5個(gè)紫蘇變種的老化種子的活力研究

朱旭海， 尹冬梅， 王仕玉， 郭鳳根， 張文平

（1．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院， 昆明650201； 2．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院， 昆明650201；3．宣威市農(nóng)業(yè)局種子管理站， 云南 曲靖655400）

紫蘇（Perilla frutescens （L．）Britt．）為唇形科紫蘇屬的一年生草本植物，云南境內(nèi)分布有白蘇（var．frutescens L．）、 紫 蘇 （var arguta （Benth．）Hand，－Mazz．）、回 回 蘇 （var．crispa Deane ex Bailey）、耳齒紫蘇（var．a(chǎn)uriculato－dentata C．Y．Wu et Hsuan）和野生紫蘇（var．purpurascens（Hayata）H．W．Li）共5個(gè)變種［1］。紫蘇在我國(guó)種植約有2000年歷史，目前各地均有栽培，是衛(wèi)生部首批頒布的60種“藥食同源”植物之一，具有藥用、油用、香料、食用等多方面的價(jià)值［2］。紫蘇富含多不飽和脂肪酸，含量可達(dá)總脂肪酸含量的90%以上，其中α－亞麻酸含量高達(dá)60%以上，α－亞麻酸屬ω－3系列多不飽和脂肪酸，為人體必需脂肪酸，是維持大腦和神經(jīng)功能所必需的因子，具有保護(hù)視力、抗血栓、降低血脂和促進(jìn)胰島素分泌等生理作用［3］。紫蘇作為目前發(fā)現(xiàn)的α－亞麻酸含量最高的植物資源，是具有較好應(yīng)用前景的油脂工程研究對(duì)象［4］。

郭鳳根等發(fā)現(xiàn)當(dāng)年秋天收獲并室溫保存的紫蘇種子在第2年春天播種發(fā)芽率可達(dá)100%，到第3年播種發(fā)芽率幾乎為0%（未發(fā)表）［1］。楊國(guó)會(huì)等以室溫保存的紫蘇種子為材料，分別于第2年的5、6、7、8、9、10月份測(cè)定其發(fā)芽率和電導(dǎo)率，發(fā)現(xiàn)紫蘇種子的發(fā)芽率隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，尤其在經(jīng)過(guò)7、8月份的高溫多濕季節(jié)后，發(fā)芽率大幅度下降，浸泡液電導(dǎo)率與其發(fā)芽率呈極顯著負(fù)相關(guān)［7］。姚悅梅等研究了不同儲(chǔ)存方式和包裝材料對(duì)1年內(nèi)紫蘇種子發(fā)芽率的影響，發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存方式比包裝材料對(duì)紫蘇種子發(fā)芽的影響更明顯［5］。盛束軍等研究了包裝材料和大氣成分對(duì)紫蘇種子發(fā)芽率的影響，認(rèn)為紫蘇種子宜在0℃下用鋁箔袋包裝貯藏［6］。日本學(xué)者M(jìn)asumoto等研究了4℃干燥條件下儲(chǔ)藏1～20年的回回蘇種子發(fā)芽情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)儲(chǔ)存時(shí)間為5～8年時(shí)，回回蘇種子的發(fā)芽率為65%～70%，當(dāng)儲(chǔ)藏時(shí)間超過(guò)9年時(shí)，發(fā)芽率降為0%［14］。其他4個(gè)變種經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間貯藏后發(fā)芽情況如何，以及5個(gè)紫蘇變種的活力差異仍有待進(jìn)一步研究。隨著紫蘇資源的開發(fā)利用，栽培面積將不斷增大，其種質(zhì)資源的保存已成為眾人關(guān)注的問(wèn)題。本研究以4℃冰箱中低溫貯藏5年的5個(gè)紫蘇變種的14份種子為材料，探討遺傳和環(huán)境因子對(duì)紫蘇老化種子活力的影響，并篩選出評(píng)判紫蘇種子劣變程度的指標(biāo)，為紫蘇種質(zhì)資源保存和遺傳育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材 料

本研究所用的14份紫蘇資源收集自云南省內(nèi)的9個(gè)縣市，并于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)種植多年，由郭鳳根教授根據(jù)形態(tài)特征鑒定并歸屬于紫蘇種下的5個(gè)變種，它們的編號(hào)、產(chǎn)地、分類地位和種子特征詳見表1。所有紫蘇種子均采集于2009年10月，自然風(fēng)干后裝在自封袋中，置于4℃冰箱中保存，于2014年8月取出進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 14份云南紫蘇試材

1．2 方 法

1．2．1 發(fā)芽試驗(yàn)

從每份樣品中隨機(jī)選取100粒種子，分散于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，并用蒸餾水將濾紙充分浸濕，將培養(yǎng)皿置于溫度為25℃，光照強(qiáng)度1 000～2 000 lx，光照時(shí)間為12 h／d的培養(yǎng)箱中。從第3天開始每天記錄發(fā)芽數(shù)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，發(fā)芽種子數(shù)連續(xù)3 d不再增加即停止觀察。3次重復(fù)。

發(fā)芽率（%）＝發(fā)芽種子數(shù)／供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(shì)（%）＝第7天發(fā)芽種子數(shù)／供試種子數(shù)×100%；

活力指數(shù)＝S×（G t／D t），式中，S 為幼苗根長(zhǎng)（cm）；

發(fā)芽指數(shù)＝∑G t／D t，式中，G t指在t天的發(fā)芽數(shù)，D t為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)，∑為求和總數(shù)［8］。

1．2．2 生理指標(biāo)測(cè)定

采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性［9］，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定參考王學(xué)奎［10］的方法，采用分光光度法測(cè)定丙二醛（MDA）和脯氨酸含量［11］。稱取種子0．2 g，用去離子水沖洗干凈，20℃浸泡24 h，測(cè)定其電導(dǎo)率。以上各項(xiàng)測(cè)定均做3次重復(fù)。

1．2．3 數(shù)據(jù)分析

先用Excel對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，再采用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各個(gè)測(cè)量指標(biāo)的方差分析、多重比較和相關(guān)性分析。

表2 5個(gè)紫蘇變種的種子活力差異

2 結(jié)果與分析

2．1 不同紫蘇變種的種子活力比較

5個(gè)老化紫蘇變種的種子活力分析結(jié)果見表2。由表2可知，白蘇和耳齒紫蘇的千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)都極顯著高于野生紫蘇、紫蘇和回回蘇；白蘇的千粒重、脯氨酸含量和POD活性顯著高于耳齒紫蘇；白蘇的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗根長(zhǎng)、活力指數(shù)、電導(dǎo)率、MDA含量和CAT活性與耳齒紫蘇差異不顯著；野生紫蘇的千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗根長(zhǎng)和脯氨酸含量顯著高于紫蘇和回回蘇；紫蘇的千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、MDA含量顯著高于回回蘇。綜上所述，白蘇和耳齒紫蘇耐貯性較好，野生紫蘇和紫蘇次之，回回蘇較差。

2．2 紫蘇老化種子活力與千粒重和生理生化指標(biāo)間的相關(guān)性

紫蘇老化種子活力指標(biāo)與千粒重和生理生化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析結(jié)果見表3。由表3可知，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等指標(biāo)間都呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明這些指標(biāo)確實(shí)反映了紫蘇種子的發(fā)芽能力和活力。千粒重與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)間都呈極顯著正相關(guān)，與MDA呈顯著負(fù)相關(guān)，與CAT活性呈極顯著正相關(guān)；電導(dǎo)率與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)間都呈顯著負(fù)相關(guān)；MDA含量與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)間都呈極顯著負(fù)相關(guān)，與活力指數(shù)間呈顯著負(fù)相關(guān)；CAT活性與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)間都呈極顯著正相關(guān)；脯氨酸含量和POD活性與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)間的相關(guān)性都未達(dá)到顯著水平。

表3 相關(guān)性分析結(jié)果

3 討 論

3．1 遺傳因素對(duì)紫蘇種子活力的影響

種子活力的高低是由遺傳因素、種子發(fā)育期間的環(huán)境條件及種子貯藏條件3個(gè)方面共同決定［12］。本研究中14份紫蘇種子的貯藏條件和發(fā)育期間環(huán)境條件相同，但不同紫蘇變種的種子活力存在極顯著差異。種子活力與千粒重呈極顯著正相關(guān)，由于種子大小主要由遺傳因素決定，說(shuō)明紫蘇種子活力大小由遺傳因素決定。李會(huì)珍等［13］研究了10個(gè)不同品種紫蘇的種子性狀，發(fā)現(xiàn)粗脂肪含量與種子千粒重均呈顯著正相關(guān)，而蛋白質(zhì)含量、粗纖維含量與千粒重間相關(guān)性不顯著。推測(cè)由于千粒重大的種子內(nèi)儲(chǔ)存脂肪較多，在種子長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存中未被完全氧化，所以種子活力得以保持。白蘇和耳齒紫蘇種子的千粒重極顯著高于其他變種，長(zhǎng)時(shí)間保存后仍具有較高的活力，說(shuō)明這2個(gè)變種的耐貯性較好。

3．2 儲(chǔ)藏條件對(duì)紫蘇種子活力的影響

紫蘇種子因其含油量高，易于發(fā)生老化劣變，在室溫條件下儲(chǔ)存經(jīng)一個(gè)高溫高濕季節(jié)后其萌發(fā)率顯著下降，失去種用價(jià)值。本研究中，4℃冰箱貯藏5年的回回蘇變種的發(fā)芽率為21．88%，低于日本學(xué)者［14］研究所得發(fā)芽率，表明干燥條件可以提高紫蘇種子的耐貯性，所以紫蘇種子保存的最適宜條件為低溫、干燥、密閉環(huán)境。

3．3 衡量紫蘇種子劣變程度指標(biāo)的篩選

種子衰老的主要原因是活性氧對(duì)植物組織的傷害，組織內(nèi)活性氧和自由基的積累導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，引起代謝紊亂，種子生活力喪失。POD和CAT是自由基和活性氧的清除劑，被視為2種保護(hù)酶，能維護(hù)膜的穩(wěn)定性及完整性，對(duì)細(xì)胞膜保護(hù)起著重要作用［8］。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，它可以代表細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化水平和生物膜損傷程度的大小，膜系統(tǒng)的損傷是種子活力下降的一個(gè)顯著特征［11］。在種子老化劣變過(guò)程中，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的受損會(huì)導(dǎo)致吸脹過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)含物外滲，使種子浸泡液電導(dǎo)率升高，因此可通過(guò)測(cè)定種子浸出物的電導(dǎo)率來(lái)預(yù)測(cè)種子的活力水平［9］。在逆境條件下，植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加，因此，有人提出游離脯氨酸的含量可作為植物抗逆性的指標(biāo)［11］。和紅曉等認(rèn)為，山核桃屬植物種子在貯藏過(guò)程中劣變的原因主要是酶含量的下降和膜透性增大［15］。張苗苗研究了自然貯藏和人工老化兩種條件下的加拿大披堿草和老芒麥種子的活力，發(fā)現(xiàn)2種牧草種子的活力與電導(dǎo)率相關(guān)性顯著，與氨基酸含量相關(guān)性不顯著［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇老化種子的活力與種子千粒重和CAT活性呈極顯著正相關(guān)，與電導(dǎo)率和MDA含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，與脯氨酸含量和POD活性相關(guān)性不顯著。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可將千粒重、電導(dǎo)率、MDA含量和CAT活性作為衡量種子劣變程度的指標(biāo)。

［1］郭鳳根，王仕玉．云南境內(nèi)紫蘇種下變異的研究［J］．植物研究，2000，20（3）：270－274．

［2］張洪，黃建韶，趙東海．紫蘇營(yíng)養(yǎng)成分的研究［J］．食品與機(jī)械，2006，22（2）：41－43．

［3］Kim EK，Lee SJ，Lim BO，et al．Antioxidative and neuroprotective effects of enzymatic extracts from leaves of Perilla frutescens var．japonica［J］．Food Sci Biotechnol，2008，17：279－286．

［4］胡彥，丁友芳，溫春秀．紫蘇屬植物種子含油率及其脂肪酸組成［J］．食品科學(xué)，2010，31（14）：165－169．

［5］姚悅梅，王建華．儲(chǔ)存方式和包裝材料對(duì)紫蘇種子發(fā)芽的影響［J］．農(nóng)業(yè)科技通訊，2008（2）：38－40．

［6］盛束軍，徐秀瑛，方堅(jiān)．包裝材料和大氣成分對(duì)紫蘇種子發(fā)芽率影響的研究［J］．中藥材，1992，15（5）：7－9．

［7］楊國(guó)會(huì)，馬堯，李如生，等．紫蘇種子貯藏時(shí)間與其發(fā)芽率及膜透性關(guān)系的研究［J］．特產(chǎn)研究，2000（4）：41－42．

［8］顏啟傳．種子學(xué)［M］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：103－118．

［9］張志良．植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（第3版）［M］．北京：高等教育出版社，2003．

［10］王學(xué)奎．植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)（第2版）［M］．北京：高等教育出版社，2006．

［11］高俊鳳．植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］．北京：高等教育出版社，2006．

［12］孫群，王建華，孫寶啟．種子活力的生理和遺傳機(jī)理研究進(jìn)展［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（1）：48－53．

［13］李會(huì)珍，孫子文，李曉君．紫蘇種子性狀與主要營(yíng)養(yǎng)成分相關(guān)性分析［J］．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2013，28（10）：55－59．

［14］Masumoto N，Ito M．．Germination rates of perilla（Perilla frutescens L．）Britton）mericarps stored at 4℃ for 1—20 years［J］．J Nat Med，2010，64：378－382．

［15］和紅曉，呂芳德，潘克玉．貯藏條件對(duì)山核桃屬植物種子生活力的影響［J］．經(jīng)濟(jì)林研究，2013，31（1）：20－24．

［16］張苗苗．兩種披堿草屬牧草種子劣變的生理生化研究［D］．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011．