金錢松細胞懸浮培養(yǎng)關鍵技術研究

唐 旭， 何詩虹， 王躍華， 馬騰香， 彭雪婷， 李紅芳

（1.四川師范大學生命科學院， 成都610101； 2.成都大學生物產(chǎn)業(yè)學院， 四川 成都610016）

金錢松（Pseudolarix amabilis（Nelson）Rehd.）是我國特有的古老孑遺松科（Pinaceae）樹種，屬于單屬單種［1－3］，由于其特殊的商業(yè)和藥用價值，目前已處于瀕臨滅絕的狀態(tài)，被國家列為二級保護植物［4－7］。當前對金錢松的研究主要集中在栽培技術、化學成分和藥理作用等方面［8－10］；據(jù)報道，金錢松含有二萜類、三萜類和三萜內(nèi)酯類成分，具有抗真菌、抗生育和抗腫瘤等作用［10－12］，因此，對金錢松植物的需求量也大大增加了。

為了更好地解決金錢松植物供不應求的狀況，積極開展對金錢松植物的組織培養(yǎng)研究，最終實現(xiàn)利用細胞發(fā)酵技術大規(guī)模生產(chǎn)含有效成分的金錢松細胞，以滿足各級市場對金錢松及其所含有效成分的需求。通過查閱資料可知，何佳等［13－14］在金錢松內(nèi)生真菌方面進行了大量的工作，但還未見有采用細胞懸浮培養(yǎng)技術來大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)金錢松細胞的；本研究的開展可尋求一條有效解決當前金錢松資源短缺的新途徑。

1 材料和方法

1.1 材 料

本實驗材料采自四川省成都市植物園，經(jīng)成都大學植物鑒定室鑒定為金錢松屬（Pseudolarix Gord.）植物（Pseudolarix amabilis（Nelson）Rehd）金錢松。本研究采用金錢松葉原基誘導產(chǎn)生的優(yōu)良翠綠色愈傷組織為實驗材料。

1.2 方 法

1.2.1 愈傷組織的獲取

選取在 MS＋6－BA 1.0mg／L＋NAA 0.5mg／L培養(yǎng)基中進行了增殖培養(yǎng)20d的金錢松愈傷組織細胞進行懸浮培養(yǎng)，以建立金錢松細胞的懸浮培養(yǎng)體系。

1.2.2 細胞懸浮體系建立

通過對不同激素配比、接種量、蔗糖濃度和pH值等培養(yǎng)條件的篩選，以獲得金錢松細胞懸浮培養(yǎng)的最佳條件。

1.2.3 懸浮培養(yǎng)細胞的鮮重測量

取充分搖勻的懸浮細胞在4 000r／min的條件下離心10min后，倒掉上清液并進行稱重，即為鮮重。試驗重復3次。

1.2.4 計算公式以及數(shù)據(jù)分析

生物量增殖倍數(shù)＝（收獲鮮重量－接種鮮重量）／接種鮮重量。生長速率＝（收獲鮮重－接種鮮重量）／培養(yǎng)天數(shù)。細胞增殖倍數(shù)和生長速率均計算平均值和標準差

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對金錢松懸浮細胞生長的影響

本實驗研究了6－BA、NAA和2，4－D不同激素組合對金錢松懸浮培養(yǎng)細胞快速增殖的影響，其中6－BA的濃度為1.0mg／L；NAA 的濃度范圍為0.3，0.5mg／L和1.0mg／L；2，4－D的濃度范圍為0.3，0.5mg／L和1.0mg／L。試驗每2天觀察記錄1次，培養(yǎng)30d的統(tǒng)計結果見表1。

表1 不同激素配比對金錢松懸浮細胞生長的影響

從表1可以看出，不同激素配比對金錢松懸浮培養(yǎng)細胞的增殖有很大影響。配制的6個激素配比中，以 A 4即以6－BA 1.0mg／L和2，4－D 0.3mg／L時，在懸浮培養(yǎng)30d后其金錢松細胞的增殖倍數(shù)和生長速率都是最高的，即增殖倍數(shù)為3.375±0.44、生長速率為0.506±0.076；另外，通過分析6－BA 與2，4－D 和NAA激素配比對金錢松細胞的增殖生長具體影響是完全不同的；其中在6－BA濃度保持不變的條件下，隨著NAA濃度由0.3mg／L到1.0mg／L的逐漸增高，其細胞增殖倍數(shù)和生長速率也隨著增高，在A 1、A 2和 A 3的3個激素配比中，以 A 3即6－BA 1.0mg／L和NAA 1.0mg／L的激素配比最適宜金錢松細胞的增殖生長；而在由6－BA與2，4－D組合的激素配比 A 4、A 5和 A 6的3個配方中，隨著2，4－D濃度由0.3mg／L到1.0mg／L的逐漸增高，其增殖倍數(shù)和生長速率卻呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。由此可見，在金錢松細胞懸浮培養(yǎng)過程中，采用不同種類的激素配比，其所需要的具體激素濃度也是不同的。

2.2 不同接種量對金錢松懸浮細胞增殖的影響

方文娟等在植物細胞懸浮培養(yǎng)影響因子的研究中指出，在細胞懸浮培養(yǎng)中接種量對細胞增殖生長有很大影響［15－17］。本實驗分別采用在150mL的錐形瓶中裝有40mL培養(yǎng)液后，再分別接入了1.0，2.，3.0g和4.0g分散狀況良好的翠綠色金錢松愈傷組織進行懸浮培養(yǎng)；每2天觀察記錄1次細胞生長狀況，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計結果見表2。

從表2可以看出，不同接種量對金錢松懸浮培養(yǎng)細胞的增殖倍數(shù)和生長速率都有較大影響；當接種量由1.0g升高為2.0g時，經(jīng)30d培養(yǎng)后其細胞的增殖倍數(shù)和生長速率都是最高的，增殖倍數(shù)為2.840±0.560、生長速率為0.487±0.096；但隨著接種量進一步升高超過2.0g時，其細胞的增殖倍數(shù)和生長速率卻出現(xiàn)了下降，并且，當接種量增加到4.0g時，其細胞的增殖倍數(shù)和生長速率都是最低（表2），即增殖倍數(shù)僅為1.340±0.32、生長速率也僅為0.161±0.039。由此可見，正如王娟等［18］所說，當接種量較少時，不但細胞生長的延遲期較長，而且在培養(yǎng)期中的增殖倍數(shù)也較低，但接種量過多時，對數(shù)生長期縮短，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分不足，導致細胞生長緩慢，增殖倍數(shù)也相對較低。當接種量適宜時，懸浮細胞的增殖倍數(shù)最多。

表2 不同接種量對金錢松懸浮細胞的影響

2.3 不同蔗糖濃度對金錢松懸浮細胞增殖的影響

蔗糖濃度也是影響細胞生長和次生物質生產(chǎn)的重要因子。實驗設置的蔗糖濃度分別為20，30，40g／L和50g／L，實驗每2天進行1次觀察記錄，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計（結果見表3）。

表3 不同蔗糖濃度對金錢松懸浮細胞增殖的影響

從表3可以看出，蔗糖濃度從C 1的20g／L增加到C 4的50g／L，其培養(yǎng)的金錢松細胞呈現(xiàn)出不同的生長狀況。具體分析可以發(fā)現(xiàn)，當蔗糖濃度由20g／L升高到40g／L時，經(jīng)30d培養(yǎng)后其細胞的增殖倍數(shù)和生長速率都呈現(xiàn)出升高的趨勢，其中以蔗糖濃度為40 g／L時的細胞增殖倍數(shù)和生長速率為最高，分別是2.700±0.52和0.463±0.089；但隨著蔗糖濃度進一步升高到50g／L時，細胞增殖倍數(shù)和生長速率又開始出現(xiàn)下降。這進一步說明，糖作為碳源，不僅為細胞提供合成新化合物的碳骨架、為細胞的呼吸代謝提供底物與能源；而且糖還用以維持一定的滲透勢，是培養(yǎng)物滲透環(huán)境的主要調(diào)節(jié)者［18－19］。研究表明，過高的蔗糖濃度對細胞生長也是不利的。蔗糖濃度越高，培養(yǎng)基的滲透壓就越大；而過高的滲透壓會抑制培養(yǎng)細胞的生長，甚至會產(chǎn)生非常明顯地毒害作用。

2.4 不同pH值對金錢松懸浮細胞增殖的影響

不同種類的植物細胞在培養(yǎng)過程中所需要的pH值是不同［20－22］。本實驗設置的pH 值分別為4、5、6和7，實驗每2天進行1次觀察記錄，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計（結果見表4）。

表4 不同pH值金錢松懸浮細胞增殖的影響

表4實驗結果顯示，在金錢松細胞增殖生長過程中，培養(yǎng)基中的pH值為6.0時，其懸浮培養(yǎng)細胞的增殖倍數(shù)和生長速率都是最高的。通過觀察金錢松細胞在不同pH值的培養(yǎng)基中的生長狀況可以發(fā)現(xiàn)，pH值偏高或偏低都不利于金錢松細胞的生長，且均出現(xiàn)不同程度的細胞褐變情況，細胞的生長速度也明顯地降低。這主要是因為不同的pH值會引起培養(yǎng)基中的各成分狀態(tài)的改變（過高的pH會使Fe沉淀）、細胞通透性和酶的活性改變，以及培養(yǎng)細胞對營養(yǎng)物質的吸收利用程度的改變；因此，在進行不同細胞的培養(yǎng)過程中，選擇適宜的pH值是非常重要的。

3 結果與討論

植物細胞的懸浮培養(yǎng)對細胞進行快速大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術手段。金錢松作為我國國家二級保護植物，又是具有重要作用的藥用植物，其資源嚴重匱乏，無法滿足市場需求，因此急需探討出大量生產(chǎn)金錢松或獲取金錢松有用成分的方法。

本實驗主要研究了影響金錢松細胞懸浮培養(yǎng)的各種主要因素，通過對激素配比，接種量，蔗糖濃度以及pH值的研究，從而找出最佳培養(yǎng)條件，以構建完整的金錢松細胞懸浮體系，通過實驗，金錢松懸浮的最佳組合為 MS＋6－BA 1.0＋2，4－D 0.3＋蔗糖濃度40g／L＋接種量1.2g／40mL＋pH 6.0，繼代培養(yǎng)天數(shù)為10d，延遲期為0～3d，指數(shù)期為3～7d，衰落期為7～20d，試驗中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)中，開始細胞逐漸在錐形瓶壁上積累，然后在積累細胞周圍長出綠色的細胞，試驗中出現(xiàn)的褐變速率快慢的現(xiàn)象也與實驗中金錢松愈傷組織的質量狀況有關，完全翠綠的褐變速度慢，而黃綠色或黃色的愈傷組織褐變的速率快。

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