急性冠脈綜合征患者外周血單核細(xì)胞miR—145與超敏C反應(yīng)蛋白的相關(guān)性研究

姜春玲

[摘要]目的探討急性冠脈綜合征（ACS）患者外周血單核細(xì)胞（PBMCs）miR-145與超敏C反應(yīng)蛋白的相關(guān)性。方法選取急性冠脈綜合征患者90例，其中不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）30例（A組），ST段抬高型心肌梗死（STEMl）30例（B組）和非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMl）30例（C組）。另外30例以心前區(qū)不適住院，既往無高血壓、糖尿病和冠心病史，經(jīng)心電圖、心肌酶學(xué)和冠狀動(dòng)脈造影排除冠心病者作為對(duì)照組（D組）。采用Rcal-time PCR法檢測(cè)PBMCs中miR-145表達(dá)水平，使用U6作為內(nèi)參對(duì)照。采用ELISA法檢測(cè)超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）水平。結(jié)果A組、B組、C組分別與D組比較，ACS患者外周血單核細(xì)胞miR-145表達(dá)水平明顯降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；A組、B組、C組分別與D組比較，PBMCs培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子hs-CRP水平明顯升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；Pcarson相關(guān)分析結(jié)果顯示，ACS患者外周血單核細(xì)胞miR-145表達(dá)與hs-CRP水平呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.84，P<0.05）。結(jié)論ACS患者外周血單核細(xì)胞miR-145與超敏C反應(yīng)蛋白之間呈負(fù)相關(guān)性，可能成為ACS新型標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞]急性冠脈綜合征；外周血單核細(xì)胞miR-145；超敏C反應(yīng)蛋白

中圖分類號(hào)：l541.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-816X（2015）05-0359-03

急性冠脈綜合征（Axute coronary svndrom，ACS）作為常見的心臟急癥，是心血管疾病中致死致殘的主要原因，包括不穩(wěn)定心絞痛（Unstable Angina Pectoris，UAP）和急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI），而AMI包括非ST段抬高型心肌梗死（Non-ST-Elevation MvocaHlial Infarction，NSTEMI）、ST段抬高型心肌梗死（ST-Elevation Myocardial Infarction，SIEMI）。文獻(xiàn)報(bào)道，m1R-145在正常動(dòng)脈血管和已分化的血管平滑?。╒SMCs）中表達(dá)最豐富，但在球囊損傷血管、ACS及去分化的VSMCs中表達(dá)很低。miR-145是VSMCs的表型調(diào)節(jié)器，通過對(duì)VSMCs的調(diào)節(jié)而成為ACS的保護(hù)因子，但在ACS中的表達(dá)情況目前尚不明確。本文對(duì)ACS患者血漿miR-145變化及其與hs-CRP的相關(guān)性進(jìn)行探討。

1.資料與方法

1.1.臨床資料：選取2011年3月至2014年3月本院住院確診為ACS患者90例，UAP、AMI診斷均按美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)（2009年）標(biāo)準(zhǔn)，且均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)。其中30例UAP（A組），60例AMI分為30例SIEMI（B組）和30例NSTEMI（C組）。另外30例以心前區(qū)不適住院，既往無高血壓、糖尿病和冠心病史，經(jīng)心電圖、心肌酶學(xué)和冠狀動(dòng)脈造影排除冠心病者作為對(duì)照組（D組）。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均自愿加入并簽署知情同意書。

1.2.方法：患者均在發(fā)病6h內(nèi)從靜脈采取空腹血3ml，肝素鈉抗凝。PBMCs采用人外周血淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)行分離：①置于EDTA—N0抗凝管，將新鮮血液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，加入無菌的5mlPBS等倍稀釋血液，上下顛倒混勾。②避光吸取5ml淋巴細(xì)胞分離液置于另一l5ml離心管，用吸管吸取稀釋的血液，沿管壁小心緩慢加于淋巴細(xì)胞分離液上方，形成清晰界面。放入平衡離心機(jī)，室溫下，2000轉(zhuǎn)/min，離心30min。③離心后可以觀察到管內(nèi)液體分為三層，上層為淡黃色的血漿和PBS，下層主要是紅細(xì)胞層，層為分離液層，上中層界面一層白色絮狀物質(zhì)即為單個(gè)核細(xì)胞層或白膜層。④用吸管小心吸取白膜層，置于另一l5ml離心管中，加入2～3倍體積的無菌PBS，上下顛倒混勻，2000轉(zhuǎn)/min，離心10min。⑤倒掉上清，同法沉淀洗滌兩次。⑥將⑤所得單個(gè)核細(xì)胞用900μL Trizol重懸，吸取置于無酶無菌1.5ml EP管中，暫時(shí)凍存于-80℃冰箱中以備提取RNA。

采用Real—time PCR法（ABI9700型PCR擴(kuò)增儀由美國(guó)ABI公司：熒光定量PCR儀由德國(guó)Eppendorf公司：hsa-miR-145 real—time及RT—PCR引物由廣州銳博生物科技有限公司：U6 real—time及RT—PCR引物由廣州銳博生物科技有限公司提供）檢測(cè)PBMCs中miR-145表達(dá)水平，使用U6作為內(nèi)參對(duì)照。分離的PBMCs用含10%小牛血清的RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度2×10⁶/ml，加入植物血凝素（PHA）5ng/ml濃度，置于37℃，5%C0₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集上清液儲(chǔ)存于-20℃用于hs-CRP檢測(cè)。采用ELISA法（美國(guó)Beckman公司的IM-MAG全自動(dòng)特種蛋白分析系統(tǒng)）檢測(cè)hs-CRP水平，試劑盒由Beckman公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒的說明操作。

2.結(jié)果

2.1.一般臨床資料比較：A組、B組、C組分別與D組比較，在年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、舒張壓（SBP）、收縮壓（DBP）、空腹血糖（FPG）等構(gòu)成上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；A組、B組、C組分別與D組比較，ACS患者總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）明顯升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）明顯降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2.四組m1R-145相對(duì)表達(dá)水平：A組、B組、C組分別與D組比較，ACS患者外周血單核細(xì)胞miR-145相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且A組、B組、C組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。采用ELISA法檢測(cè)hs-CRP水平，PBMCs培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明，A組、B組、C組分別與D組比較，PBMCs培喬基上清中細(xì)胞因子hs-CRP水平明顯升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且A組、B組、C組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見表1。

2.3.ACS患者外周血單核細(xì)胞miR-145與hs-CRP的相關(guān)性：Pearsom相關(guān)分析結(jié)果顯示，ACS患者外周血單核細(xì)胞miR-145相對(duì)表達(dá)水平與hs-CRP水平呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.84，P<0.05）。

3.討論

ACS在我國(guó)發(fā)病率日益上升，是臨床上常見的急危重癥。ACS發(fā)生早期患者主要表現(xiàn)為胸痛癥狀，如果能在心肌尚未壞死的可逆階段及時(shí)診斷并采取相應(yīng)的治療措施，可以大大降低死亡率和致殘率。目前，肌鈣蛋白（cTnT或cTnl）和肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）是診斷ACS特異性和敏感性較高的標(biāo)志物，但在癥狀出現(xiàn)6h內(nèi)靈敏度不高，而且難以檢測(cè)微小型AMI，早期診斷能力受到限制，篩選新的心肌損傷標(biāo)志物用于ACS診斷具有重要臨床意義。

miRNA是一種單鏈非編碼RNA，包含19-25個(gè)核苷酸，通過與靶基因mRNA的3，非編碼區(qū)特異性結(jié)合，促進(jìn)靶基因降解或抑制轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)，在機(jī)體細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等生理病理過程發(fā)揮重要作用。miRNA廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，在人類血液、唾液、尿液等體液中均有分布，目前主要作為惡性腫瘤、肌肉損傷、炎癥反應(yīng)等情況的生物標(biāo)志物。miR-145由23個(gè)核苷酸組成，定位于人類染色體Sq32上，在VSMCs高度表達(dá)，參與VSMCs收縮表型的維持與正常增殖而成為動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)因子，但其在心血管事件中的變化情況目前尚未權(quán)威數(shù)據(jù)。

本研究中ACS患者miR145表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，與Fichtlscherer的研究結(jié)果一致，F(xiàn)ichtlscherer認(rèn)為miR-145主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組件和PBMCs的遷移活性，參與血管內(nèi)膜修復(fù)，因此ACS后miR-145的水平下降可能是斑塊破裂和血管損傷的結(jié)果。而宋翠珠則發(fā)現(xiàn)急性期腦梗死患者血漿miR-145的表達(dá)水平升高，推測(cè)可能是腦梗死患者使用的阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板藥物逆轉(zhuǎn)了不穩(wěn)定斑塊炎癥反應(yīng)時(shí)相，miR-145上升或是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂急性期炎癥控制的間接表現(xiàn)。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可引起斑塊破裂部位出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)，升高的hs-CRP正是反映了這些巨噬細(xì)胞的活性，本研究采血前未給予相應(yīng)的臨床治療，miR-145降低和hs-CRP升高均表明機(jī)體處于不穩(wěn)定斑塊導(dǎo)致的炎癥高峰期，但miR-145具體釋放和影響機(jī)制目前尚不明確，而miR-145可能作為ACS生物標(biāo)志物的假設(shè)，仍需要大量的基礎(chǔ)和臨床研究。

綜上所述，ACS患者血漿miR-145表達(dá)明顯下降，與炎癥反應(yīng)水平呈負(fù)相關(guān)，可能作為ACS的一個(gè)新型生物標(biāo)志物。