薄膜-超聲法制備蘆丁固體脂質(zhì)納米粒的研究

·藥劑·

薄膜-超聲法制備蘆丁固體脂質(zhì)納米粒的研究

羅小燕，呂竹芬*，陳燕忠，王國強，林嘉成，鄧廣漢

(廣東藥學院藥物研究所/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣州510006)

摘要：目的優(yōu)化薄膜-超聲法制備蘆丁固體脂質(zhì)納米粒的處方。方法 以包封率為指標，采用正交設(shè)計優(yōu)化法考察硬脂酸和大豆卵磷脂的用量、吐溫-80和聚乙二醇-400的體積分數(shù)對包封率的影響，優(yōu)選最佳處方。用透射電鏡觀察外觀形態(tài)，用電位/納米粒度分析儀分析納米粒的粒徑及Zeta電位，用透析法評價體外釋藥特征。結(jié)果 以最佳處方制備的蘆丁固體脂質(zhì)納米粒呈類球形，平均粒徑為 195.8±11 nm，Zeta電位為-20.65±0.6 mV，平均包封率為86.31%，72 h體外累積釋放87.32%。結(jié)論 按最佳處方工藝制備的蘆丁固體脂質(zhì)納米粒具有較高的包封率和較好的緩釋效果。

關(guān)鍵詞：蘆??；固體脂質(zhì)納米粒；體外釋藥；薄膜-超聲法

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.015

中圖分類號：R944

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2015)03-0267-04

Abstract:ObjectiveTo optimize the technique for preparing Rutin Solid Lipid Nanoparticles (RT-SLN) by film-ultrasonic dispersion.MethodsThe formulation was optimized by an orthogonal design.The entrapment efficiency was used as an index to investigate the factors of stearic acid， leci-thin，Tween-80 concentration and PEG-400 concentration.The electron microscope was used to observe the surface of RT-SLN by negative-dying.Particle size and Zeta potential were determined by laser particle analyzer，and drug release in vitro was evaluated by dialysis.ResultsRT-SLN were spherical. Its partical size was 195.8±11 nm，Zeta potential was -20.65±0.6 mV， and the entrapment efficiency was 86.31%.The cumulative release rate was 87.32% within 72 hours in vitro.ConclusionRutin Solid Lipid Nanoparticals could be prepared under the optimized conditions with high entrapment efficiency and in vitro sustained release characteristics.

基金項目：廣東省教育廳科技計劃項目(編號：GCZX-A0807)

作者簡介：羅小燕，女，碩士研究生

收稿日期：(2015-03-02)

Preparation of Rutin Solid Lipid Nanoparticles by film-ultrasonic method

LUO Xiaoyan，Lü Zhufen*，CHEN Yanzhong，WANG Guoqiang，LIN Jiacheng，DENG Guanghan(Institute of Material Medica/Key Laboratory of Advanced Drug Delivery of Guangdong Province，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China )

Key words: rutin；solid lipid nanoparticles；invitrorelease；film-ultrasonic method

*通信作者：呂竹芬，女，教授

蘆丁(rutin)又稱蕓香苷，是槲皮素與蕓香糖形成的苷，難溶于水，溶于甲醇，既可作為治療藥物，又可作為保健品[1-2]。其具有抗炎、抗病毒、抗輻射、抑制醛糖還原酶、抗過敏、利尿、解痙、鎮(zhèn)咳等多種藥理活性，臨床用于防治腦溢血、視網(wǎng)膜出血、高血壓、紫癜和急性出血性腎炎等疾病，但是蘆丁脂溶性和水溶性都很差，口服幾乎不被人體吸收[2-3]，生物利用度低。固體脂質(zhì)納米粒是以生理相容的高熔點脂質(zhì)為骨架材料制成的新型藥物傳遞載體，具有廣泛的藥物適應(yīng)性、良好的生物相容性，可以提高難溶性藥物的溶解度，減少藥物毒性，延緩藥物釋放，促進藥物吸收[4-8]。

本研究采用薄膜-超聲法制備蘆丁固體脂質(zhì)納米粒，以包封率為評價指標，采用正交設(shè)計法對處方進行優(yōu)化，并對最優(yōu)處方制備的納米粒的形態(tài)、粒徑、Zeta電位、體外釋藥行為進行評價，為蘆丁新型給藥系統(tǒng)的開發(fā)與應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司，DAD檢測器)；Delsa Nano C電位/納米粒度分析儀(美國Beckman Coulter公司)；JY88-IIN型超聲波細胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；JEM-100CXII透射電鏡(日本電子株式會社)；CP 225 D型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；TGL-20000-CR型高速臺式冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；超濾離心管(截留相對分子質(zhì)量10 kD，美國Millipore公司)。

1.2試藥 蘆丁原料藥(質(zhì)量分數(shù)99.0%，LOT: R106911，湖北興銀河化工有限公司)；蘆丁對照品(質(zhì)量分數(shù)99.0%，LOT: 100802-201406，中國藥品生物制品檢定所)；大豆卵磷脂(德國Lipoid公司)；硬脂酸(廣東達濠化工廠)；聚山梨酯-80(天津市大茂化學試劑廠)；聚乙二醇-400(廣東汕頭市西隴化工廠)。

2方法與結(jié)果

2.1蘆丁固體脂質(zhì)納米粒的制備精密稱取一定量的蘆丁、硬脂酸和大豆卵磷脂，置于圓底燒瓶中，加入適量甲醇超聲使其溶解，于70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使其形成均勻薄膜層。加入同溫度下一定體積分數(shù)的聚乙二醇-400溶液5 mL和聚山梨酯-80 5 mL，超聲20 min使薄膜層與水相充分混合。冰水浴下以細胞破碎儀超聲分散(功率400 W，3 s)60次，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得蘆丁固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 蘆丁固體脂質(zhì)納米粒含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-冰醋酸溶液(35∶65)為流動相；檢測波長：257 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.2.2 線性考察 精密稱取12.11 mg蘆丁對照品，置于100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，渦旋混勻，得質(zhì)量濃度為121.1 μg·mL-1的儲備液。精密量取儲備液適量，分別用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為6.055，12.11，24.22，48.44，72.66，96.88和108.99 μg·mL-1的系列對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積(A)與質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸。得回歸方程：A=49.628C+1.467 8(r=0.999 5)。結(jié)果表明，藥物質(zhì)量濃度在6.055~108.99 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 專屬性實驗 分別以對照品、樣品和空白固體脂質(zhì)納米粒混懸液進樣測定，記錄色譜圖，處方中輔料對樣品測定無干擾。

2.2.4 重復(fù)性實驗 精密量取1 mL蘆丁固體脂質(zhì)納米粒混懸液，按2.2.8項下方法平行配制6份供試品溶液，依法測定，計算含量。測得平均含量為99.86 μg·mL-1，RSD為0.43 %。表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 精密度實驗 取2.2.4項下同一供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，測得RSD為0.34%，表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗 取2.2.4項下制備的同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24，36，48，60和72 h進樣測定，測得峰面積RSD為 1.39%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 回收率實驗 精密量取3份2.2.4項下同一批蘆丁固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?.5 mL，置于10 mL量瓶中，分別加入121.1 μg·mL-1的對照品溶液0.3，0.4和0.5 mL，按2.2.8項下方法平行配制供試品各3份，濾過，取續(xù)濾液按2.2.1項下色譜條件進樣測定，計算平均回收率為98.28% ，RSD為1.23%。

2.2.8 含量測定 分別精密量取3批蘆丁固體脂質(zhì)納米?；鞈乙焊? mL，加甲醇溶解并超聲5 min(100 W)，定容至10 mL，濾過，取續(xù)濾液按2.2.1項下色譜條件進樣測定。另取蘆丁對照溶液，同法進樣測定。按外標法計算，得3批供試品的含量分別為 99.86，103.11和101.21 μg·mL-1。

2.3蘆丁固體脂質(zhì)納米粒包封率測定采用超濾離心法[9]測定蘆丁固體脂質(zhì)納米?；鞈乙旱陌饴剩芰咳√J丁固體脂質(zhì)納米?；鞈乙? mL，置于Millipore超濾離心管中，以5 000 r·min-1離心15 min，以甲醇溶解沉淀并超聲破壞，定容至10 mL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定包裹在脂質(zhì)納米粒中的蘆丁含量M1；另取蘆丁固體脂質(zhì)納米粒混懸液1 mL，加入甲醇超聲破壞并定容至10 mL，濾過，取續(xù)濾液按2.2.1項下色譜條件進樣測定脂質(zhì)納米粒中總含藥量M總。

包封率(%)=M1/M總×100%

2.4 處方篩選 單因素考察發(fā)現(xiàn)，硬脂酸用量、聚山梨酯-80質(zhì)量濃度、聚乙二醇-400體積分數(shù)、大豆卵磷脂用量對蘆丁固體脂質(zhì)納米粒的成型、粒徑、電位、包封率和釋放均有較大影響，因此，以硬脂酸用量(A)、聚山梨酯-80質(zhì)量濃度(B)、聚乙二醇-400體積分數(shù)(C)、大豆卵磷脂用量(D)作為處方優(yōu)化考察因素，每個因素選擇3個水平，以包封率為指標，采用正交實驗設(shè)計優(yōu)化處方，以正交表L9(34)設(shè)計實驗，因素水平見表1，實驗方法及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平表

Tab.1 The factors and levels

水平因 素A,硬脂酸用量/mgB,聚山梨酯-80質(zhì)量濃度/mg·mL-1C,聚乙二醇-400體積分數(shù)/%D,大豆卵磷脂用量/mg15085502100101010031501515150

表2 處方優(yōu)化正交實驗結(jié)果

Tab.2The results of the orthogonal design

實驗號因素ABCD包封率/%150855048.01250101010063.21350151515069.26410081015076.39510010155069.48610015510085.34715081510080.16815010515076.22915015105070.96K1180.48204.56209.57188.45K2231.21208.91210.56228.71K3227.34225.56218.90221.87R50.7321.009.3340.26

表3方差分析結(jié)果

Tab.3 The results of variance analysis

因素偏差平方和自由度均方平方和F比F臨界值顯著性優(yōu)選方案A531.602265.8030.36*A2B81.90240.954.68F0.05(2,2)=19.0B3C17.5128.751.00F0.10(2,2)=9.0C3D309.392154.7017.67D2

由正交實驗及方差分析結(jié)果可知：選擇偏差平方和最小的因素C作為誤差項，對蘆丁固體脂質(zhì)納米粒包封率影響大小順序為：A>D>B>C，因素A對蘆丁固體脂質(zhì)納米粒包封率的影響有顯著性意義(P>0.05)。單因素考察中發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇-400的體積分數(shù)越小，蘆丁緩釋效果越好，因此，采用聚乙二醇-400體積分數(shù)為5%，結(jié)合正交實驗結(jié)果分析，優(yōu)化搭配為A2B3C1D2，此優(yōu)化搭配與實驗方案中包封率最高的第6號實驗的水平組合一致。

2.5 優(yōu)化處方的驗證實驗 由正交實驗優(yōu)選的蘆丁固體脂質(zhì)納米粒最佳處方，即蘆丁10 mg、硬脂酸100 mg、聚山梨酯質(zhì)量濃度15 mg·mL-1、聚乙二醇-400體積分數(shù)5%、大豆卵磷脂100 mg，按2.1項下方法平行制備3批蘆丁固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?，以粒徑、包封率對最佳處方進行驗證，驗證結(jié)果見表4。

表4 驗證實驗結(jié)果

Tab.4 The results ofvalidation test

批號123平均值RSD%粒徑/nm198.30196.70191.80195.601.74包封率/%83.2187.3986.3385.642.54

由驗證實驗結(jié)果證明，通過正交設(shè)計得到的最佳條件其驗證值和計算值無顯著性差異，表明此處方工藝穩(wěn)定。

2.6蘆丁固體脂質(zhì)納米粒性質(zhì)考察

2.6.1 外觀形態(tài) 采用透射電鏡觀察蘆丁固體脂質(zhì)納米粒的形態(tài)。方法為取適量樣品溶液滴加到專用銅篩網(wǎng)上，用20 g·L-1磷鎢酸染色，用濾紙吸去多余的液體，自然干燥后置于透射電鏡下，觀察并拍攝照片。發(fā)現(xiàn)蘆丁固體脂質(zhì)納米粒呈均一球形，粒子分布均勻，結(jié)果見圖1。

圖1蘆丁固體脂質(zhì)納米粒透射電鏡圖

Fig.1 The TEM of RT-SLNs

2.6.2粒徑及Zeta電位 取一定量蘆丁固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?，用蒸餾水適當稀釋，采用電位/納米粒度分析儀測定粒徑分布及電位，結(jié)果蘆丁固體脂質(zhì)納米粒的平均粒徑為195.8±11 nm，多分散性系數(shù)PI為0.12±0.03， Zeta電位為-20.65±0.6 mV。結(jié)果見圖2和圖3。

圖2粒徑分布圖

Fig.2 The particls size distribution

圖3Zeta電位分布圖

Fig.3 The Zeta potential of RT-SLNs

由圖4可知，蘆丁固體脂質(zhì)納米粒混懸液可以延長藥物的釋放，具有一定的緩釋效果，72 h釋放總藥量為87.32%。作為對比的蘆丁混懸液在24 h內(nèi)已經(jīng)釋放總藥量的85%，48 h內(nèi)幾乎釋放完全。

圖4 RT-SLN釋藥曲線

Fig.4 The release profile of RT-SLNs

3 討論

固體脂質(zhì)納米粒的制備方法很多，主要有高壓乳勻法、溶劑擴散法、微乳液法、薄膜超聲分散法和高溫乳化-低溫固化法等[10-11]。本研究結(jié)合實驗室條件采用薄膜-超聲法制備蘆丁固體脂質(zhì)納米粒，并對按最優(yōu)處方制備的納米粒的外觀形態(tài)、粒徑、電位、包封率、體外釋藥特性進行評價，表明薄膜-超聲法適合制備蘆丁固體脂質(zhì)納米粒。

由于蘆丁脂溶性和水溶性都較差，正交設(shè)計優(yōu)化處方中考察了不同質(zhì)量濃度的聚山梨酯-80和聚乙二醇-400作為乳化劑增加蘆丁的溶解度，形成脂質(zhì)納米粒的過程中聚山梨酯-80、聚乙二醇-400和大豆卵磷脂形成一層包裹硬脂酸的膜，蘆丁可以濃集在這層乳化膜內(nèi)，有效提高蘆丁固體脂質(zhì)納米粒的包封率。正交設(shè)計優(yōu)化處方所制備的蘆丁固體脂質(zhì)納米粒，平均包封率為86.31%，平均粒徑為195.8±11 nm。脂質(zhì)納米粒具有巨大的比表面積，可顯著改善蘆丁在消化液中的溶解度；具有較小的粒徑、良好的生物相容性，脂溶性高，能較好地黏附于胃腸道壁，延長藥物在胃腸道停留時間，增加蘆丁的吸收。

蘆丁固體脂質(zhì)納米粒混懸液釋藥過程包括快釋和慢釋兩部分，前12 h屬于快釋過程，釋放了全部藥量約40.41%，這是由于蘆丁固體脂質(zhì)納米粒中游離的蘆丁和吸附在納米粒表面的蘆丁，在漏槽的條件下導致藥物發(fā)生快釋過程。隨著納米粒兩側(cè)質(zhì)量濃度差的增大，骨架型的固體脂質(zhì)納米粒緩慢釋放，72 h時，其累積釋放率達到87.32%。

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