茶皂苷的超聲波提取及抗真菌作用研究

夏曉萍俸春紅葉 紅鄭彩虹劉龍孝

（1.浙江大學(xué)藥學(xué)院；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所）

茶皂苷是來(lái)源于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物茶（Camellia sinensis L.）的果實(shí)（茶籽）中的一類三萜皂苷。根據(jù)研究表明，茶籽中的皂苷是實(shí)現(xiàn)其藥理作用的主要成分。茶皂苷屬五環(huán)三萜皂苷，由苷元、糖體和有機(jī)酸三部分組成，糖體連接在3位碳的取代基上。苷元系齊墩果烷型，由苷元母核及取代基組成。基本結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 茶皂苷的苷元母核結(jié)構(gòu)

茶皂苷提取法主要是水提法和有機(jī)溶劑法，本文在傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法基礎(chǔ)上，應(yīng)用超聲提取工藝，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察提取溶劑乙醇濃度、液料比、溫度和超聲時(shí)間對(duì)茶皂苷提取得率的影響，優(yōu)選出最佳提取方案。以高效液相色譜法測(cè)定茶皂苷含量。近年來(lái)，茶皂苷藥理作用成為研究的熱點(diǎn)，有學(xué)者報(bào)道茶皂苷有抗菌作用，民間也有將茶籽餅粕用于治療皮膚病的經(jīng)驗(yàn)方。本文考察茶皂苷對(duì)臨床常見的致病性真菌（念珠菌）的體外抗菌活性。

一、材料與方法

1.儀器與材料

（1）實(shí)驗(yàn)材料

茶籽系2014年11月采摘自浙江杭州龍井種(Camellia sinensis cv.Longjing)的成熟果實(shí)。茶皂苷對(duì)照品：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所提供(茶皂苷純度≥95%)。RPMI—1640培養(yǎng)基(含L-谷酰胺而不含碳酸氫鈉，含pH指示劑)（上海生工生物）；科瑪嘉顯色培養(yǎng)基（鄭州博賽生物技術(shù)有限公司）；沙保培養(yǎng)基（SHAB-101101）(法國(guó)生物梅里埃)；嗎啉基丙磺酸（MOPS）（上海生工生物）。甲醇（色譜純，PROLABO）其余試劑均為分析純。

（2）試驗(yàn)菌株

念珠菌30株：包括標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株6株：其中白色念珠菌4株（ATCC64548,ATCC90029,ATCC64550,ATCC10231）；近平滑念珠菌 1株（ATCC22019）；克柔念珠菌 1株（ATCC6258）。臨床分離株24株：其中白色念珠菌（Candida albicans）12株；光滑念珠菌(Candida glabrata)6株；克柔念珠菌(Candida krusei)3株；近平滑念珠菌(Candida krusei)3株。（標(biāo)準(zhǔn)菌種由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供、臨床分離株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院臨床分離)。

（3）試驗(yàn)設(shè)備與儀器

Agilent HP1100型高效液相色譜儀；超聲波清洗機(jī)（USC-702，江蘇昆山超聲儀器有限公司）；水浴恒溫振蕩器（DSH2-300，江蘇太倉(cāng)試驗(yàn)設(shè)備廠）；冷凍干燥機(jī)（VIRTIS）；生物安全柜（The Baker Company）；全自動(dòng)微生物分析儀(VITEK-Compact,法國(guó)生物梅里埃)；漩渦混合器（VORTEX-GENIE2）；生化培養(yǎng)箱 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)

2.試驗(yàn)方法

（1）茶皂苷的提取

茶籽脫殼、干燥、粉碎至40目篩，得淺黃色茶籽粉末。乙醚脫脂，干燥得脫脂茶籽粉。取一定量的脫脂茶籽粉按特定比例的料液比，加入乙醇溶液，超聲提取；超聲功率300W，超聲頻率40KHZ。過(guò)濾，濾液減壓回收溶劑，冷凍干燥，得茶皂苷提取物。

（2）超聲輔助提取茶皂苷的單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)及驗(yàn)證試驗(yàn)

以80%乙醇、料液比1∶10，超聲提取時(shí)間20min,提取溫度30℃，超聲功率300W，超聲頻率40KHZ的提取參數(shù)為基礎(chǔ)，以茶皂苷提取得率為考察指標(biāo)，依次進(jìn)行乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、溫度的單因素試驗(yàn)，分析各因素對(duì)提取得率的影響，進(jìn)行正交試驗(yàn)，并對(duì)正交試驗(yàn)最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證。

（3）茶皂苷檢測(cè)方法

高效液相色譜法檢測(cè)。

a.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取0.1g茶皂苷對(duì)照品，置于100mL容量瓶，加適量流動(dòng)相，超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。色譜柱：Agilent Zrobax SB-C18柱（4.6mm×150mm,5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（88：12）；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μ L。分別精密移取對(duì)照品樣儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋成濃度20μg/mL,40μg/mL,80μg/mL,160μg/mL，320μg/mL,640μg/mL系列濃度，記錄色譜峰面積。茶皂苷是由多種三萜類物質(zhì)組成的混合物，對(duì)照品的濃度與峰響應(yīng)值成線性，以對(duì)照品濃度X（μg/ml）對(duì)應(yīng)的峰面積Y制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量測(cè)定茶皂苷含量。

b.茶皂苷測(cè)定

精密稱取茶皂苷提取物0.1g，置于100mL容量瓶用流動(dòng)相溶解，移取5mL，稀釋至50mL即得供試液。供試液過(guò)0.45μm濾膜后進(jìn)樣。每個(gè)樣品平行制備3份供試品。在上述的色譜條件下，測(cè)定峰面積，計(jì)算茶皂苷含量。

c.茶皂苷提取得率計(jì)算

茶皂苷提取得率（%）=茶皂苷質(zhì)量／脫脂茶籽粉質(zhì)量×100%。

（4）抗真菌作用研究

采用美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）制定的酵母菌（M—27A）方案測(cè)定抗念珠菌活性。

a.試藥稀釋

先配制高濃度貯存液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，再以RPMI液體培養(yǎng)基稀釋成終濃度的2倍。其終濃度分別為1269.76μg/mL，634.88μg/mL，317.44μg/mL，158.72μg/mL， 79.36μg/mL，39.68μg/mL，19.84μg/mL，9.92μg/mL，4.96μg/mL。

b.試驗(yàn)培養(yǎng)基

按CLSI方案的要求采用RPMI—1640培養(yǎng)基。稱取RPMI—1640粉10.4g，MOPS34.53g，加入去離子水900mL，用1M NaOH調(diào)pH7.0(25℃),定容至1L。MOPS終濃度為：0.165mol/L,0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

c.菌懸液制備

念珠菌在沙保培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)種2次，以確保純度和活力。經(jīng)28℃培養(yǎng)48h,取5個(gè)直徑大于1mm的菌落于5mL無(wú)菌生理鹽水中震蕩15s，制成菌懸液。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板將其濃度調(diào)至菌濃度為1～5×106CFU/mL。然后用RPMI液基1∶50稀釋后再1∶20稀釋，（即共稀釋1000倍），至菌濃度1～5×103CFU/mL。

d.接種、培養(yǎng)

取微孔96孔板，1～9列孔中由高濃度至低濃度分別加0.1mL藥液，再加0.1mL菌懸液。11號(hào)孔加0.2mL菌懸液（陽(yáng)性孔）,12號(hào)孔加0.2mL空白對(duì)照。（不加藥物的液基）。

藥敏板用塑料包裹后，念珠菌35℃培養(yǎng)48h。觀察結(jié)果。

e.結(jié)果判讀

按照CLSI制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀。最小抑菌濃度(MIC)為肉眼直接觀察到的真菌生長(zhǎng)的完全被抑制時(shí)的藥物濃度。在一批實(shí)驗(yàn)中，所有被測(cè)菌株得到的MIC值為MIC范圍；能抑制50%或80%受試菌所需的MIC值，分別為MIC50值和MIC80值。

二、結(jié)果與分析

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定和精密度試驗(yàn)

按色譜條件對(duì)照樣系列溶液進(jìn)樣分析,分別以對(duì)照樣系列溶液的峰面積為縱坐標(biāo),以對(duì)照品樣系列溶液的質(zhì)量濃度X（μg/mL）,繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：X=0.239Y-14.336，r=0.9998。結(jié)果表明在濃度20～640μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取160μg/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄保留時(shí)間和峰面積，RSD（n=6）分別為1.97%和1.73%。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取制備的茶皂苷提取物，共6份，平行制備供試液，進(jìn)樣體積10μL，記錄色譜峰面積，RSD為2.95%（n=6）

2.單因素對(duì)茶皂苷提取得率的影響

(1)溫度對(duì)茶皂苷提取得率的影響

分別選擇30℃、40℃、50℃、60℃和70℃ 5個(gè)溫度,以80%乙醇為提取溶劑，料液比1∶10，超聲時(shí)間20min，超聲功率300W，超聲頻率40KHZ為參數(shù)。考察溫度對(duì)茶皂苷提取得率的影響。圖2A顯示：溫度升高有利于茶皂苷的提取，但當(dāng)溫度升至70℃的提取得率與溫度60℃的相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且溫度過(guò)高，易引起茶皂苷結(jié)構(gòu)的變化。因此，選擇40℃、50℃、60℃作為正交試驗(yàn)因素水平。

(2)乙醇濃度對(duì)茶皂苷提取得率的影響

分別選擇50%、60%、70%、80%、90%乙醇水溶液5個(gè)濃度提取溶劑，以料液比1∶10，超聲時(shí)間20min，超聲功率300W，超聲頻率40KHZ為參數(shù)，考察不同濃度的乙醇提取溶劑，對(duì)茶皂苷提取得率的影響。圖2B顯示：隨著提取溶劑含水量增加，茶皂苷提取得率增加。80%乙醇的茶皂苷提取得率顯著高于90%乙醇（P＜0.01）；70%乙醇茶皂苷提取得率高于80%的乙醇提取得率（P＜0.05）；但60%乙醇和70%乙醇的茶皂苷提取得率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，茶皂苷提取得率較高但雜質(zhì)增加。故選擇70%、80%、90%乙醇作為正交試驗(yàn)的因素水平。

(3)超聲時(shí)間對(duì)茶皂苷提取得率的影響

提取時(shí)間分別選擇 10 min、20 min、30 min、40 min、50min，以80%乙醇為提取劑，料液比1∶10，超聲功率300W，超聲頻率40KHZ為參數(shù)?？疾斐晻r(shí)間對(duì)茶皂苷提取得率的影響。圖2C顯示：初始，隨著超聲時(shí)間增加，茶皂苷提取得率隨之增加，但時(shí)間超過(guò)30min，得率不增加。因此：選擇20min、30min、40min為正交試驗(yàn)因素水平。

(4)料液比對(duì)茶皂苷提取得率的影響

分別選擇1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30料液比，以80%乙醇作為提取溶劑，超聲時(shí)間20min，超聲功率300W，超聲頻率40KHZ為參數(shù)?？疾觳煌弦罕?，對(duì)茶皂苷提取得率的影響。圖2D顯示：隨著料液比提高，茶皂苷提取得率并沒(méi)有相應(yīng)增加。因此選擇1∶10、1∶15、1∶20為正交試驗(yàn)因素水平。

3.正交試驗(yàn)

為了全面考察茶皂苷提取得率的影響因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取4因素3水平，即L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素見表1，L9（34）正交試驗(yàn)見表2，每個(gè)水平重復(fù)試驗(yàn)3次。通過(guò)極差比較和F檢驗(yàn)法對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

圖2 單因素對(duì)茶皂苷得率的影響

表2中的R值顯示：4種因素對(duì)茶皂苷提取得率的影響程度依次為B＞A＞C＞D，其中B因素的影響遠(yuǎn)大于其他3種因素。超聲提取茶皂苷的最佳方案：B1D2C3D3，即70%乙醇濃度，料液比1∶15，超聲時(shí)間40分鐘，提取溫度60℃。

表3的F檢驗(yàn)結(jié)果顯示：乙醇濃度（B因素）、液料比（D因素）、超聲時(shí)間（C因素）、提取溫度（A因素）均對(duì)茶皂苷提取得率具有顯著的影響。

表1 茶皂苷提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平設(shè)置

表2 茶皂苷提取的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 茶皂苷提取的正交試驗(yàn)的方差分析

4.超聲輔助提取茶皂苷最佳工藝檢驗(yàn)結(jié)果

按優(yōu)選的最佳工藝條件，提取茶皂苷并重復(fù)試驗(yàn)3次。結(jié)果為提取得率：18.06%，RSD：2.78%。提取得率大于正交試驗(yàn)中的組合。

5.茶皂苷體外抗真菌活性

微孔藥敏板35℃培養(yǎng)48h。將每孔生長(zhǎng)情況與陽(yáng)性孔和空白對(duì)照孔相比較，可見陽(yáng)性孔念珠菌生長(zhǎng)良好，空白對(duì)照孔無(wú)念珠菌生長(zhǎng)。茶皂苷對(duì)念珠菌體外抗菌活性見表4。結(jié)果顯示：茶皂苷體外抗念珠菌活性顯著。

表4 茶皂苷抗念珠菌活性 （μg/mL）

三、討論

1.超聲提取技術(shù)是利用超聲波輻射產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、乳化作用、擴(kuò)散作用等增加物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的頻率和速度，增大溶劑的穿透力，加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，快速、高效提取細(xì)胞內(nèi)容物。與傳統(tǒng)的萃取提取技術(shù)比較，能顯著地提高提取效率。本試驗(yàn)得到了較優(yōu)的提取工藝參數(shù)：70%乙醇濃度，料液比1∶15，超聲時(shí)間 40min，提取溫度60℃，提取得率達(dá)18.06%；溶劑用量（料液比）顯示并不與提取得率成正比。

2.念珠菌（假絲酵母菌）是引起真菌病中最常見的機(jī)會(huì)致病性真菌。念珠菌可引起淺部真菌感染，也會(huì)引起深部真菌感染。白色念珠菌在念珠菌屬中最為常見，致病性最強(qiáng)?；诃h(huán)境、氣候因素，尤其是臨床廣譜抗生素、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑等的廣泛使用，導(dǎo)致念珠菌感染臨床高發(fā)。臨床上現(xiàn)有的抗真菌藥物如唑類抗真菌藥、兩性霉素B等在高效低毒、耐藥性方面的評(píng)價(jià)不能令人滿意。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示：茶皂苷有較好的體外抗念珠菌活性，其中對(duì)光滑念珠菌的抗菌活性最強(qiáng)MIC80僅79.36μg/mL，白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌克的柔念珠菌MIC80值317.44μg/mL，茶皂素是山茶屬植物重要活性成分，茶皂苷抗真菌活性顯著，其藥理活性值得進(jìn)一步研究。