液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定地高辛及其室間質(zhì)量評價

孫賀偉，　劉海明，　李水軍，　余　琛，　朱建民

[1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；

2. 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院(中國科學(xué)院上海臨床研究中心)中心實驗室，上海 200031]

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定地高辛及其室間質(zhì)量評價

孫賀偉1，劉海明2，李水軍2，余琛2，朱建民2

[1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；

2. 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院(中國科學(xué)院上海臨床研究中心)中心實驗室，上海 200031]

摘要：目的建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測血清地高辛的方法，用于臨床開展地高辛治療藥物監(jiān)測(TDM)。方法采用同位素稀釋LC-MS/MS測定血清地高辛濃度并進(jìn)行方法學(xué)評價。樣品采用特丁基甲醚提取，反相色譜分離，正離子電噴霧質(zhì)譜儀檢測。分析參加衛(wèi)生部臨檢中心地高辛TDM室間質(zhì)量評價(EQA)的結(jié)果，并與電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行初步比較。結(jié)果LC-MS/MS的線性范圍為0.05～5.00 ng/mL，精密度為1.0%～4.3%，準(zhǔn)確度為101.3%～108.9%，回收率為95.8%～97.5%，基質(zhì)效應(yīng)為95.7%～97.6%。單份樣品的分析檢測時間為 3 min。血清樣品反復(fù)凍融3次、放置室溫24 h、處理后放置自動進(jìn)樣器36 h的穩(wěn)定性良好。EQA樣品的LC-MS/MS測定結(jié)果與靶值的偏差為-4.09%，線性方程為YLC-MS/MS=1.01XEQA靶值-0.09，r=0.99。電化學(xué)發(fā)光法測定結(jié)果比LC-MS/MS平均高36.9%。結(jié)論LC-MS/MS測定血清地高辛簡便、特異。測定結(jié)果符合全國室間質(zhì)量評價要求，但與電化學(xué)發(fā)光法存在較大的差異。

關(guān)鍵詞：地高辛；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；室間質(zhì)量評價；電化學(xué)發(fā)光法

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of serum digoxin and its external quality assessmentSUNHewei1，LIUHaiming2，LIShuijun2，YUChen2，ZHUJianmin2

.[1.BiologicalCollege，ShanghaiUniversity，Shanghai200444，China; 2.CentralLaboratory，ShanghaiXuhuiCentralHospital(ShanghaiClinicalResearchCenter，ChineseAcademyofSciences)，Shanghai200031，China]

Abstract：ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)for therapeutic drug monitoring(TDM)of serum digoxin. MethodsAn isotope dilution LC-MS/MS was realized by tert-butyl methyl ether extraction， reversed-phase separation and positive electrospray ionization mass spectrometry detection. The results of external quality assessment(EQA)of digoxin TDM program of the National Center for Clinical Laboratory by LC-MS/MS were analyzed and compared with those of electrochemiluminescence immunoassay. ResultsThe linear range was 0.05-5.00 ng/mL. The precision was 1.0%-4.3%, and the accuracy was 101.3%-108.9%. The recovery rate was 95.8%-97.5%, and the matrix effect was 95.7%-97.6%. The total run time was 3 min per injection. Good stability was observed on serum undergoing 3 cycles of frozen-thaw， at room temperature for 24 h and pretreating serum placed in autosampler for 36 h. The average bias was -4.09% between LC-MS/MS and the target value of EQA with a correlation formula of YLC-MS/MS=1.01Xtarget value-0.09， r=0.99. Electrochemiluminescence immunoassay results were 36.9% higher on average than those of LC-MS/MS. ConclusionsLC-MS/MS is simple and specific for the determination of serum digoxin. The results reported by LC-MS/MS are comparable with the national external quality assessment proficiency test. There is significant difference in digoxin results between LC-MS/MS and electrochemiluminescence immunoassay.

Key words：Digoxin; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; External quality assessment; Electrochemiluminescence immunoassay

地高辛是臨床抗心力衰竭的常用藥物，但其毒副作用大，安全范圍窄，藥物代謝動力學(xué)、藥物效應(yīng)動力學(xué)個體差異大，且治療劑量與中毒劑量相互重疊，易發(fā)生中毒反應(yīng)[1-2]。因此地高辛的血藥濃度監(jiān)測對臨床具有重要意義[3]。目前臨床上地高辛血藥濃度檢測多采用基于抗體抗原相結(jié)合的免疫學(xué)方法，包括化學(xué)發(fā)光免疫法[4]、放射免疫法[5]、均相免疫法[6]、干化學(xué)法[7]等。有研究顯示內(nèi)源性地高辛免疫活性類物質(zhì)可與免疫試劑盒中的地高辛抗體結(jié)合，從而干擾地高辛血藥濃度測定[8]。一些外源性物質(zhì)如螺內(nèi)酯、卡馬西平代謝物、三環(huán)類抗抑郁藥代謝物以及一些中藥如蟾酥、人參、丹參等也能干擾免疫測定法，影響其結(jié)果的準(zhǔn)確性[8-9]。因此，建立一個特異性高、抗干擾能力強(qiáng)的地高辛檢測方法用于臨床常規(guī)治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring，TDM)十分有必要。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)將液相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高特異性檢測能力進(jìn)行了有機(jī)結(jié)合，在特異性、靈敏度和抗干擾能力方面較其他方法具有明顯優(yōu)勢，因此在臨床診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用[10]。在已有研究[11]的基礎(chǔ)上，我們對LC-MS/MS測定血清地高辛濃度進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗證，并分析了連續(xù)多年參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心TDM室間質(zhì)量評價(externalqualityassessment,EQA)的結(jié)果。

材料和方法

一、儀器與試劑

1. 儀器5500 QTRP串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司)，液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)由LC-20AD輸液泵、DGU-20A3在線脫氣儀、SIL-HTc自動進(jìn)樣器組成。Vortex-2型渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)，Mikro 22R冷凍高速離心機(jī)(德國Hettich公司)，GR-150型氮吹儀(Techne公司)。 Centaur電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Siemens Healthcare Diagnostics公司，用于臨床常規(guī)測定地高辛)。

2. 試劑地高辛標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)購自中國藥品生物制品檢定所；地高辛-d3(同位素豐度98%)購自加拿大Toronto Research Chemicals公司；甲酸(液相色譜純)購自美國Tedia公司；乙酸銨(ACS純)、乙腈(液相色譜純)、甲醇(液相色譜純)購自德國Merck KGaA公司。實驗用水為本實驗室采用Millipore純水系統(tǒng)自制。

二、LC-MS/MS分析條件

1. 色譜分析條件分析柱為Capcell C18 MG Ⅲ(5 μm，2.1 mm×100 mm，日本資生堂精細(xì)化學(xué)公司)；流動相為10 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液(60∶40，v/v)，等度洗脫，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL。

2. 質(zhì)譜分析條件電噴霧(electrospray ionization，ESI)離子源，正離子模式。噴霧氣：50，輔助加熱氣：50，氣簾氣：20，碰撞氣：中等。離子源電壓：5 500 V，離子源溫度：400℃；多反應(yīng)監(jiān)測掃描分析，地高辛離子通道分別選擇為798.6/651.5 amu(定量)和798.6/233.2 amu(定性)；內(nèi)標(biāo)地高辛-d3選擇801.6/654.5 amu。

3. 樣品處理方法200 μL血清加20 μL內(nèi)標(biāo)工作液(10 ng/mL地高辛-d3)，再加1 mL特丁基甲醚渦旋振蕩5 min，然后14 000×g離心5 min，取上清液，45℃吹干，加100 μL 40%甲醇重組，渦旋5 min，取80 μL轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶供進(jìn)樣分析。

4. 貯備液及工作液配制方法地高辛和同位素內(nèi)標(biāo)地高辛-d3均用甲醇配成100 μg/mL，地高辛-d3用40%甲醇稀釋至10 ng/mL作為內(nèi)標(biāo)工作液，貯備液及工作液4℃保存。在空白小牛血清中加入地高辛貯備液，配制成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL的溶液(用于標(biāo)準(zhǔn)曲線制作)和0.15、4.00 ng/mL的溶液(質(zhì)控品)，按樣品處理方法處理后進(jìn)樣。

三、方法學(xué)評價

LC-MS/MS的性能評價指標(biāo)包括方法特異性、線性范圍和檢測靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性。

1. 特異性觀察不同來源的血清對地高辛的干擾情況。取6份不同個體的空白血清，分別配制成濃度為0.15和4.00 ng/mL的地高辛質(zhì)控品，按樣品處理步驟操作并進(jìn)樣分析。

2. 定量限對定量下限(lower limit of quantitation，LLOQ)的要求是準(zhǔn)確度為80%～120%、精密度[變異系數(shù)(CV)]≤20%、信噪比(signal-noiseratio,S/N)≥10[12]。

3. 精密度和準(zhǔn)確度在空白血清中分別配制濃度為0.15和4.00 ng/mL的地高辛質(zhì)控品，重復(fù)測定20次；再測定6批，每批重復(fù)測定3次，計算批內(nèi)、批間精密度與準(zhǔn)確度；同時觀察地高辛在最低定量限(0.05 ng/mL)處的批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度。

4. 回收率和基質(zhì)效應(yīng)取濃度為0.15和4.00 ng/mL的質(zhì)控品和空白血清各6份，按樣品處理方法進(jìn)行處理，在處理后的空白血清上清液中加入相應(yīng)濃度的地高辛和地高辛-d3，進(jìn)樣分析，計算質(zhì)控品與空白添加相應(yīng)濃度樣品的峰面積百分比，即為樣品處理過程的回收率。另將空白樣品提取后添加相應(yīng)濃度樣品，進(jìn)樣檢測，并與空白溶劑添加相應(yīng)濃度樣品的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，計算相應(yīng)濃度的峰面積百分比，即為基質(zhì)效應(yīng)。

5. 穩(wěn)定性穩(wěn)定性可能對檢測結(jié)果的可靠性、可重復(fù)性產(chǎn)生影響，因此有必要對影響穩(wěn)定性的各種因素(如樣品采集、處理、保存等)進(jìn)行觀察，確保在不影響地高辛穩(wěn)定性的條件下進(jìn)行操作[13]。將血清樣品反復(fù)凍融[從-20℃到室溫(23℃)解凍3次]、在室溫放置24 h以及樣品處理后在自動進(jìn)樣器放置36 h后采用LC-MS/MS測定地高辛濃度，并與初始值比較，觀察其穩(wěn)性性。

四、方法比較及室間質(zhì)量評價

本實驗室從2009年下半年開始連續(xù)參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心全國TDMEQA計劃。該計劃1年2次，每次提供5個血清樣品。在規(guī)定時間內(nèi)將測定結(jié)果上報，衛(wèi)生部臨檢中心反饋每次檢測的統(tǒng)計結(jié)果。由參與TDM EQA計劃的臨床實驗室(2014年為127個實驗室)按方法學(xué)分組的檢測均值確定EQA樣品的靶值。測定結(jié)果在靶值的20%內(nèi)視為可接受。

將臨床收集的60例血清樣品同時采用LC-MS/MS和電化學(xué)發(fā)光法測定，比較兩種方法間的差異。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩種方法之間的差異采用配對t檢驗，方法相關(guān)性采用線性回歸分析，正態(tài)分布檢驗采用單樣本K-S分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、LC-MS/MS測定地高辛方法的建立

以乙酸銨溶液為流動相，地高辛的相對分子質(zhì)量為780.95 g/mol。在正離子ESI離子化模式下，m/z 798.6 的[M+NH4]+離子信號在乙酸銨溶液體系更加容易形成信號更強(qiáng)的分子離子峰，而過高濃度(>20 mmol/L)乙酸銨則容易抑制離子信號。對分子離子峰碎裂進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，主要形成m/z 651.5、m/z 233.2和m/z 175.4等碎片離子峰。選擇Q1/Q3離子通道798.6/651.5 amu作為定量離子通道，同時選擇Q1/Q3離子通道798.6/233.2 amu作為定性離子通道。內(nèi)標(biāo)地高辛-d3的質(zhì)譜特征與地高辛相似，形成m/z 801.5的分子離子峰，碎裂后的二級質(zhì)譜主要形成m/z 654.5的碎片離子。

采用10 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液為流動相，地高辛的典型保留時間為1.3 min，總的色譜分析時間為3 min，在空白血清樣品中未見對地高辛和內(nèi)標(biāo)有干擾的色譜峰，其色譜圖見圖1。

二、方法學(xué)評價

收集臨床未服用地高辛的患者血清樣品，按照樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析。在地高辛及內(nèi)標(biāo)通道均未發(fā)現(xiàn)干擾峰存在，見圖1。

取小牛血清配制1 ng/mL地高辛濃度，分別與6個臨床血清樣品(服用地高辛患者血清，男女各半)等體積混合，重復(fù)6次，同時測定臨床血清樣品、小牛血清、混合樣品的地高辛及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)?；旌蠘悠返馗咝?內(nèi)標(biāo)比值與理論值(臨床血清樣品與小牛血清響應(yīng)均值)的百分比為96.4%±5.1%，說明小牛血清作為空白基質(zhì)與人血清有良好的互換性。

注：(a)空白樣品；(b)LLOQ，地高辛濃度為0.05 ng/mL，S/N=39.5；(c)患者血清樣品，地高辛濃度為0.425 ng/mL；地高辛(左圖)和內(nèi)標(biāo)(右圖)的色譜保留時間為1.3 min

圖1地高辛典型色譜圖

以地高辛添加濃度為X軸，地高辛與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為Y軸，進(jìn)行線性回歸，經(jīng)“1/X”權(quán)重得回歸方程為Y=0.075 5X+0.013 1，r=0.999 7。表明地高辛在0.05～5 ng/mL血清濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。本方法的LLOQ為0.05 ng/mL，S/N為39.5，見圖1。檢測限可達(dá)0.005 ng/mL。

本方法的精密度≤4.3%，準(zhǔn)確度為101.3%～108.9%,回收率為95.8%～97.5%，基質(zhì)效應(yīng)為95.7%～97.6%。見表1。

表1　地高辛準(zhǔn)確度和精密度

血清樣品經(jīng)反復(fù)凍融(從-20℃到室溫反復(fù)解凍3次)、室溫放置24 h、樣品處理后在自動進(jìn)樣器(室溫)放置36 h后的地高辛測定結(jié)果與初始測定值比較，偏差均在允許范圍內(nèi)，見表2。

表2　穩(wěn)定性結(jié)果

三、EQA及方法比較

采用本實驗室自建的LC-MS/MS測定EQA樣品中的地高辛濃度，將測定結(jié)果與靶值進(jìn)行線性回歸分析，見圖2?；貧w方程為YLC-MS/MS=1.01XEQA靶值-0.09，r=0.99，與靶值的平均偏差為-4.09%(n=55)，偏差(均值±2s)為-20.7%～12.5%。LC-MS/MS結(jié)果和EQA靶值在低濃度時存在負(fù)偏差。

采用LC-MS/MS和電化學(xué)發(fā)光法測定60例臨床血清樣品中的地高辛濃度，結(jié)果見圖3。

注：(a)線性回歸圖，YLC-MS/MS=1.01X靶值-0.09，r=0.99；(b)Bland-Altman圖，LC-MS/MS測定結(jié)果與靶值的平均偏差為-4.09%，偏差(均值±2s)為-20.7%～12.5%

圖2LC-MS/MS測定結(jié)果與靶值之間的線性回歸圖和Bland-Altman圖

圖3　LC-MS/MS和電化學(xué)發(fā)光法測定血清地高辛的比較

單樣本K-S分析顯示2組數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，因此采用配對t檢驗分析兩組均值的差異。LC-MS/MS測定結(jié)果為(0.78±0.45)ng/mL，電化學(xué)發(fā)光法結(jié)果為(1.03±0.55)ng/mL，兩種方法之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。電化學(xué)發(fā)光法測定結(jié)果比LC-MS/MS平均高36.9%。

討論

地高辛治療指數(shù)低，安全范圍窄，藥動學(xué)、藥效學(xué)個體差異大，肝腎功能不全等可引起中毒反應(yīng)。因此臨床上需進(jìn)行TDM，分析血藥濃度與臨床治療效果及中毒反應(yīng)的關(guān)聯(lián)性[3]。傳統(tǒng)的地高辛治療范圍(血清濃度)為0.8～2.0 ng/mL，這個濃度范圍主要是用于判別地高辛中毒，其有效性范圍一致存在爭議[14]。

目前臨床上應(yīng)用于地高辛血藥濃度監(jiān)測的方法主要是基于免疫學(xué)原理，采用抗原與抗體特異性反應(yīng)形成抗原-抗體免疫復(fù)合物。免疫法無法直接檢測地高辛本身，其底物檢測必須依賴一系列的免疫反應(yīng)，經(jīng)常容易受到內(nèi)外源性地高辛免疫活性物質(zhì)的干擾[15]，這些檢測結(jié)果可能會帶給臨床錯誤甚至危險的診斷。

在原有的工作[11]基礎(chǔ)上，本研究采用LC-MS/MS檢測血清地高辛濃度，調(diào)整了線性濃度范圍，同時開展了EQA的持續(xù)評價，并與電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行了初步比對。結(jié)果表明，不同來源的血清對測定結(jié)果的影響基本一致，LC-MS/MS具有較好的特異性；LLOQ為0.05 ng/mL，具有非常高的靈敏度；線性范圍為0.05～5.0 ng/mL，足以覆蓋地高辛在臨床上可能出現(xiàn)的各種濃度范圍。

LC-MS/MS與EQA靶值的比對結(jié)果顯示兩者的相關(guān)性良好，平均偏差為-4.09%，具有較好的可比性。由此可見，LC-MS/MS不但可為地高辛的臨床TDM提供服務(wù)，同時亦可為臨床TDM建立質(zhì)控方法。LC-MS/MS與電化學(xué)發(fā)光法的比對結(jié)果顯示二者之間結(jié)果差異很大，電化學(xué)發(fā)光法結(jié)果明顯高于LC-MS/MS，特別是在低濃度時差異尤為明顯，具體原因需要今后與參考方法比較及進(jìn)行相關(guān)干擾研究得到確切結(jié)論。如因檢測方法的原因?qū)е碌馗咝翙z測結(jié)果偏高，那么在臨床上可能會造成部分接受地高辛治療的患者血清濃度尚未到達(dá)合適的治療范圍，而檢測結(jié)果則指示臨床無需調(diào)整治療劑量的錯誤后果。由此可見，需要進(jìn)一步開展有關(guān)地高辛檢測方法的干擾研究、參考方法建立、室間質(zhì)量控制甚至正確度驗證等工作，切實提高地高辛檢測的質(zhì)量，促進(jìn)地高辛TDM的臨床效果。

綜上所述，今后可將LC-MS/MS作為臨床地高辛TDM的質(zhì)控方法。在相關(guān)部門的管理下，各個醫(yī)院實驗室應(yīng)積極開展地高辛TDM的EQA，采用統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)的地高辛TDM質(zhì)控品來改善實驗室之間、方法之間以及方法內(nèi)的偏差，以便為臨床診斷提供更好的服務(wù)。

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(本文編輯：龔曉霖)

注： 焦瑞寶與唐吉斌對本研究具有同等貢獻(xiàn)，并列為第一作者。

收稿日期：(2015-01-23)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)05-0437-05R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.007

通訊作者：李水軍，聯(lián)系電話：021-54031835。

作者簡介：孫賀偉，男，1991年生，學(xué)士，主要從事質(zhì)譜技術(shù)生物分析工作。

基金項目：上海市藥學(xué)會科研基金資助項目(2014-YY-02-19)