CD51陽性心肌細(xì)胞對(duì)心肌梗死后小鼠心功能改善的作用

作者單位：510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科

CD51陽性心肌細(xì)胞對(duì)心肌梗死后小鼠心功能改善的作用

林婉文楊珂廖延姜美花彭朝權(quán)

【摘要】目的探討CD51陽性(CD51+)的心肌細(xì)胞移植治療AMI后心臟結(jié)構(gòu)及功能變化。方法取C57小鼠14只隨機(jī)分為對(duì)照組(n=7)和細(xì)胞移植組(n=7)，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制成心肌梗死模型。細(xì)胞移植組心肌梗死后立即于心肌梗死部位注射轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋白的CD51+心肌細(xì)胞(RFP-CD51)，對(duì)照組注射生理鹽水。移植后1周及1個(gè)月分別用小動(dòng)物心臟彩色多普勒超聲(彩超)儀檢測心功能指標(biāo)的變化及組織形態(tài)改變，并且在移植后1個(gè)月時(shí)觀察RFP-CD51細(xì)胞是否分化為成熟心肌細(xì)胞。結(jié)果細(xì)胞移植組的小鼠在1周及1個(gè)月時(shí)的心臟彩超均顯示LVEF、左心室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，左心室收縮末容積(LVESV)小于對(duì)照組(P<0.05),而左心室舒張末容積(LVEDV)則無顯著差異(P>0.05)。在心肌梗死3周后發(fā)現(xiàn)移植的CD51+細(xì)胞分化為成熟心肌細(xì)胞。結(jié)論AMI后的CD51+心肌細(xì)胞移植可分化為成熟心肌細(xì)胞、改善心功能、防止心臟重構(gòu)、減輕心腔擴(kuò)大。

【關(guān)鍵詞】CD51；心肌梗死； 分化； 移植

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.06.003

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81370214)；廣東省自然科學(xué)基金(S2013010016392)

通訊作者，彭朝權(quán)，E-mail:pengcq123456@163.com

收稿日期：(2015-01-06)

Effect of CD51-positive myocardial cell on improving heart function after myocardial infarction in mouseLinWanwen,YangKe,LiaoYan,JiangMeihua,PengChaoquan.DepartmentofCardiovascular,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

Correspondingauthor,PengChaoquan,E-mail:pengcq123456@163.com

Abstract【】ObjectiveTo discuss the cardiac structural and functional changes after CD51+ myocardial cell transplantation in the treatment of acute myocardial infarction (AMI). MethodsFourteen C57 mice were randomly divided into the control (n=7) and cell transplantation groups (n=7). Left anterior descending coronary artery was ligated to establish AMI mouse model. In the cell transplantation group, CD51+ myocardial cells transfected with red fluorescent protein (RFP-CD51) were injected to the myocardial infarction sites immediately after AMI, and phosphate buffer saline was administered in the control group. At 1 week and 1 month after cell transplantation, the changes in the heart function indexes and tissue morphology were detected by small animal ultrasonography. The differentiation of RFP-CD51 cells into mature myocardial cells was observed at 1 month following cell transplantation. ResultsSmall animal ultrasonography revealed that left ventricular ejection fraction (LVEF) and left ventricular fractional shortening (LVFS) were significantly higher compared with those in the control group at 1 week and 1 month after cell transplantation (both P<0.01). Left ventricular end-systolic volume (LVESV) in the cell transplantation group was significantly lower than that in the control group (P<0.05). Left ventricular end-diastolic volume (LVEDV) did not significantly differ between two groups (P>0.05). The transplanted CD51+ cells were differentiated into mature myocardial cells at 3 weeks after AMI. ConclusionsAfter AMI, transplanted CD51+ myocardial cells can differentiate into mature myocardial cells, which improve heart function, prevent cardiac remodeling and mitigates cardiac chamber enlargement.

【Key words】CD51; Myocardial infarction; Differentiation; Transplantation

AMI是一種嚴(yán)重的致死致殘疾病，雖然藥物治療和介入治療的成熟已大大降低心肌梗死的致死率，但是在心肌梗死后，梗死的心肌無法再生，最終引起心力衰竭等嚴(yán)重后果。近年來由于干細(xì)胞研究的突飛猛進(jìn)帶來AMI的干細(xì)胞治療的新希望，尤其是心臟來源的心肌干細(xì)胞[1]。但目前心肌干細(xì)胞仍沒有統(tǒng)一的、特異的表面標(biāo)記物。因此，尋求新的表面標(biāo)記物，并證明其對(duì)心功能的修復(fù)作用，成為近年來干細(xì)胞研究的新熱點(diǎn)[2]。CD51又稱為整合素蛋白αV，在胚胎器官生成、血管發(fā)生、纖維化過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。有研究報(bào)道CD51在睪丸、心臟等器官均有表達(dá)，在一定條件下可以進(jìn)行增殖、分化，并且隨著年齡的增長、組織的成熟，其表達(dá)數(shù)量逐漸減少[4]。提示CD51可能是成體干細(xì)胞標(biāo)志物。因此，我們通過比較心肌梗死后注射鹽水對(duì)照和移植細(xì)胞的小鼠心功能的不同，為CD51+心肌細(xì)胞修復(fù)心功能提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇無特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6小鼠14只，雄性，5月齡，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。

二、主要試劑和儀器

1.主要試劑

DMEN/F12(Hyclone)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，IMDM 培養(yǎng)基(Thermo)，B27、CT-1、EGF、bFGF、β-巰基乙醇、L-谷氨酰(Sigma)，1%雙抗、10%胎牛血清、DNA酶I、胰蛋白酶(Gibco)，慢病毒質(zhì)粒包裝系統(tǒng)pGC FU-RFP-LV( 上海吉?jiǎng)P基 因化學(xué)技術(shù)有限公司)，OCT 包埋劑(Sakura)，熒光封片劑(DAKO)，流式抗體PE-CD51 (Ebiosciences)，免疫熒光染色所用一抗CD51抗體購于美國BD公司，Alpha sarcomeric actin抗體購于Sigma 公司，熒光二抗包括488、594 標(biāo)記山羊抗小鼠和488、594 標(biāo)記山羊抗兔抗體、IgG抗體均購于Invitrogen公司。

2.主要實(shí)驗(yàn)儀器和器材

冰凍切片機(jī)(Leica公司CM1900)、激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss公司)、熒光倒置顯微鏡(Olympu 公司IX71-22FL/PH)、小動(dòng)物呼吸機(jī)、心臟彩色多普勒超聲(彩超)儀、流式細(xì)胞儀等。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.CD51+細(xì)胞的分選

將移植后7 d C57小鼠斷頸處死, 取出心臟加入Ⅱ型膠原酶及DNA酶Ⅰ,使用組織細(xì)胞勻漿儀制成細(xì)胞懸液,1 100×g離心4 min,HBSS沖洗后離心、過濾后重懸調(diào)整濃度至1×108/ml,加入抗CD51-PE(1∶20), 4℃避光孵育30 min,HBSS清洗、227×g離心、 重懸后用流式細(xì)胞儀收集陽性細(xì)胞。

2.細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增

65% DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和35% IMDM培養(yǎng)基，加入2%的B27、4 ng/ml CT-1、10 μg/ml EGF、160 μg/ml bFGF、1%谷氨酰胺、0.1 mmol/L β巰基乙醇、1%雙抗即成心肌干細(xì)胞培養(yǎng)基。將CD51+心肌細(xì)胞后接種于心肌干細(xì)胞培養(yǎng)基，以5×104～8×104cells/cm2接種到培養(yǎng)瓶中,置37℃、5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2～3 d換液1次。

3.紅色熒光CD51細(xì)胞制備

取第2代生長旺盛的小鼠CD51細(xì)胞,用 0.25%的胰酶消化并計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)前1 d接種1×106個(gè)細(xì)胞于75 cm2培養(yǎng)瓶中。加新鮮培養(yǎng)液10 ml。待感染細(xì)胞的融合率約為50% 時(shí),再行細(xì)胞感染。棄去舊培養(yǎng)液,每瓶加入9 ml心肌干細(xì)胞培養(yǎng)液和3 μl轉(zhuǎn)染試劑(50 μg/ml),加入紅色熒光病毒液600 μl。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶,使培養(yǎng)基和病毒等試劑充分混勻,然后把培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育。8～12 h以后觀察細(xì)胞狀態(tài),棄去細(xì)胞上清液,更換新鮮培養(yǎng)基。感染2 d后,觀察可見紅色熒光表達(dá)。此后每2～3 d換液1次并觀察紅色熒光表達(dá)情況。

4.懸滴培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)生長期的CD51陽性細(xì)胞, 以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA混合消化液吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液, 取1×105個(gè)細(xì)胞用2 ml培養(yǎng)液重懸,小滴接種于10 cm的培養(yǎng)皿蓋內(nèi)表面, 制成每滴20 μl的單細(xì)胞懸液，每個(gè)細(xì)胞皿50小滴，2個(gè)皿可移植1只小鼠。皿內(nèi)盛PBS 10 ml, 置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。將所有液滴收集在一起，按照每1×105個(gè)細(xì)胞用25 μl PBS重懸后即可進(jìn)行小鼠心肌注射。

5.AMI模型制備

取5個(gè)月的雄性C57小鼠14只，體質(zhì)量(25±3)g，隨機(jī)分成2組：分別為對(duì)照組、細(xì)胞移植組。小鼠以水合氯醛40 g/L腹腔注射麻醉，備皮后氣管插管，連通人工呼吸機(jī)正壓通氣，于第3～4肋間做0.8～1 cm長的切口，暴露左心耳和前室間溝，在冠狀動(dòng)脈左前降支起始部0.3 cm處結(jié)扎。見左心室前壁明顯變白為造模成功，細(xì)胞移植組在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后于結(jié)扎處下方1 mm處心肌注射入CD51+細(xì)胞懸液10 μl(含細(xì)胞約105個(gè))，而對(duì)照組則是心肌注射生理鹽水10 μl。后關(guān)閉胸腔。

6. 心功能檢測

移植后1周及1個(gè)月將小鼠進(jìn)行彩超檢測。測定LVEF、左心室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)、左心室收縮末期容積(LVESV)、左心室舒張末期容積(LVEDV)。

7.組織冰凍切片制作

測定心功能指標(biāo)后以水合氯醛(40 mg/kg，腹腔注射)麻醉小鼠，固定小鼠于解剖手術(shù)臺(tái)上，剪開胸廓，先以生理鹽水30 ml灌注后再以40 g/L多聚甲醛心臟灌注固定組織，隨后取出心臟，放入多聚甲醛4℃固定12 h后用300 g/L蔗糖溶液過夜脫水。脫水完畢后將心臟用液態(tài)OCT包埋劑包埋，調(diào)整好位置使心尖向上，轉(zhuǎn)移至-20℃至包埋劑凝固為固態(tài)，將該組織切為6 μm厚度的切片。

8.組織免疫熒光染色

0.01 mol/L的PBS沖洗組織上的OCT后，后山羊血清封閉40 min。吸出血清后加入一抗抗體Alpha sarcomeric actin(1∶250稀釋)后于4℃過夜, 次日取出在室溫復(fù)溫30 min,0.01 mol/L的PBS洗3次,每次5 min。加入相應(yīng)二抗, 室溫孵育40 min, 0.01 mol/L的PBS洗3次, 每次5 min。用DAPI染核4 min，0.01 mol/L的PBS漂洗后加入20 μl熒光封片劑封片, 封好片的樣品可于熒光倒置顯微鏡或激光共聚焦照相系統(tǒng)下觀察拍照。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、小鼠CD51+細(xì)胞體外培養(yǎng)特性

細(xì)胞分選后接種于含有心肌干細(xì)胞培養(yǎng)基的孔板中，24 h后出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，倒置相差顯微鏡下可以看到該細(xì)胞形態(tài)為貼壁的成纖維細(xì)胞狀(圖1)。成熟心肌細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)蛋白Alpha sarcomeric actin免疫熒光染色呈陰性(圖2)。

圖1光鏡下培養(yǎng)30 d后小鼠CD51陽性心肌細(xì)胞的形態(tài)特征

A: CD51陽性細(xì)胞的形態(tài)為貼壁的成纖維細(xì)胞狀(×200)；B：CD51陽性細(xì)胞形態(tài)(×400)

圖2熒光免疫染色顯示小鼠CD51陽性心肌細(xì)胞的alpha sarcomeric actin表達(dá)

A: Alpha sarcomeric actin免疫熒光染色成陰性(紅色，×200)；B：細(xì)胞核由DAPI(藍(lán)色，×200)標(biāo)記；C：A圖與B圖合并(×200)

二、小鼠CD51+心肌細(xì)胞在心肌梗死后能有效改善左心功能

心肌梗死1周后行心臟彩超，與對(duì)照組相比，細(xì)胞移植組的小鼠LVEF明顯升高(t=3.577，P=0.014), LVFS亦顯著高于對(duì)照組(t=3.457，P=0.017)，而LVESV小于對(duì)照組(t=-2.278，P=0.047), LVEDV則無顯著差異(t=-1.690，P=0.124)，見表1、圖3。

表1　小鼠心肌梗死后不同時(shí)間段

三、CD51+細(xì)胞能發(fā)揮長期作用，防止心室重構(gòu)

小鼠心肌梗死1個(gè)月后，行心臟彩超檢測，可以看到細(xì)胞移植組的小鼠LVEF比對(duì)照組高(t=2.977，P=0.027), LVFS亦顯著高于對(duì)照組(t=2.818，P=0.034)，而LVESV小于對(duì)照組(t=-2.660，P=0.036), LVEDV則無顯著差異(t=-2.066，P=0.067)，見表1、圖4。

四、小鼠移植的CD51+細(xì)胞可在體內(nèi)分化為成熟心肌細(xì)胞

為了探究CD51+心肌細(xì)胞改善心肌梗死后小鼠心功能的作用，我們在移植細(xì)胞到小鼠心肌前進(jìn)行預(yù)處理，將CD51+細(xì)胞轉(zhuǎn)染了紅色熒光，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測紅色細(xì)胞百分率為93.4%(圖5)。移植到小鼠體內(nèi)1個(gè)月后，取心肌梗死部位的冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色，可見部分RFP-CD51+細(xì)胞分化為成熟的表達(dá)alpha-sarcomeric actin的橫紋心肌細(xì)胞(圖6)。

圖3心肌梗死小鼠移植后1周心臟彩超圖示左心室心肌梗死部位

A：細(xì)胞移植組；B：對(duì)照組

圖4心肌梗死小鼠移植后1周心臟彩超圖示左心室心肌梗死部位

A：細(xì)胞移植組；B：對(duì)照組

討論

心肌梗死后一個(gè)非常重要的病理生理環(huán)節(jié)是心肌細(xì)胞死亡，瘢痕形成，心肌病理重構(gòu)。目前隨著心肌梗死后及時(shí)的PCI介入治療及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的使用，心肌梗死的病死率已較前下降，但心肌梗死帶來的心肌細(xì)胞死亡、瘢痕組織和結(jié)締組織增生，可導(dǎo)致嚴(yán)重的心室收縮和舒張功能不全，最終帶來的左室重構(gòu)及慢性心力衰竭仍是困擾臨床醫(yī)師的一大問題。干細(xì)胞移植的提出為心臟結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)提供更大的空間。目前胚胎干細(xì)胞，骨髓來源的干細(xì)胞、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞及其他類型的干細(xì)胞已經(jīng)應(yīng)用于動(dòng)物及臨床試驗(yàn)中[5-8]。但其帶來的副作用如成瘤性、嚴(yán)重免疫抑制及倫理

圖5　造模前預(yù)處理轉(zhuǎn)染紅色熒光的CD51 +細(xì)胞

A：流式細(xì)胞檢測紅色熒光轉(zhuǎn)染效率；B：細(xì)胞轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋白，熒光顯微鏡下觀察可見大量紅色熒光表達(dá)(箭頭所示的紅色細(xì)胞，×200)

圖6　移植后1月的心梗部位切片可見RFP-CD51 +細(xì)胞分化為成熟心肌細(xì)胞

A：心肌梗死部位可見移植的CD51細(xì)胞自帶紅色熒光(箭頭所示的紅色細(xì)胞，×200)；B：心肌細(xì)胞上的alpha-sarcomeric actin免疫熒光染色為綠色，可見典型橫紋結(jié)構(gòu)(箭頭所示的綠色細(xì)胞，×200)；C：細(xì)胞核DAPI染色；D：合并圖像，移植細(xì)胞(紅色)與alpha-sarcomeric actin(綠色)有共定位、呈免疫熒光雙染(箭頭所示的細(xì)胞，×200)

學(xué)爭議限制了它們的發(fā)展。而心臟來源的干細(xì)胞則可避免了這些問題。已有研究認(rèn)為初生及成年哺乳動(dòng)物心臟存在一群心臟干細(xì)胞，它們存在不同的表型，但都具有多向分化、克隆形成和自我更新能力。2003年Beltrami等[11]首次提出c-kit為心臟干細(xì)胞標(biāo)記，具有多向分化及自我更新等干細(xì)胞功能，隨后的多項(xiàng)研究證實(shí)了其具有改善心肌梗死動(dòng)物心功能的作用，并已開始應(yīng)用于臨床研究。但干細(xì)胞移植后心臟結(jié)構(gòu)和功能的改善機(jī)制目前仍無統(tǒng)一定論[6]。而目前已知的成體心心肌干細(xì)胞亞群有c-kit 陽性干細(xì)胞、 Sca-1陽性干細(xì)胞、SP細(xì)胞、Isl-1陽性干細(xì)胞、SSEA-1陽性干細(xì)胞和心肌球來源的干細(xì)胞[9-10]。但這6個(gè)細(xì)胞群之間并沒有嚴(yán)格的界限，部分呈混合的共同存在，心肌干細(xì)胞目前仍沒有統(tǒng)一的特異的表面標(biāo)記。

CD51又稱為整合素蛋白αV，位于細(xì)胞膜上，在胚胎器官生成、血管發(fā)生、上皮組織炎癥發(fā)展和纖維化過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用[13]。研究報(bào)道CD51在睪丸、心臟等器官均有表達(dá)，在一定條件下可以進(jìn)行增殖、分化，并且隨著年齡的增長、組織的成熟，其表達(dá)數(shù)量逐漸減少。2013年P(guān)inho[14]的研究認(rèn)為PDGFRα+CD51+可以作為骨髓MSC的分子標(biāo)記物，并且證實(shí)了這群細(xì)胞與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)，可以促進(jìn)造血干細(xì)胞的生長。

本課題組已在心臟中將這群CD51+的細(xì)胞分離并進(jìn)行體外培養(yǎng)，證實(shí)了其具有較強(qiáng)的增殖能力，并且可以向成脂成骨等方向分化[4]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將這群培養(yǎng)的CD51細(xì)胞移植到心肌梗死小鼠心肌內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與生理鹽水對(duì)照組對(duì)比，在心肌梗死急性期(1周)內(nèi)及長期(1月)均有改善心臟結(jié)構(gòu)及功能的作用。在急性期內(nèi)，提高了心肌梗死小鼠的射血分?jǐn)?shù)，預(yù)防心室擴(kuò)大。并且這一作用可持續(xù)發(fā)揮，在長達(dá)1個(gè)月的觀察后，移植了細(xì)胞的心肌梗死小鼠模型的射血分?jǐn)?shù)和其他心功能與對(duì)照組比較仍具有顯著差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，在CD51+細(xì)胞移植后1個(gè)月，小鼠的冰凍切片免疫熒光染色，移植的帶紅色熒光的CD51+細(xì)胞可以分化為表達(dá)心肌特異性蛋白的成熟心肌，表現(xiàn)為alpha sarcomeric actin陽性，而培養(yǎng)中的CD51+細(xì)胞則為陰性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了該群類干細(xì)胞樣的CD51+的心肌細(xì)胞可以改善心肌梗死后小鼠的心臟結(jié)構(gòu)及功能，并且初步探討了其機(jī)制，可能與CD51細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞、減少心肌梗死后的心肌損失、防止心室重構(gòu)有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)可能為進(jìn)一步探究干細(xì)胞治療心臟疾病的具體機(jī)制及其臨床應(yīng)用提供了有效的證據(jù)。

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(本文編輯：楊江瑜)

基礎(chǔ)研究論著