7種不同藥劑對番茄種子除害處理效果評價與研究

王溪橋， 李春雷， 尤 佳， 左佳妮， 文朝慧， 王軍平

（甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心， 蘭州730010）

番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病 （Tomato bacterial speck），由丁香假單胞桿菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pv．tomato，PST）所引起。PST危害番茄的果實(shí)、葉、莖和花，且其危害時間可從苗期至收獲期之久［1］。番茄細(xì)菌性葉斑病菌不但影響番茄的產(chǎn)量，而且會在一定程度上降低番茄的品質(zhì)。我國大面積種植番茄，番茄的種植面積在我國商業(yè)蔬菜面積和設(shè)施農(nóng)業(yè)中都占有較大比例，其產(chǎn)量的高低直接影響農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入。自1933年以來，番茄細(xì)菌性葉斑病菌危害到美國、前蘇聯(lián)、加拿大等20多個國家，最嚴(yán)重的造成番茄產(chǎn)量減產(chǎn)75%［2］。此外，在國內(nèi)，繼臺灣發(fā)現(xiàn)該病后，吉林省（1998—1999年）長春市、黑龍江省和遼寧?。?999年）的番茄產(chǎn)區(qū)以及甘肅、山西等省有些番茄品種也受到該病菌的危害［1］。

種傳病害是90%左右的食用作物的重要初染源之一［3］。H．Yunis等［2］研究證明，PST 病菌在干燥的種子上可存活20年之久。一些地區(qū)新病害的出現(xiàn)且連年發(fā)生的根本原因就是其播種的種子攜帶致病菌［4－6］。Okechukwu 等［7］對 豇 豆 細(xì) 菌 疫 病 病 菌Xanthomonas campestris pv．vignicola 誘發(fā)豇豆發(fā)病的研究發(fā)現(xiàn)，無論是使種子表面帶菌的浸種接種還是直接接種的方法，病菌Xanthomonas campestris pv．vignicola都能夠從種子向植株傳播，引發(fā)種子萌發(fā)力降低，部分萌發(fā)幼苗死亡和成株發(fā)病。在田間，附著在種子表面的病菌會隨著雨水等浸入土壤，使土壤中攜帶該病菌，導(dǎo)致農(nóng)作物的產(chǎn)量降低，甚至影響次年播種的農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，防止致病菌在種子上的初染是目前亟待解決的問題。降低種子表面帶菌率可有效控制番茄產(chǎn)量的下降，從而減輕農(nóng)民經(jīng)濟(jì)上的損失。

目前，種傳病害的研究與防治已成為熱點(diǎn)。關(guān)于帶菌種子除害技術(shù)的研究很多，研究者們利用酸、堿以及抗生素對帶菌種子進(jìn)行浸泡處理；或者干燥處理帶菌種子，以期去除種子表面的有害微生物。宋順華等［8］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鹽酸浸泡過的種子，其種子表面的病原細(xì)菌的繁殖速度下降，病原細(xì)菌量明顯減少；翁曉梅等［9］比較了鹽酸、硫酸、甲醛（100倍）以及次氯酸鈣4種藥劑對甜瓜種子的除害效果，結(jié)果表明，4種藥劑對甜瓜種子表面細(xì)菌的抑制效果較鏈霉素、氯霉素的好，其中，鹽酸的除害效果最穩(wěn)定；吳國平等［10］發(fā)現(xiàn)，福爾馬林（300倍液）不但可有效降低葫蘆的種傳病害，而且不影響種子活力；張成虎等［11］研究結(jié)果表明，5%的磷酸三鈉可控制甘藍(lán)種子種傳黑斑病菌。此外，在西瓜［12－14］、哈密瓜［15］、紅花［16］、甘草［17］等種子除害研究中也得到相似的結(jié)果。

本研究選擇磷酸三鈉、次氯酸鈣、蘇納米、甲醛、鹽酸、高錳酸鉀與二氯異氰尿酸鈉作為除害處理藥劑，比較這7種藥劑對PST的除害效果。同時，種子的發(fā)芽率也是影響產(chǎn)量的重要因素，在種子除害的同時要考慮除害藥劑對種子的發(fā)芽率是否有影響。要選擇除害效果優(yōu)良，同時還不影響種子發(fā)芽率的藥劑作為最終應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中的最優(yōu)藥劑。

近年來，番茄細(xì)菌性葉斑病菌在甘肅省的番茄發(fā)病率有所上升，降低番茄種子的帶菌率成為急需解決的問題。目前基層針對番茄種子的除害處理方法混雜多樣，還沒有一種統(tǒng)一高效的處理方法。前人對種子除害處理的相關(guān)研究所選擇的藥劑比較單一。本研究選擇了7種藥劑，系統(tǒng)地比較了這些藥劑的除害效果，意在篩選出一種實(shí)用高效的種子處理藥劑。為制定控制番茄細(xì)菌性葉斑病菌種傳病害的最佳實(shí)驗(yàn)方法提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并且為其他種傳病害的除害處理提供借鑒。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1．1．1 材料與試劑

番茄種子由東方種業(yè)公司贈予。該種子經(jīng)過檢測為無菌種子，可以進(jìn)行除害處理模擬實(shí)驗(yàn)。

PCR 試 劑，如 Loading buffer、d NTP、r Taq、RNase free dd H2O均購自大連寶生物工程有限公司，引物mm 5 f和mm 5 r由大連寶生物工程有限公司合成。新型植物基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，營養(yǎng)瓊脂（NA）購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1．1．2 儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀購自ABI公司，型號為VERITI；電泳儀購自北京六一儀器廠，型號為DYY－12 C；凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國UVP公司，型號為GeIDoc－It 310；人工氣候箱型號為A 1000。

1．1．3 處理液的配制

7種藥劑處理液現(xiàn)用現(xiàn)配，配制方法如下：

Na3PO4：40 m L的dd H2O 中加入3．2，4．0，4．8 g的磷酸三鈉固體粉末，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，分別制得8%、10%、12%的Na3PO4處理液。

Ca（Cl O）2：40 m L的dd H2O 中加入0．4，0．6，0．8 g的次氯酸鈣固體粉末，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓謩e制得1%、1．5%、2%的Ca（ClO）2處理液。

HCl：向40 m L的dd H2O滴加濃鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)p H 至1．5、2．0和2．5，配制處理液。

K2Mn O4：40 m L的dd H2O 中加入0．4，0．6，0．8 g的高錳酸鉀固體粉末，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓謩e制得1%、1．5%、2%的 K2Mn O4處理液。

甲醛：40 m L的dd H2O 中加入400，267，200μL的甲醛，充分混勻，分別制得甲醛100倍液、150倍液和200倍液。

蘇納米：40 m L的dd H2O中加入240，320，480，600μL的蘇納米溶液，充分混勻，分別制得0．6%、0．8%、1．2%和1．5%的蘇納米處理液。

二氯異氰尿酸鈉：40 m L的dd H2O中加入0．1，0．08，0．067，0．057 g的二氯異氰尿酸鈉固體粉末，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，分別制得二氯異氰尿酸鈉400倍液、500倍液、600倍液和700倍液。

1．1．4 種子處理時間

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 模擬種子帶菌

1）菌液的制備：挑取活化的PST標(biāo)準(zhǔn)菌株在NA培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。挑取培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將菌落從NA培養(yǎng)基上沖下配制菌懸液（28℃，180 r／min，過夜），測定600 nm下的吸光值。然后進(jìn)行菌落計數(shù)，計算原菌液濃度。

2）浸種：選取10 000粒番茄種子，用次氯酸鈉表面消毒1 min，無菌水清洗3次，陰干后浸泡于濃度為1×108cfu／m L的菌懸液中過夜，使細(xì)菌附著于番茄種子表面［18］。待種子陰干后進(jìn)行PCR檢測和平板檢驗(yàn)。

表1 除害處理藥劑的處理時間

3）檢測：挑選300粒番茄種子，平均分成3份，作為陽性對照的3個重復(fù)；另外，挑取無菌種子100粒，作為空白對照。將種子分別浸泡于40 m L的生理鹽水中，并加入40μL終濃度為100 mg／L的吐溫－20，4℃浸泡過夜；次日，180 r／min搖床上處理30 min后將浸出液濾出于一個新的50 m L離心管中，10 000／min離心30 min收集沉渣；用300μL的生理鹽水溶解沉渣，1 000 r／min離心3 min，收集上清；12 000 r／min離心5 min，去上清后用400μL生理鹽水溶解沉淀，即為供試菌液。提取供試菌液的基因組DNA；同時，將供試菌液稀釋為10－3、10－4和10－5后均勻涂布于NA平板上培養(yǎng)。

1．2．2 帶菌種子處理

帶菌種子制備完成后，用1．1．3所示的7種藥劑對番茄種子進(jìn)行振蕩浸泡處理。處理時間如表1所示。處理結(jié)束后，用滅菌紗布過濾掉浸泡種子的處理液，無菌水沖洗，將清洗過的種子陰干以備對除害處理效果的檢驗(yàn)。檢驗(yàn)方法同3）。

1．2．3 菌液PCR檢測

(6)在數(shù)組W=[we,r]w×r中，改變調(diào)度過程中工序在機(jī)床上的加工順序，以生成工序在機(jī)床上的加工順序相鄰解。

應(yīng)用新型植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行菌液基因組DNA的提取。利用特異性引物 mm 5 f：GAACGAGCTGAAGGAAGACA和 mm 5 r：CAGCCTGGTTAGTCTGGTTA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增體系25μL，其中10×PCR buffer 2．5μL，d NTP（10 mmol／L）1μL，DNA模板3μL，上下游引物（10 mmol／L）各1μL，r Taq酶（5 U／μL）0．5μL，dd H2O 16μL。PCR擴(kuò)增條件為：第一階段，95℃預(yù)變性5 min；第二階段，95℃變性30 s，57℃復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)；第三階段，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，并利用凝膠自動成像儀檢測拍照。

1．2．4 平板活菌檢測

將供試菌液梯度稀釋為10－1、10－2和10－3，均勻涂布于NA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，沖洗平板，稀釋菌液后，進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系和條件同1．2．3。

1．2．5 藥劑除害處理對番茄種子發(fā)芽率的影響

采用紙床法進(jìn)行發(fā)芽率實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計各藥劑（時間和濃度梯度組合）對種子發(fā)芽率的影響。首先，在洗凈滅菌的培養(yǎng)皿里放入2層滅菌的濾紙，充分吸濕，瀝去多余水分；將100粒番茄種子直接擺放于濾紙上，置于25℃、濕度80%的人工氣候箱中進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。分別在第5天和第14天進(jìn)行發(fā)芽率統(tǒng)計，觀察各藥劑對種子發(fā)芽率的影響。

2 結(jié) 果

2．1 模擬種子帶菌結(jié)果

將番茄種子浸泡于 OD600＝1．028，濃度為1×108cfu／m L的菌懸液中過夜，待種子陰干后進(jìn)行菌液DNA的PCR檢測以及目標(biāo)菌的分離與檢測，檢測結(jié)果如圖1和圖2所示。在基因組DNA PCR結(jié)果圖和菌液PCR結(jié)果圖中，陽性對照在532 bp處均有條帶，空白對照均無條帶出現(xiàn)，而3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)與陽性對照相同大小的條帶。證明該實(shí)驗(yàn)具有重復(fù)性，結(jié)果可靠，說明番茄種子已完成模擬帶菌，可進(jìn)行后續(xù)除害處理效果檢測的實(shí)驗(yàn)。

圖1 基因組DNA PCR檢測結(jié)果

圖2 菌液PCR檢測結(jié)果

2．2 種子除害處理結(jié)果

本研究選擇磷酸三鈉、次氯酸鈣、蘇納米、甲醛、鹽酸、高錳酸鉀和二氯異氰尿酸鈉作為除害處理的藥劑。根據(jù)這些藥劑對種子的浸滲能力以及除害效果，分別設(shè)計了從10 min到60 min等不同的處理時間。

用這7種藥劑處理帶菌的番茄種子，希望篩選出最佳的處理時間和處理濃度的組合。通過PCR技術(shù)和活菌分離技術(shù)檢測藥劑的除害效果，并將這7種藥劑除害效果總結(jié)于表2。從表2可以看出，這7種藥劑的最佳除害效果的濃度和時間的組合。3次重復(fù)結(jié)果一致具有較好的重復(fù)性。

表2 攜帶番茄細(xì)菌性葉斑病菌的番茄種子的除害結(jié)果

從表2可以看出，磷酸三鈉（8%、10%、12%）處理過的帶菌種子的帶菌率隨著藥劑濃度的升高和處理時間的延長表現(xiàn)為下降趨勢。8%的磷酸三鈉處理30 min即可達(dá)到除害的效果，10%和12%的各個處理時間也得到同樣的結(jié)論。

次氯酸鈣（1%、1．5%、2%）處理過的帶菌種子的帶菌率隨著藥劑濃度的升高和處理時間的延長表現(xiàn)為下降趨勢。1%的次氯酸鈣處理20 min即可得到同8%磷酸三鈉處理30 min時相同的效果，這與翁曉梅等［11］的研究結(jié)果一致。

鹽酸的除害結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其可以抑制菌類生長或消除番茄細(xì)菌性葉斑病菌，同樣，翁曉梅等也證實(shí)了這一點(diǎn)。但本實(shí)驗(yàn)的鹽酸是以p H值的高低為分類標(biāo)準(zhǔn)，與翁曉梅等以濃度高低（1%、5%）為分類標(biāo)準(zhǔn)不同。帶菌量隨著酸度的增強(qiáng)而減少，但當(dāng)p H＝1．5時，處理30 min后，所提取的菌液DNA的PCR結(jié)果與菌落PCR結(jié)果均為陽性，而處理10 min和20 min時則是陰性。

甲醛（100倍液、150倍液、200倍液）的處理與前人的研究結(jié)果有差異。本研究發(fā)現(xiàn)，甲醛200倍液處理30 min即可達(dá)到除害的效果；而翁曉梅等研究結(jié)果是，當(dāng)甲醛稀釋100倍的時候?qū)μ鸸先~斑病菌才具有良好的除害效果，這是因?yàn)榉N子種類以及染菌量存在差異。

蘇納米（0．6%、0．8%、1．2%、1．5%）處理過的帶菌種子的帶菌率隨著藥劑濃度的升高和處理時間的延長表現(xiàn)為下降趨勢，1．5%的蘇納米處理種子20 min即可達(dá)到除害的效果。

高錳酸鉀的除害效果表明，高錳酸鉀（1%、1．5%、2%）處理過的帶菌種子的帶菌率隨著藥劑濃度的升高和處理時間的延長呈下降趨勢。從表2中菌液DNA的PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1．0%的高猛酸鉀處理種子30 min時為陽性，而菌落PCR結(jié)果卻為陰性。說明高錳酸鉀的最佳除害濃度為1．0%，時間為20 min。

二氯異氰脲酸鈉的400、500倍液及600倍液處理帶菌番茄種子30，40，50 min時，菌液DNA的PCR結(jié)果和菌落PCR結(jié)果均為陰性，說明二氯異氰脲酸鈉具有很好的除害效果。為了找到最優(yōu)的處理濃度和時間的組合，本研究又將二氯異氰脲酸鈉稀釋至700倍，并且降低600倍液的處理時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稀釋至700倍的二氯異氰脲酸鈉處理帶菌番茄種子40 min時，2種檢測結(jié)果均為陰性，即除害效果最佳，因此稀釋至700倍處理種子40 min的組合為最佳處理濃度和時間。

2．3 除害處理后番茄種子的發(fā)芽率統(tǒng)計結(jié)果

應(yīng)用紙床法對不同濃度的7種藥劑處理過的番茄種子進(jìn)行發(fā)芽率的統(tǒng)計，100粒／皿，每個處理重復(fù)3次。分別在第5天和第14天進(jìn)行發(fā)芽率統(tǒng)計，表3中統(tǒng)計的發(fā)芽率均為3次重復(fù)的平均數(shù)。這63個處理的平均發(fā)芽率均在87%～99%之間，結(jié)果如表3所示。最低的是8%的磷酸三鈉處理30 min時的發(fā)芽率，最高的是600倍的二氯異氰尿酸鈉處理10 min、700倍的二氯異氰尿酸鈉處理30，40 min時的發(fā)芽率。這63個處理的平均發(fā)芽率都高于帶菌種子的平均發(fā)芽率（84%），說明這7種藥劑的處理對種子的發(fā)芽率影響不大。

表3 不同藥劑處理下番茄種子的發(fā)芽率統(tǒng)計（%）

如表3所示，磷酸三鈉、次氯酸鈣、蘇納米、甲醛、鹽酸、高錳酸鉀和二氯異氰尿酸鈉處理過的帶菌種子發(fā)芽率分別為87%～96%、88%～96%、89%～98%、90%～98%、88%～96%、88%～97%和94%～99%，每種藥劑處理的平均發(fā)芽率分別是92．22%、92．44%、92．5%、94．33%、91．55%、93．55%和96．85%。其中，二氯異氰脲酸鈉的發(fā)芽率最高（96．85%），而鹽酸的最低（91．55%），且均在健康種子（97%）和帶菌種子（84%）的發(fā)芽率之間，說明藥劑處理對種子的發(fā)芽率影響屬正常范圍。表明這7種藥劑可以應(yīng)用于除害處理。

3 討 論

與前人研究相比，本研究選擇除害試劑較多，所選的7種藥劑均容易獲得且價格低廉；處理液的配制既方便快捷，又不會產(chǎn)生有害物質(zhì)；而且實(shí)驗(yàn)過程簡單易行；從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，本實(shí)驗(yàn)所摸索出的除害技術(shù)是合理的，結(jié)果可靠且具有可重復(fù)性。綜上，本實(shí)驗(yàn)對番茄種子除害技術(shù)的研究為以后的相關(guān)研究奠定了一定的基礎(chǔ)，可作為參考應(yīng)用于實(shí)踐。

這7種藥劑應(yīng)用于除害技術(shù)的研究中，基本上符合濃度越高、處理時間越長，其除害的效果越好的規(guī)律，即種子的帶菌率隨著濃度的增高、時間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢。但是也有例外，如鹽酸處理的帶菌種子，在p H＝1．5的處理條件下，種子的帶菌率并未呈現(xiàn)如上規(guī)律，而是隨時間的延長呈現(xiàn)上升的趨勢。本實(shí)驗(yàn)對蘇納米的除害研究結(jié)果與前人不同，前人一般用0．6%的蘇納米即可達(dá)到除害的效果，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘇納米的濃度達(dá)到1．5%時才可以有效的除害。出現(xiàn)這些結(jié)果的原因還需要更深層次的探討與研究，希望本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論能為今后深入的研究提供依據(jù)。

從生產(chǎn)實(shí)踐的角度看，選擇除害藥劑時，藥劑的效果固然重要，但其對種子發(fā)芽率的影響也是研究者應(yīng)該關(guān)注的重點(diǎn)。要選擇既具有良好的除害效果，又對種子發(fā)芽率影響小的藥劑。通過發(fā)芽率統(tǒng)計實(shí)驗(yàn)，證明本研究中所選擇的7種藥劑對種子發(fā)芽率的影響均較小，均可作為除害的藥劑應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。

［1］趙廷昌，于莉，孫福在，等．番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病及其防治［J］．植物保護(hù)，1999，25（4）：56．

［2］Yunis H，Bashna Y，Okon Y，et al．Chemical control of bacterial speck of tomato and its effect On tomato yield［J］．Hassadeh，1980，60（5）：1 004－1 007．

［3］陳鶴生．種子病害簡明教程［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1983：56．

［4］Garwal，V．K．a(chǎn)nd Sinclair，．J．B．Principles of seed pathology［J］．Boca Raton，F(xiàn)lorida，CRC Press．1987，64（3）：1 002．

［5］MeGee，D．C．World phytosanitary system：problems and solutions in D．C．McGee（Ed．）Plant pathogens and the worldwide movement of seeds［J］．St Paul，Minnesota，APS Press．1997，42（6）：987－992．

［6］Seattler，A．W．The need for detection assay．in A．W．Saettler，N．W．Shcaad and D．A．Roth（Eds）Detection of bacteria in seed and other planting material［J］．St Pual，Minnesota，APS Press，1989，54（3）：1－2．

［7］Okechukwu R U，Okechukwu O C．Seed to plant transmission of Xanthomonas campestris pv．vignicloa isolates in cowpea［J］．African Journal of Agricultural Research，2010，5（6）：431－435．

［8］宋順華，吳萍，孟淑春，等．種子處理對西瓜細(xì)菌性果斑病的防治效果［J］．中國瓜菜，2013，26（3）：5－9．

［9］翁曉梅，張昕，李國英，等．甜瓜細(xì)菌性斑點(diǎn)病種子帶菌及種子處理試驗(yàn)研究［J］．石河子大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，22（5）：95－97．

［10］吳國平，毛忠良，姚悅梅，等．福爾馬林浸種對葫蘆種傳病害和種子活力的影響［J］．江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（8）：101－102．

［11］孫成虎，尚慶茂，李平蘭，等．甘藍(lán)種帶真菌檢測及浸種處理效果研究［J］．長江蔬菜，2006，8（2）：53－54．

［12］宋順華，吳萍，孟淑春，等．種子處理對西瓜細(xì)菌性果斑病的防治效果［J］．中國瓜菜，2013，26（3）：5－9．

［13］趙秋菊，寇明明，羅付青，等．種子處理對西瓜細(xì)菌性果腐病種子帶菌的影響［J］．中國種業(yè)，2008，12（5）：56－57．

［14］吳學(xué)宏，劉西莉，劉鵬飛，等．西瓜種子帶菌檢測及殺菌劑消毒處理效果［J］．農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2003，5（3）：39－44．

［15］任毓忠，李暉，李國英，等．哈密瓜細(xì)菌性果斑病種子帶菌的PCR檢測［J］．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，41（5）：329－332．

［16］劉西莉，牧麗丹，王紅梅，等．紅花種子帶菌檢測及藥劑消毒處理［J］．植物保護(hù)，2003，29（6）：49－51．

［17］楊力鋼，黃中喬，劉鵬飛，等．甘草種子帶菌檢測及藥劑消毒處理效果［J］．植物保護(hù)，2006，32（5）：84－87．

［18］Hebbar K P，Davey A G，Merrin J，et al．Pseudomonas cepacia，a potential suppressor of maize soil－borne diseasesseed inoculation and maize root colonization［J］．Soil Biology and Biochemistry，1992，24（10）：999－1 007．