超順磁性氧化鐵納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞的研究進(jìn)展

張昕桐 綜述 熊 猛 審校

超順磁性氧化鐵納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞的研究進(jìn)展

張昕桐 綜述 熊 猛 審校

超順磁性氧化鐵納米顆粒（SPIONs）是一種在細(xì)胞標(biāo)記、藥物靶向投遞、腫瘤熱治療等領(lǐng)域，都有著廣泛應(yīng)用前景的納米材料。再生醫(yī)學(xué)研究中，干細(xì)胞的研究和應(yīng)用廣受關(guān)注，SPIONs的出現(xiàn)為干細(xì)胞的標(biāo)記和示蹤提供了新的途徑。SPIONs具有超順磁性、低毒性、良好生物相容性，以及在外加磁場(chǎng)下定向移動(dòng)等特點(diǎn)。SPIONs在MRI成像上表現(xiàn)為信號(hào)減弱區(qū)域，經(jīng)過(guò)表面修飾后可有效、安全地標(biāo)記干細(xì)胞，但同時(shí)也存在細(xì)胞毒性不明確和MRI成像限制性等問(wèn)題。本文就超順磁性氧化鐵納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

超順磁性氧化鐵干細(xì)胞標(biāo)記

隨著再生醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，干細(xì)胞的研究和應(yīng)用廣受關(guān)注。干細(xì)胞是一類具有良好增殖能力和多向分化潛能的細(xì)胞，這種特性使干細(xì)胞能夠在受損的器官、組織發(fā)揮其修復(fù)作用。為了更好地研究干細(xì)胞的治療機(jī)制及評(píng)估干細(xì)胞的修復(fù)作用，需要一種安全有效的細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)。目前，通過(guò)磁對(duì)比劑標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行MRI成像，已成為一種細(xì)胞定位的重要檢測(cè)手段。MRI成像具有非侵害性、高精確性等特點(diǎn)，在使用磁對(duì)比劑時(shí)能提供精確的圖像分析。在磁對(duì)比劑的選擇上，超順磁性氧化鐵納米顆粒（Superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs）成為較為矚目的選擇，其在MRI成像中的作用已經(jīng)在大量研究中得到證實(shí)。本文就SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 SPIONs

SPIONs是一種具有超順磁性的氧化鐵納米顆粒，這類材料只在外部磁場(chǎng)的作用下才表現(xiàn)出磁性[1]。在MRI成像時(shí)，SPIONs在相應(yīng)區(qū)域展現(xiàn)出磁性，當(dāng)去掉外部磁場(chǎng)時(shí)，SPIONs的磁性也會(huì)消失。SPIONs的這種受外部磁場(chǎng)影響的磁性特點(diǎn)，在細(xì)胞標(biāo)記方面有著良好的應(yīng)用。其中，磁性Fe3O4最具有應(yīng)用前景。SPIONs具有超順磁性、低毒性、良好生物相容性，以及在外加磁場(chǎng)下定向移動(dòng)等特點(diǎn)[2]。這些納米顆粒在細(xì)胞標(biāo)記、藥物靶向投遞、腫瘤熱治療等方面，都具備廣泛的應(yīng)用前景[3]。利用SPIONs的磁性特點(diǎn)，與MRI成像相結(jié)合，以標(biāo)記和示蹤細(xì)胞，已成為一種有效的細(xì)胞定位方法。

2 SPIONs的MRI成像

SPIONs超順磁性的特點(diǎn)使其成為一種MRI成像高度敏感的對(duì)比劑，且較少產(chǎn)生副作用。當(dāng)有SPIONs存在時(shí)會(huì)干擾固有的磁場(chǎng)均勻性，使得鐵顆粒所在部位與周圍組織產(chǎn)生不同的磁場(chǎng)敏感性，造成周圍質(zhì)子的快速移相，導(dǎo)致在T2和T1成像的弛豫時(shí)間減低。SPIONs作為T2磁對(duì)比劑主要作用是改變MRI的R2馳豫，縮短T2時(shí)間，減弱T2加權(quán)信號(hào)。其特點(diǎn)是粒徑在納米范圍內(nèi)，穿透力強(qiáng)，弛豫率為等濃度Gd3+的7～10倍，能在很低濃度下引起MRI成像，表現(xiàn)為信號(hào)減低區(qū)域，能與周圍組織形成對(duì)比[4]。SPIONs和其他磁對(duì)比劑相比，有可降解性、體內(nèi)留存時(shí)間長(zhǎng)及低毒性的特點(diǎn)。磁性納米粒子由氧化鐵顆粒、生物相容性外衣、間隔臂及活性分子構(gòu)成。核心顆粒大小及表面修飾均會(huì)影響SPIONs的磁性特點(diǎn)[5]。

3 SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞

SPIONs具有低毒性、可降解性、可監(jiān)測(cè)性、有一定的維持時(shí)間和排出途徑的特點(diǎn)。SPIONs粒徑1～100 nm[6]，不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)非特異性吞噬。SPIONs表面帶有正電荷，常需表面修飾，未經(jīng)表面修飾的SPIONs不穩(wěn)定，易在液態(tài)環(huán)境中聚合。

SPIONs標(biāo)記干細(xì)胞的機(jī)制主要有兩種方式，一種是將納米顆粒依附于細(xì)胞表面；另一種是細(xì)胞將納米顆粒內(nèi)在化，主要包括直接胞吞作用、受體介導(dǎo)的胞吞作用及轉(zhuǎn)染劑介導(dǎo)的胞吞作用[7]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，第一種方式有著明顯的限制性，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)會(huì)識(shí)別并清除這些SPIONs標(biāo)記的細(xì)胞。而通過(guò)內(nèi)在化途徑，SPIONs能存留在干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并具有良好的生物相容性。目前，增強(qiáng)SPIONs跨膜的方法有外加電磁場(chǎng)使SPIONs向照射部位靶向聚集；在SPIONs表面修飾能與靶細(xì)胞膜上受體結(jié)合的配體，使得SPIONs與靶細(xì)胞特異性結(jié)合；促進(jìn)單核-吞噬細(xì)胞吞噬SPIONs，促進(jìn)被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞的標(biāo)記率與SPIONs濃度呈正相關(guān)，SPIONs濃度越高，細(xì)胞標(biāo)記率越高，但過(guò)高的SPIONs濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵含量過(guò)多，影響細(xì)胞生物學(xué)活性及增殖能力。SPIONs標(biāo)記細(xì)胞的有效安全濃度為20～50 mg/L[8]，以適當(dāng)濃度標(biāo)記干細(xì)胞，不會(huì)對(duì)其生物學(xué)活性、增殖能力及多向分化能力產(chǎn)生明顯影響。

4 SPIONs的表面修飾

由于未經(jīng)表面修飾的SPIONs不穩(wěn)定，同時(shí)為了提高其細(xì)胞標(biāo)記率，需要對(duì)SPIONs進(jìn)行表面修飾[9]。正確的表面修飾可以提高SPIONs的穩(wěn)定性、水溶性和生物相容性，防止其聚合，還能加強(qiáng)SPIONs與藥物、抗體等物質(zhì)的結(jié)合。標(biāo)記細(xì)胞時(shí)常會(huì)用到轉(zhuǎn)染劑，如多聚賴氨酸、硫酸鹽和魚精蛋白等。通過(guò)轉(zhuǎn)染劑，SPIONs能更快、更準(zhǔn)確地標(biāo)記細(xì)胞。在選擇正確的表面修飾的同時(shí)，需注意選擇合適的轉(zhuǎn)染劑。有研究嘗試在SPIONs表面包被不同的物質(zhì)，如檸檬酸、葡聚糖、甘露糖、聚乳酸、聚乙烯亞胺等。不同的表面修飾會(huì)對(duì)SPIONs的理化性質(zhì)產(chǎn)生不同的影響[10]。需要根據(jù)SPIONs的具體用途和研究目的選擇正確的表面修飾。

5 SPIONs的實(shí)驗(yàn)研究

目前，有大量實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)SPIONs標(biāo)記各種干細(xì)胞對(duì)不同的動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

Scharf等[11]將SPIONs和熒光蛋白雙重標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并移植入肌腱損傷的大型動(dòng)物模型體內(nèi)，證明SPIONs標(biāo)記細(xì)胞是在大型動(dòng)物體內(nèi)示蹤細(xì)胞的有效途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以濃度為25 μg/mL或50 μg/mL的SPIONs標(biāo)記細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞活性不受明顯影響，而以濃度為100 μg/mL的SPIONs標(biāo)記時(shí)，細(xì)胞活性略有降低。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記率在以25 μg/mL和50 μg/mL濃度的SPIONs處理時(shí)是95%和94%。SPIONs的代謝活動(dòng)和增殖能力與未標(biāo)記的細(xì)胞無(wú)明顯差異。干細(xì)胞分化能力方面，標(biāo)記的細(xì)胞和未處理的細(xì)胞的成骨和成脂分化能力無(wú)顯著差異，而成軟骨分化能力明顯降低。MRI成像方面，在深屈肌腱的背平面MRI圖像上，可見在注射部位的第7天和第14天出現(xiàn)球形信號(hào)缺失和集中區(qū)域信號(hào)缺失。

孟增東等[12]采用不同濃度SPIONs（12.5、25、50、100 mg/L）聯(lián)合多聚賴氨酸（0.75 mg/L），標(biāo)記兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，25 mg/L的SPIONs聯(lián)合0.75 mg/L的多聚賴氨酸標(biāo)記兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有較高的安全性和有效性，對(duì)細(xì)胞活性沒有影響，且不影響干細(xì)胞的成骨、成脂分化能力。MRI掃描能明顯有效地顯像SPIONs標(biāo)記細(xì)胞。

Parsa等[13]以SPIONs標(biāo)記大鼠胚胎干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，SPIONs對(duì)胚胎干細(xì)胞的自我復(fù)制能力沒有影響，倒置顯微鏡觀察和普魯士染色顯示細(xì)胞標(biāo)記率為100%，SPIONs標(biāo)記的胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞活性和分化能力沒有變化，同時(shí)通過(guò)表型分析發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞的SSEA1和CD117沒有改變。

麥筱莉等[14]用多聚左旋賴氨酸和SPIONs的復(fù)合物體外標(biāo)記骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞，并觀察標(biāo)記細(xì)胞移植至小鼠缺血性腦梗死模型后的遷移情況。MRI觀察標(biāo)記細(xì)胞的遷移情況，普魯士染色檢測(cè)EPC的分布情況。結(jié)果顯示，標(biāo)記細(xì)胞腦內(nèi)移植后1周，MRI顯示移植區(qū)低信號(hào)改變，并沿胼胝體向病灶側(cè)遷移，而普魯士染色顯示部分移植的標(biāo)記細(xì)胞沿胼胝體向損傷側(cè)遷移，證明多聚左旋賴氨酸和SPIONs復(fù)合體能夠在體內(nèi)評(píng)價(jià)細(xì)胞移植后的腦內(nèi)遷移。

Kim等[15]用SPIONs標(biāo)記了間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞。將SPIONs標(biāo)記細(xì)胞注入乳鼠膠質(zhì)瘤模型當(dāng)中，在注射后第10天MRI觀察到向腫瘤組織遷移的干細(xì)胞，并通過(guò)組織學(xué)（普魯士染色等）確認(rèn)了腫瘤組織當(dāng)中的注射細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明SPIONs沒有細(xì)胞毒性，被標(biāo)記干細(xì)胞的細(xì)胞活性、增殖能力和分化能力未受影響。

6 SPIONs的局限性

SPIONs作為一種細(xì)胞標(biāo)記的新途徑存在其局限性。首先，SPIONs是否存在細(xì)胞毒性仍然存在爭(zhēng)議，也是限制其應(yīng)用的主要原因。盡管大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，SPIONs標(biāo)記細(xì)胞后不會(huì)對(duì)細(xì)胞活性、增殖能力及分化能力造成明顯影響。但有部分研究指出，由于SPIONs是由可降解鐵合成的，當(dāng)鐵被細(xì)胞吸收時(shí)會(huì)產(chǎn)生鐵催化活性氧[16]。Costa等[17]指出，部分SPIONs會(huì)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。也有研究指出，細(xì)胞毒性是由轉(zhuǎn)染劑造成，會(huì)對(duì)干細(xì)胞分化能力產(chǎn)生影響。因此，SPIONs的細(xì)胞毒性還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

其次，SPIONs的MRI成像也有其限制性。隨著細(xì)胞的有絲分裂，SPIONs的圖像會(huì)不斷減弱甚至消失。當(dāng)細(xì)胞在體內(nèi)遷移時(shí)，SPIONs的MRI成像敏感性也會(huì)降低[18]。當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)，SPIONs仍會(huì)存在于體內(nèi)并產(chǎn)生相應(yīng)的圖像，會(huì)對(duì)細(xì)胞示蹤產(chǎn)生錯(cuò)誤的引導(dǎo)。因此，SPIONs的MRI成像還有許多問(wèn)題亟待研究解決。

7 小結(jié)

SPIONs作為一種新的細(xì)胞標(biāo)記途徑，具有超順磁性、低毒性、良好生物相容性，以及在外加磁場(chǎng)下定向移動(dòng)等特點(diǎn)，是一種能與MRI成像相結(jié)合的標(biāo)記和示蹤細(xì)胞的有效方法。SPIONs在MRI成像上表現(xiàn)為信號(hào)減低區(qū)域，能與周圍組織形成對(duì)比。經(jīng)過(guò)表面修飾的SPIONs與干細(xì)胞能夠安全、有效地結(jié)合，能保持較高的細(xì)胞標(biāo)記率，不會(huì)對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)活性、增殖能力及多向分化能力產(chǎn)生明顯影響。但SPIONs存在其應(yīng)用的局限性，多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究?jī)H處在體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物研究中，其細(xì)胞毒性的不確定性和MRI成像的限制性尚待解決。盡管如此，SPIONs作為一種新的細(xì)胞標(biāo)記途徑仍具有遠(yuǎn)大前景，需要大量的研究將其推向臨床實(shí)驗(yàn)階段。相信隨著干細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)和分子影像學(xué)的不斷發(fā)展，SPIONs能在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮不可估量的作用。

[1]LaConte L,Nitin N,Bao G,et al.Magnetic nanoparticle probes [J].Mater Today,2005,8(5):32-38.

[2]Bull E,Madani SY,Sheth R,et al.Stem cell tracking using iron oxide nanoparticles[J].Int J Nanomedicine,2014,9:1641-1653.

[3]宋新峰,孫漢文,吳靜,等.超順磁性納米粒子化學(xué)合成及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)展[J].應(yīng)用化工,2014,44(4):711-719.

[4]Urdzíková L,Jendelová P,Glogarová K,et al.Transplantation of bone marrow stem cells as well as mobilization by granulocytecolony stimulating factor promotes recovery after spinal cord injury in rats[J].J Neurotrauma,2006,23(9):1379-1391.

[5]Rogers WJ,Basu P.Factors regulating macrophage endocytosis of nanoparticles:implicationsfortargetedmagneticresonance plaque imaging[J].Atherosclerosis,2005,178(1):67-73.

[6]Alam S,Anand C,Ariga K,et al.Unusual magnetic properties of size-controlled iron oxide nanoparticles grown in a nanoporous matrix with tunable pores[J].Angew Chem Int Ed Engl,2009,48 (40):7358-7361.

[7]Nucci LP,Silva HR,Giampaoli V,et al.Stem cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles in a preclinical model of cerebral ischemia:a systematic review with meta-analysis[J]. Stem Cell Res Ther,2015,6:27.

[8]Ko IK,Song HT,Cho EJ,et al.In vivo MR imaging of tissueengineered human mesenchymal stem cells transplanted to mouse: a preliminary study[J].Ann Biomed Eng,2007,35(1):101-108.

[9]陳鵬,張杰,榮冬明,等.無(wú)葡聚糖包被超順磁性氧化鐵納米顆粒影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[J].中國(guó)組織工程研究,2014,18 (16):2526-2531.

[10]王瑞,龐希寧,施萍,等.聚乙烯亞胺包被的四氧化三鐵磁納米顆粒對(duì)hAMSCs生物特性的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2013,33 (11):1382-1386.

[11]Scharf A,Holmes S,Thoresen M,et al.Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a means to track mesenchymal stem cells in a large animal model of tendon injury[J].Contrast Media Mol Imaging,2015,10(5):388-397.

[12]孟增東,邱偉,胡彪,等.超順磁性氧化鐵納米顆粒體外標(biāo)記兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的安全性以及MRI成像特征[J].中國(guó)組織工程研究,2012,16(6):951-957.

[13]Parsa H,Shamsasenjan K,Movassaghpour A,et al.Effect of superparamagnetic iron oxide nanoparticles-labeling on mouse embryonic stem cells[J].Cell J,2015,17(2):221-230.

[14]麥筱莉,韓冰,范海健,等.體外標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞小鼠缺血性腦梗死模型局部移植后向病灶側(cè)遷移的MRI實(shí)驗(yàn)研究[J].醫(yī)學(xué)影像學(xué),2015,25(1):143-147.

[15]Kim SJ,Lewis B,Steiner MS,et al.Superparamagnetic iron oxide nanoparticles for direct labeling of stem cells and in vivo MRI tracking[J].Contrast Media Mol Imaging,2016,11(1):55-64.

[16]Hoepken HH,Korten T,Robinson SR,et al.Iron accumulation, iron-mediated toxicity and altered levels of ferritin and transferrin receptor in cultured astrocytes during incubation with ferric ammonium citrate[J].J Neurochem,2004,88(5):1194-1202.

[17]Costa C,Brand?o F,Bessa MJ,et al.In vitro cytotoxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles on neuronal and glial cells.Evaluation of nanoparticle interference with viability tests [J].J Appl Toxicol,2016,36(3):361-372.

[18]Guzman R,Uchida N,Bliss TM,et al.Long-term monitoring of transplanted human neural stem cells in developmental and pathological contexts with MRI[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2007,104(24):10211-10216.

Research Progress of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles on Labeling Stem Cells

ZHANG Xintong,XIONG Meng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Zhongda Hospital,Southeast University.Corresponding author:XIONG Meng(E-mail:bearbrave@sina.com).

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles;Stem cells;Labeling

Q813.1+1

B

1673－0364（2016）06－0378－03

2016年7月24日；

2016年10月9日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.014

210009江蘇省南京市東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院燒傷整形科。

熊猛（E-mail：bearbrave@sina.com）。

【Summary】Superparamagnetic iron oxide nanoparticles(SPIONs)are a kind of nano materials which have broad application prospects in the field of labeling cells,targeted drug delivery and heat treatment of tumor.Especially in regenerative medicine,more and more research and application of stem cells have been founded.SPIONs have provided a new method to label and track cells.The characteristics of SPIONs are superparamagnetic,low toxicity,good biocompatibility and directional movement in the magnetic field.SPIONs present low signal area in magnetic resonance imaging(MRI)and they can label cells safely and effectively with appropriate coatings.But the uncertainty of cytotoxicity and the limitation of MRI are still unsolved.In this paper,the research progress of SPIONs in labeling cells were reviewed.