、胃腸道蛋白酶活力、腸道有益菌群數(shù)量和免疫器官指數(shù)［20］，并能提高仔豬對飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，降低應(yīng)激性腹瀉，提高生長性能［21］。然而，發(fā)酵或酶解技術(shù)并不能改變豆粕中的賴氨酸和蛋氨酸水平相對較低［5］的事實，如果在替代魚粉時輔以補充晶體或微囊氨基酸是否更有利于提高豆粕替代魚粉的比例，我們不得而知。從已有的研究來看，在魚類或蝦類飼料中補充氨基酸，能提高其他蛋白質(zhì)源替代魚粉的比例［12，22－24］。

日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）又名青蝦、河蝦，為我國和東南亞一些國家的主要的淡水經(jīng)濟養(yǎng)殖種類之一［25］。目前，對日本沼蝦各生長階段蛋白質(zhì)的需求量已有較多的研究［26－28］，使用廉價蛋白質(zhì)源替代魚粉也有零星報道，如玉米蛋白粉［29］、肉骨粉和禽類副產(chǎn)品粉［25］等?；谌毡菊游r較高蛋白質(zhì)需求量的現(xiàn)狀及其飼料中蛋白質(zhì)替代的研究進展，本試驗擬使用發(fā)酵酶解豆粕部分替代魚粉，通過測定日本沼蝦的生長、抗氧化以及免疫性能等指標，探明魚粉蛋白和發(fā)酵酶解豆粕蛋白的適宜配比。

1　材料與方法

1．1 試驗材料

試驗用發(fā)酵酶解豆粕（小肽含量為9．35%，粗蛋白質(zhì)含量為47．70%，粗脂肪含量為0．42%）由湖州環(huán)農(nóng)微生物研究所提供，其主要通過菌種（植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌及干酪乳桿菌等）發(fā)酵和酶解（蛋白酶、纖維素酶、β－葡聚糖酶等）技術(shù)制作。試驗用魚粉為進口優(yōu)質(zhì)白魚粉（粗蛋白質(zhì)含量為66．69%，粗脂肪含量為9．10%），由浙江璟寶飼料股份有限公司提供。

1．2 試驗飼料

試驗共設(shè)計5組等氮（粗蛋白質(zhì)含量為39%）等能（總能水平為15 MJ／kg）的試驗飼料，用發(fā)酵酶解豆粕分別替代飼料中0（FM組）、25%（R25組）、50%（R50組）、75%（R75組）和100%的魚粉（R100組），使得魚粉蛋白與發(fā)酵酶解豆粕蛋白配比分別為1∶0、3∶1、1∶1、1∶3和0∶1。

試驗飼料的制作步驟如下：首先將各種原料粉碎過60目篩，按配方準確稱量，采用逐級擴大法將維生素、礦物質(zhì)預混料和氨基酸等微量成分按比例充分混勻，然后加入魚油與豆油混合油、大豆卵磷脂繼續(xù)搓勻，最后加入水（400 mL／kg DM）攪拌混勻，用小型飼料造粒機制成粒徑為1．5 mm的顆粒飼料，40℃烘干至飼料中水分含量達到約10%后，密封后置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

飼料中粗蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法（Kjeltec 2200，F(xiàn)OSS，丹麥），粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法（SoxtecTM2043，F(xiàn)OSS，丹麥），粗灰分含量的測定采用馬福爐550℃灼燒（14 h）法，水分含量的測定采用105℃烘干（24 h）恒重法，總能水平使用氧彈儀（WELL 9000）測定。飼料在酸水解后，采用全自動氨基酸分析儀（L－8900，Hi?tachi）測定其氨基酸組成。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1，氨基酸組成見表2。

1．3 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗用蝦購于湖州邦達生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，暫養(yǎng)1周后，選擇健康、體重均勻［平均體重為（0．103 0±0．000 2）g］的日本沼蝦，隨機分為5組，每組5個重復，每個重復50尾，以重復為單位隨機放入到體積為300 L的水族箱中，每個水族箱內(nèi)放置一定量的網(wǎng)片作為躲避物，以減少試驗蝦互殘。試驗于2013年7月至2013年9月于浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室進行，每天07：00吸污并換水（換水量約為1／3），試驗使用的水源為曝氣的自來水，水質(zhì)條件為：水溫25～29℃，pH 7．6～8．1，溶氧濃度＞6．5 mg／L，總氨氮濃度＜0．01 mg／L。每日07：30、17：00各投喂1次飼料，投喂量為蝦體重的4%～5%，投喂2 h后將箱中殘余的飼料吸出，烘干后稱重，用于計算攝食量。養(yǎng)殖試驗持續(xù)8周。

表1　試驗飼料組成及營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets（air?dry basis）　%

表2　試驗飼料的氨基酸組成（風干基礎(chǔ)）Table 2 Amino acid composition of experimental diets（air?dry basis）　%

續(xù)表2

1．4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束饑餓1 d后，各組試驗蝦稱重，并統(tǒng)計存活數(shù)。用1 mL無菌注射器采集試驗蝦（每重復5尾）的血淋巴，加入等體積的抗凝劑（由30 mmol／L檸檬酸三鈉、0．34 mol／L氯化鈉、10 mmol／L乙二胺四乙酸、0．115 mol／L葡萄糖組成，pH 7．55）用以統(tǒng)計試驗蝦的血細胞總數(shù)（THC）和血淋巴吞噬活性（PA）。使用解剖器從試驗蝦的頭胸部取出肝胰腺，保存于－80℃用于后續(xù)酶活力的測定及基因表達的分析。

1．5 指標測定

1．5．1 生長性能指標計算公式

存活率（SR，%）＝100×試驗結(jié)束時存活蝦個體數(shù)／試驗開始時蝦的個體數(shù)；

增重率（WGR，%）＝100×（試驗結(jié)束時蝦的平均體重－試驗開始時蝦的平均體重）／試驗開始時蝦的平均體重；

特定生長率（SGR，%／d）＝100×（ln終末體重－ln初始體重）／試驗天數(shù)；

飼料系數(shù)（FCR）＝飼料攝入量／（終末體重－初始體重）。

1．5．2 抗氧化及免疫性能指標測定

1．5．2．1 血細胞總數(shù)及血淋巴吞噬活性

采用血球計數(shù)器測定各組試驗蝦的血細胞總數(shù)，具體操作為：將一定體積的血淋巴添加在血球計數(shù)器上，在光學顯微鏡下對25個中方格中血細胞進行計數(shù)，每個數(shù)值至少讀取3次。根據(jù)稀釋倍數(shù)及血淋巴體積計算血細胞總數(shù)。

血淋巴吞噬活性的測定主要參考Long等［30］和張琴［31］的方法，并做稍許改動，主要操作步驟如下：取100 μL血細胞加入96孔板中，貼壁1 h后，棄上清，加入100 μL 0．001 mol／L的中性紅溶液，吞噬30 min后，用生理鹽水洗掉未被吞噬的中性紅，加入100 μL細胞裂解液（冰醋酸∶無水乙醇＝1∶1，體積比），裂解20 min后，在酶標儀（Thermo，Multiskan FC）中測定溶液在波長540 nm處的吸光度值。

吞噬活性＝（吸光度值／106個血細胞）×100。

1．5．2．2 肝胰腺丙二醛含量和抗氧化酶活力測定

準確稱取肝胰腺約0．5 g，按質(zhì)量體積比1∶9加入預冷的0．86%的生理鹽水制成10%勻漿液，3 500 r／min離心15 min，吸取上清液。根據(jù)各種酶活力的測定方法將上清液稀釋成不同濃度，其中上清液中蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法。所有酶活力的測定均按照試劑盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）說明書進行。脂質(zhì)過氧化程度通過測定組織中丙二醛（MDA）含量變化來反映，用硫代巴比妥酸（TBA）法測定肝胰腺中MDA含量。

脂質(zhì)過氧化降解產(chǎn)物中的MDA與TBA縮合形成紅色產(chǎn)物，根據(jù)顏色變化于532 nm處進行比色；超氧化物歧化酶（SOD）活力的測定采用黃嘌呤氧化酶法，已每毫克組織蛋白質(zhì)在l mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為1個活力單位（U）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px）的測定原理為GSH?Px可以促進過氧化氫（H2O2）與還原型谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成水（H2O）及氧化型谷胱甘肽（GSSG），通過測定GSH的消耗進而得出GSH?Px的活力。

1．6 嗜水氣單胞菌感染試驗

8周的養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，從每個組中隨機挑取3個重復，每個重復20只蝦，以重復為單位暫養(yǎng)在18個玻璃缸中，各組中每尾試驗蝦從第3步足基部關(guān)節(jié)軟膜處分別注射嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）菌液50 μL，菌液濃度為3．5× 107CFU／mL。攻毒后12 h恢復投飼，且連續(xù)觀察試驗蝦的死亡情況，統(tǒng)計各組試驗蝦96 h的累計死亡率。試驗期間連續(xù)充氣，每天換水1／2，水的pH為7．6～8．1，溫度為25～29℃。

1．7 基因表達的熒光定量PCR（qRT?PCR）分析

使用總RNA提取試劑盒（艾德萊，北京）提取肝胰腺總RNA，具體操作按照試劑盒說明書進行，電泳檢測RNA的完整性、核酸蛋白測定儀檢測其濃度和純度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA保存在－20℃用于qRT?PCR分析。

采用在線Primer 3設(shè)計熱應(yīng)激同源蛋白70 （heat shock cognate protein 70，HSC70）和熱應(yīng)激蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）qRT?PCR所用引物如下：HSC70上游引物5′－GCGTCT?TATTGGTGATGC－3′，下游引物5′－TA?AAGGGCCAATGTTTCA－3′；HSP90上游引物5′－GAAGGAAAGGGACAAGGA－3′，下游引物5′－GGTCCATAAAGGCTTGGT－3′。反應(yīng)體積為20 μL，包括：10 μL的2×SYBR Green Premix Ex Taq（TaKaRa，日本），上、下游引物各0．2 μL （10 μmol／L），2 μL模板，7．6 μL ddH2O。qRT?PCR反應(yīng)條件為：95℃預變性30 s；94℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)；PCR反應(yīng)后溫度以每5 s上升5℃的速度從60℃上升到95℃，繪制熔解曲線，以判斷擴增產(chǎn)物的正確性。以日本沼蝦β－肌動蛋白（β?actin，上游引物5′－GTGCCCATCTACGAGGGTTA－3′，下游引物5′－CGTCAGGGAGCTCGTAAGAC－3′）為內(nèi)參，對得到的各樣品循環(huán)數(shù)（Ct）值進行均一化處理，以對照組（FM組）mRNA為基準，使用2－ΔΔCt比較Ct值方法［32］對目的基因mRNA相對表達水平進行分析。

1．8 統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以平均值±標準誤（mean±SE）表示，采用SPSS 11．5對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（oneway ANOVA）后，若差異達到顯著水平，則進行Duncan氏法多重比較，顯著水平為P＜0．05。

2　結(jié) 果

2．1 魚粉蛋白和發(fā)酵酶解豆粕蛋白不同配比對日本沼蝦生長性能的影響

由表3可知，當飼料中豆粕替代魚粉比例為50%（魚粉蛋白與發(fā)酵酶解豆粕蛋白配比為1∶1）時，日本沼蝦的增重率和特定生長率達到最大值，顯著高于全魚粉組（FM組）和全豆粕組（R100組）（P＜0．05），同時飼料系數(shù)呈現(xiàn)相反的趨勢。各組日本沼蝦的存活率差異不顯著（P＞0．05）。

表3　各組日本沼蝦的生長性能Table 3 Growth performance of oriental river prawn（Macrobrachium nipponense）in different groups

2．2 魚粉蛋白和發(fā)酵酶解豆粕蛋白不同配比對日本沼蝦肝胰腺抗氧化酶活力及丙二醛含量的影響

由表4可知，日本沼蝦攝食不同的飼料后，肝胰腺中SOD、GSH?Px在各組間都未出現(xiàn)顯著差異（P＞0．05）。肝胰腺中MDA含量隨著豆粕替代魚粉比例的增加有先降低后上升的趨勢，但各組間亦未表現(xiàn)出顯著差異（P＞0．05）。

表4　各組日本沼蝦的抗氧化酶活力及丙二醛含量Table 4 Antioxidant enzyme activities and MDA content in hepatopancreas of oriental river prawn（Macrobrachium nipponense）in different groups

2．3 魚粉蛋白和發(fā)酵酶解豆粕蛋白不同配比對日本沼蝦血細胞數(shù)量及血淋巴吞噬活性的影響

由表5可知，F(xiàn)M組日本沼蝦的血細胞總數(shù)及血淋巴吞噬活性均顯著高于R100組（P＜0．05）。

2．4 魚粉蛋白和發(fā)酵酶解豆粕蛋白不同配比對日本沼蝦肝胰腺HSC70和HSP90 mRNA相對表達水平的影響

由圖1可知，F(xiàn)M組HSC70 mRNA的相對表達水平顯著高于其余各組（P＜0．05），R25、R75及R100組間HSC70 mRNA的相對表達水平無顯著差異（P＞0．05）；HSP90 mRNA的相對表達水平在R25組達到最高，顯著高于其余各組（P＜0．05），R50、R75及R100組間HSP90 mRNA的相對表達水平未見顯著差異（P＞0．05）。

表5　各組日本沼蝦的血細胞數(shù)量及血淋巴吞噬活性Table 5 THC and hemolymph PA of oriental river prawn（Macrobrachium nipponense）in different groups

2．5 魚粉蛋白和發(fā)酵酶解豆粕蛋白不同配比對日本沼蝦抗感染能力的影響

日本沼蝦被嗜水氣單胞菌感染后，其攝食能力減退，游動速度減慢，并陸續(xù)死亡，連續(xù)觀察96 h后統(tǒng)計其累計死亡率。由圖2可知，當豆粕替代魚粉比例超過50%時，日本沼蝦的累計死亡率升高，顯著高于FM和R25組（P＜0．05）。

3　討 論

本試驗結(jié)果顯示，在飼料中添加38%的發(fā)酵酶解豆粕時，即魚粉蛋白與酶解發(fā)酵豆粕蛋白配比為1∶1時，日本沼蝦的生長性能達到最佳，表明豆粕與魚粉氨基酸的合理搭配能較好的發(fā)揮氨基酸的互補作用，促進日本沼蝦的生長。Luo等［33］在河蟹飼料中使用豆粕和菜籽粕混合蛋白替代魚粉時也發(fā)現(xiàn)，相對于全魚粉組，飼料中添加15%的混合蛋白時河蟹的增重率最大。此外，陳立僑等［34］研究也得出動、植物蛋白適宜的配比有利于河蟹生長性能的提高。日本沼蝦的食性屬于雜食性，單一的蛋白質(zhì)源飼料可能并不適合其生長發(fā)育，Yang等［25］也發(fā)現(xiàn)日本沼蝦攝食混合蛋白（禽類副產(chǎn)品粉與魚粉）組相比全魚粉組增重率顯著提高。此外，氨基酸平衡有助于提高必需氨基酸的利用［23］，本試驗所配飼料中添加了微囊氨基酸來彌補發(fā)酵酶解豆粕中賴氨酸和蛋氨酸的不足，這可能對日本沼蝦生長性能的促進起到了一定的效果。Floreto等［23］對美國龍蝦（Homarus ameri?canus）的研究表明，飼料中豆粕補充氨基酸能提高美國龍蝦的增重率。Alam等［24］對日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicas）的研究也發(fā)現(xiàn)，在大豆分離蛋白飼料中補充包膜氨基酸能顯著提高大豆分離蛋白的營養(yǎng)價值。盡管魚粉具有良好的適口性，但各替代組日本沼蝦的攝食并沒有因魚粉添加量的減少而受到影響，這可能與飼料中添加的賴氨酸和蛋氨酸具有較強的誘食作用［35］有關(guān)。

圖1　各組日本沼蝦肝胰腺HSC70和HSP90 mRNA的相對表達水平Fig．1 HSC70 and HSP90 mRNA relative expression levels in hepatopancreas of oriental river prawn （Macrobrachium nipponense）in different groups

圖2　各組日本沼蝦感染嗜水氣單胞菌后的累計死亡率Fig．2 Cumulative mortality of oriental river prawn（Macrobrachium nipponense）with Aeromonas hydrophila challenge in different groups

對蛋白質(zhì)源進行替代研究時，蝦體的健康狀況亦不可忽視，以實現(xiàn)對飼料蛋白質(zhì)源品質(zhì)的綜合評價。甲殼動物主要依賴非特異性免疫來提高機體對疾病的抵抗力，其中血細胞在甲殼類動物的免疫防御中占主導作用［36］。血細胞總數(shù)在一定程度上反映了蝦體的健康狀態(tài)［37］，本試驗中全魚粉組日本沼蝦的血細胞總數(shù)顯著高于全豆粕組，說明當發(fā)酵酶解豆粕完全替代魚粉時，蝦體的免疫機能發(fā)生下降。同時，日本沼蝦血細胞吞噬活性的變化與血細胞總數(shù)有著相似的變化趨勢，表明全植物蛋白質(zhì)飼料一定程度上降低了蝦體的免疫力。

熱應(yīng)激蛋白（HSPs）是高度保守的蛋白質(zhì)分子家族，在維持細胞蛋白質(zhì)空間構(gòu)象、細胞完整性以及調(diào)控蛋白質(zhì)合成、跨膜運輸、降解等方面發(fā)揮重要的生理功能［38］。其中，HSP70家族由2種不同的基因編碼，即結(jié)構(gòu)型HSC70和誘導型HSP70，HSC70主要與細胞的分裂、增殖、發(fā)育等生理過程相關(guān)［39］。也有研究證明，HSC70具有免疫相關(guān)的功能［40］，但是否受到營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控還鮮有報道。本研究結(jié)果顯示，魚粉組HSC70 mRNA的相對表達水平最高，添加豆粕后HSC70 mRNA的相對表達水平顯著下降，HSC70基因的較高表達增強了對機體組織的保護作用。同時，HSP90 mRNA的相對表達水平在R25組最高，說明該組飼料提高了機體的抗應(yīng)激能力。以上結(jié)果與Olsvik等［41］的研究結(jié)果類似，即用混合植物蛋白替代飼料中的魚粉會引起大西洋鮭（Salmo salar）肝臟中HSP70基因表達的下調(diào)。然而，Hansen等［42］用豆粕替代魚粉、玉米蛋白粉替代魚粉，或豆粕與玉米蛋白粉混合蛋白物替代魚粉時發(fā)現(xiàn)，大西洋鱈魚肝臟中HSP70和HSP90基因的相對表達量都未受顯著影響。相關(guān)研究的結(jié)論有如此大的差異性，可能與植物蛋白質(zhì)源的種類及水生動物對蛋白質(zhì)源利用的差異有關(guān)。從抗氧化酶指標SOD、GSH?Px活力及脂質(zhì)過氧化指標MDA含量來看，各組之間無顯著差異，說明日本沼蝦攝食發(fā)酵酶解豆粕未對機體產(chǎn)生明顯的氧化脅迫，且肝胰腺中HSC70和HSP90基因表達水平也未因豆粕添加比例的增加而增加，再次表明發(fā)酵酶解豆粕的添加未對機體產(chǎn)生較明顯的脅迫作用。綜合各組日本沼蝦的血細胞總數(shù)和血淋巴吞噬活性，以及肝胰腺HSC70 和HSP90 mRNA的相對表達水平，提示飼料中高比例的魚粉蛋白或適宜的魚粉蛋白與發(fā)酵酶解豆粕蛋白配比提高了蝦體的免疫力。

鑒于發(fā)酵酶解豆粕替代魚粉對機體免疫系統(tǒng)影響的復雜性，為了進一步了解各組日本沼蝦的免疫力，選用對日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)危害較大的嗜水氣單胞菌［43］對各組進行攻毒試驗。當發(fā)酵酶解豆粕替代魚粉比例超過50%時，日本沼蝦累計死亡率顯著增加，該結(jié)果印證了高比例的魚粉蛋白或適宜的魚粉蛋白與發(fā)酵酶解豆粕蛋白配比有助于提高蝦體的免疫力，而過高比例的植物蛋白比例會降低蝦體免疫力，這可能與發(fā)酵酶解豆粕中仍然存在少量的抗營養(yǎng)因子和抗原蛋白有關(guān)。

4　結(jié) 論

在平衡氨基酸情況下，綜合考慮生長和免疫性能，日本沼蝦飼料中魚粉蛋白和發(fā)酵酶解豆粕蛋白最佳配比為1∶1。

致謝：

感謝孫凱、陳俊玲、秦蘇艷、楊露娜、周云飛和姜盛華等同學的辛勤勞動與付出。

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（編輯 菅景穎）

Effects of Different Protein Ratios of Fish Meal to Fermented and Enzymolysis Soybean Meal on Growth and Immune Performance of Oriental River Prawn （Macrobrachium nipponense）

DING Zhili1ZHANG Yixiang1YE Jinyun1?ZHOU Zhijin2DU Zhenyu3
（1．Zhejiang Provincial Key Laboratory of Aquatic Resources Conservation and Development，Key Laboratory of Aquatic Animal Genetic Breeding and Nutrition，CAFS，College of Life Sciences，Huzhou University，Huzhou 313000，China；2．Huzhou Municipal Fisheries Extension Center，Huzhou 313000，China；3．School of Life Science，East China Normal University，Shanghai 200062，China）

?Corresponding author，professor，E?mail：yjy＠hutc．zj．cn

Abstract：This experiment was conducted to evalute the effects of different protein ratios of fish meal to fer?mented and enzymolysis soybean meal with microencapsulated amino acid supplementation in diets on growth and immune performance of oriental river prawn（Macrobrachium nipponense）．Fermented enzymolysis soy?bean meal replaced 0（FM group），25%（R25 group），50%（R50 group），75%（R75 group）and 100%of fish meal（R100 group）（the protein ratios of fish meal to fermented and enzymolysis soybean meal were 1∶0，3∶1，1∶1，1∶3 and 0∶1，respectively）in five isocaloric and isonitrogenous diets，respectively．The oriental river prawn with the average body weight of（0．103 0±0．000 2）g were randomly divided into 5 groups with 5 rep?licates in each group and 50 prawns in each replicate．The experiment lasted for 8 weeks．After the feeding ex?periment，the prawns were challenged with Aeromonas hydrophila．The results showed that weight gain rate and specific growth rate were the highest when the protein ratio of fish meal to fermented and enzymolysis soy?bean meal was 1∶1，and were significantly higher than those in the FM and R100 groups（P＜0．05），while no significant difference was observed in survival ratio among all groups（P＞0．05）．There were no significant differences in the activities of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH?Px）and the con?tent of malondialdehyde（MDA）in hepatopancreas among all groups（P＞0．05）．The total haemocyte count （THC）and haemolymph phagocytic activity in the FM group were significantly higher than those in the R100 group（P＜0．05）．The hepatopancreas heat shock cognate protein（HSC70）mRNA relative expression level in the FM group was the highest，and significantly higher than that in the other groups（P＜0．05），the same of heat shock protein 90（HSP90）in R25 group（P＜0．05）．Additionally，the cumulative mortality was signifi?cantly increased when the ratio of fish meal replacement with fermented and enzymolysis soybean meal was more than 50%after challenged with Aeromonas hydrophila．Therefore，fermented and enzymolysis soybean meal can be an appropriate protein source in the diet of oriental river prawn，and the optimal dietary protein ra?tio of fish meal to fermented and enzymolysis soybean meal for oriental river prawn is 1∶1 under the condition of amino acid balance．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（1）：154?164］

Key words：oriental river prawn（Macrobrachium nipponense）；fermented and enzymolysis soybean meal；fish meal；growth performance；immunity

通信作者：?葉金云，研究員，博士生導師，E?mail：yjy＠hutc．zj．cn

作者簡介：丁志麗（1979—），女，江蘇如皋人，講師，博士，主要從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料研究。E?mail：dingzhili＠hutc．zj．cn

基金項目：浙江省重大科技專項計劃項目（2014C12SA560016）；浙江省科技計劃項目（2012C12008?2）；浙江省自然科學基金（LQ14C190004）；國家自然科學基金（31402308）；上海市農(nóng)業(yè)委員會蝦類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目

收稿日期：2014－08－13

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．01．019

文章編號：1006?267X（2015）01?0154?11

文獻標識碼：A

中圖分類號：S963