許氏平鲉(Sebastes schlegeli)微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)及野生、養(yǎng)殖群體遺傳多樣性分析*

韓承慧 馬海濤, 姜海濱① 劉 陽 韓慧宗 王 斐

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306; 2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室煙臺 264006; 3. 中國科學(xué)院南海海洋研究所 廣州 510301)

許氏平 鲉 (Sebastes schlegeli), 又稱黑鲪, 屬鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉亞目(Scorpaenoidei)、鲉科(Scorpaenidae)、平鲉亞科(Sebastinae)、平鲉屬(Sebastodes)(成慶泰等, 1987), 廣泛分布于東海、黃海和渤海, 屬于卵胎生魚類(馮昭信, 2003), 具有肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、生長速度快、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點, 是我國北方海區(qū)以及日本、韓國的重要養(yǎng)殖魚類之一(劉麗娟等, 2009)。目前養(yǎng)殖苗種以海捕野生苗為主要來源, 養(yǎng)殖成活率較低, 長期的過度捕撈也使許氏平鲉資源和遺傳多樣性遭到破壞, 因此, 進(jìn)行其良種選育已成為保護(hù)我國許氏平鲉資源、促進(jìn)其養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要手段(劉立明等, 2010)。

微衛(wèi)星 DNA標(biāo)記, 又稱簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats, SSR), 具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性高、信息含量大、共顯性等特點(徐莉等, 2002), 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物分子標(biāo)記與數(shù)量性狀的相關(guān)系分析、遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位中(Zhan et al, 2005; 孫國華等, 2011;王文琪等, 2012; 初冠囡等, 2013)。

目前國內(nèi)外對于許氏平 鲉 微衛(wèi)星標(biāo)記的研究處于起步階段, 發(fā)表的微衛(wèi)星標(biāo)記較少。日本學(xué)者Yoshida等(2005)首先利用兩重PCR擴(kuò)增的方法獲得6個微衛(wèi)星標(biāo)記; 韓國學(xué)者An等(2009)利用磁珠富集法獲得了14個微衛(wèi)星標(biāo)記; Yasuike等(2013)利用454測序法篩選了 17個微衛(wèi)星標(biāo)記。國內(nèi)方面, Bai等(2011)運(yùn)用磁珠富集的方法獲得了 18個微衛(wèi)星標(biāo)記;初冠囡等(2013)發(fā)表了 17 個許氏平 鲉 微衛(wèi)星標(biāo)記;賈超峰等(2014)報道了 15個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記。這些微衛(wèi)星標(biāo)記遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足許氏平 鲉 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種的需要。本研究首次運(yùn)用高通量測序的方法從許氏平 鲉 基因組中開發(fā) 24個多態(tài)性較高的微衛(wèi)星標(biāo)記, 并利用其對野生群體和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

許氏平鲉野生群體采自山東榮成附近海域, 養(yǎng)殖群體采自煙臺泰華海洋科技有限公司(國 家級黑鲪原種場)選育的長島群體選育子一代, 子一代個體為混合群體隨機(jī)取樣。榮成野生群體和煙臺養(yǎng)殖群體各取 36尾, 活體采集部分魚鰭樣品后浸泡于 70%乙醇中, 帶回實驗室–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取基因組 DNA(黃培堂, 2002)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的基因組DNA的完整性, NanoDrop2000分光光度計檢測DNA濃度和純度。使用時稀釋到50 ng/μL。

1.3 微衛(wèi)星引物的設(shè)計和篩選

選取完整性和純度高的單個個體DNA送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行基因組高通量測序, 并對含有微衛(wèi)星核心的序列設(shè)計引物, 選取200對微衛(wèi)星引物送由上海生工生物工程有限公司合成。首先選用三個不同個體DNA模板進(jìn)行初步篩選,選出能穩(wěn)定擴(kuò)增的微衛(wèi)星標(biāo)記, 再通過溫度梯度PCR進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化。優(yōu)化后引物分別用FAM(熒光顏色為藍(lán)色)和HEX(熒光顏色為綠色)進(jìn)行標(biāo)記(表 1), 將篩選得到的微衛(wèi)星標(biāo)記在野生群體中擴(kuò)增, 對微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行評價, 然后在養(yǎng)殖群體中擴(kuò)增, 對野生群體和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行評價。PCR反應(yīng)體系為 25μL, 包括 2μL DNA模板(50ng/μL),2.5μL 10×buffer, 引物各1μL (50μmol/L), 0.5μL dNTP(10 mmol/L), 0.2μL Taq DNA 聚合酶(U/μL), 滅菌水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序為; 94℃預(yù)變性5min, 94℃變性40s, 退火反應(yīng)40s, 72℃延伸1min, 30個循環(huán), 最后72℃延伸 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)由 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和處理

PopGene32軟件統(tǒng)計分析每一個位點的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、香農(nóng)-威納指數(shù)(I); GenePop軟件檢驗Hardy-Weinberg平衡, 并經(jīng)Bonferroni校正; PIC Calc 6.0計算每個位點的多態(tài)信息含量(PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

所提取的群體基因組 DN A溶解于 50μL的 T.E Buffer (pH=8.0)中, 濃度在 800—1000 ng/μL, 1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示條帶明顯, 無拖帶降解現(xiàn)象, 紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm在 1.8—1.9之間,說明樣品 DNA中蛋白質(zhì)、RNA等殘存較少, 適合PCR擴(kuò)增。

2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性分析

共篩選出 24個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記, 峰值多在5000—40000之間, 電泳條帶清晰, 說明這些微衛(wèi)星標(biāo)記具有較高的可靠性, 能滿足群體遺傳多樣性分析的需要(圖1)。24對微衛(wèi)星標(biāo)記在野生群體表現(xiàn)出了較高的多態(tài)性(表 2), 在野生群體中共檢測出204個等位基因, 每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)(Na)在 2—21之間, 平均等位基因數(shù)為 8.5個, 其中位點HJ6-30、HJ6-32、HJ6-57和HJ7-46等位基因數(shù)最少,各得到 2個等位基因, 位點 HJ7-60的等位基因數(shù)最多, 得到 21個等位基因。有效等位基因數(shù)(Ne)為1.3340—15.3373, 平均值為 4.5484; 觀測雜合度(Ho)為0.0417—0.9167, 平均值為0.6059; 期望雜合度(He)范圍為 0.0278—0.9722, 平均值為 0.6041; 多態(tài)信息含量(PIC)在 0.1948—0.9496之間, 平均值為 0.6088,其中高度多態(tài)的位點(PIC＞0.5)有 14個, 占總位點數(shù)的 58.33%, 中度多態(tài)位點(0.25＜PIC＜0.5)有 6個, 占25%, 低度多態(tài)位點(PIC＜0.25)有4個, 占16.67%。

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢測

各個微衛(wèi)星位點的 Hardy-Weinberg平衡檢測結(jié)果表明(表 2), 在野生群體中 HJ6-18、HJ6-30、HJ6-31和HJ6-80顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡,偏離位點數(shù)占總位點數(shù)的 16.67%, 在養(yǎng)殖群體中HJ6-19、HJ6-23、HJ7-60和HJ7-100顯著偏離平衡,占總位點數(shù)的 16.67%。其余位點均符合 Hardy-Weinberg平衡。

表1 24對許氏平鲉微衛(wèi)星引物特征Tab.1 Characteristics of 24 pairs of microsatellite primers for S. schlegeli

圖1 位點HJ7-44的部分毛細(xì)管電泳結(jié)果Fig.1 Samples of capillary electrophoresis results for locus HJ7-44

表2 24對微衛(wèi)星標(biāo)記在野生群體和養(yǎng)殖群體中的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of 24 microsatellite primers for wild and cultured populations of S. schlegeli

2.4 野生和養(yǎng)殖群體遺傳多樣性分析

將篩選得到的24個微衛(wèi)星標(biāo)記在養(yǎng)殖群體中擴(kuò)增, 結(jié)果如下; 養(yǎng)殖群體的等位基因數(shù)(Na)為 2—14個, 平均值為 6.9583個; 有效等位基因數(shù)(Ne)為1.0571—9.2903, 平均值為 3.6365; 觀測雜合度(Ho)范圍為 0.0556—0.9722, 平均值為 0.6157; 期望雜合度(He)為 0.0548—0.9049, 平均值為 0.5840; 多態(tài)信息含量(PIC)為 0.0526—0.8825, 平均值為 0.5490; 野生群體和養(yǎng)殖群體的香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)為0.3768—2.8524、0.1269—2.3464, 平均值分別為1.4605和1.2834, 比較野生群體和養(yǎng)殖群體這六組數(shù)據(jù)的均值, 除觀測雜合度(Ho)外, 野生群體都高于養(yǎng)殖群體, 但對以上六組數(shù)據(jù)F檢驗無顯著差異。說明許氏平鲉野生群體的遺傳多樣性高于養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性, 但是兩者之間的差異并不顯著。

3 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記是分子遺傳研究中的一種重要手段,其獲得的方法有多種; 基因組文庫法、微衛(wèi)星富集法、數(shù)據(jù)庫查找法、近緣物種篩選法等(孫波等, 2009)。本研究首次使用高通量測序的方法從許氏平鲉基因組中開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記, 設(shè)計微衛(wèi)星引物200對, 結(jié)果得到了 190對可穩(wěn)定擴(kuò)增的引物, 占 95%, 其中 24對微衛(wèi)星引物具有較高多態(tài)性, 證明這種方法可用于許氏平鲉基因組微衛(wèi)星標(biāo)記的大規(guī)模開發(fā)。Weber(1990)認(rèn)為只有在2堿基重復(fù)序列次數(shù)達(dá)到12次時微衛(wèi)星標(biāo)記才能表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。低度多態(tài)(PIC＜0.25)的位點有四個, 分別是 HJ6-32和 HJ6-57為兩堿基6重復(fù), HJ7-38為三堿基 4重復(fù)和HJ7-46為三堿基5重復(fù), 中度多態(tài)(0.25＜PIC＜0.5)的位點有4個, HJ6-30、HJ6-31、HJ7-66為兩堿基重復(fù), 最多重復(fù)次數(shù)只有8次, HJ7-100為四堿基重復(fù)4次, 以上8個位點的核心序列重復(fù)均少于 12次, 相反核心序列重復(fù)次數(shù)多于12次的微衛(wèi)星標(biāo)記均檢測出較高的雜合度和豐富的多態(tài)性, 這種現(xiàn)象在諸氏鯔蝦虎、三疣梭子蟹、中國明對蝦(蔡磊等, 2015)中也有報道, 因此在設(shè)計引物時應(yīng)選用核心序列重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)在較高水平的序列, 從而避免篩選過程中得到較多低多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記。

24個微衛(wèi)星位點在野生群體中共檢測出 204個等位基因, 每個位點擴(kuò)增出的等位基因數(shù)目2—21個不等, 明顯高于賈超峰等(2014)觀測到的 2—14個和初冠囡等(2013)觀測到的2—8個, 這可能與所選用的檢測方法有關(guān), 以上兩者選用的為聚丙烯酰胺凝膠電泳, 此種方法分辨率較低, 微衛(wèi)星因其多態(tài)性較高,核心重復(fù)次數(shù)相差較少的兩條等位基因條帶可能相近, 導(dǎo)致條帶判讀產(chǎn)生誤差。本實驗選用的是毛細(xì)管電泳, 毛細(xì)管電泳技術(shù)因其高靈敏度、高分辨率、高速度、低耗樣等優(yōu)勢, 已經(jīng)逐步代替了經(jīng)典電泳技術(shù)(毛煜等, 2001), 得到的結(jié)果分辨率和準(zhǔn)確性更高。

24個微衛(wèi)星標(biāo)記在野生群體和養(yǎng)殖群體中各有四個位點顯著偏離了 Hardy-Weinberg平衡, 主要原因是純合子過剩。野生許氏平鲉營半定棲生活, 活動范圍較小, 這種生活習(xí)性有可能造成近親交配, 從而出現(xiàn)微衛(wèi)星位點偏離 Hardy-Weinberg平衡現(xiàn)象; 而養(yǎng)殖群體所用的親本數(shù)量一般比較少, 也可能造成近親交配并出現(xiàn)微衛(wèi)星位點偏離 Hardy-Weinberg平衡現(xiàn)象。另外, 無效等位基因的存在也能導(dǎo)致微衛(wèi)星位點偏離 Hardy-Weinberg平衡現(xiàn)象。研究表明在海洋經(jīng)濟(jì)魚類、貝類、棘皮類的養(yǎng)殖群體中被檢測位點偏離Hardy-Weinberg平衡的現(xiàn)象普遍存在(耿慧君等,2009)。

最大限度地維持種內(nèi)遺傳多樣性水平, 是持續(xù)利用種質(zhì)資源的前提和基礎(chǔ)。群體的遺傳多樣性每喪失10%, 就會對其繁育能力、存活率、生長等重要性狀產(chǎn)生很大的負(fù)面影響(Allendorf et al, 1987)。多態(tài)信息含量(PIC)是指一個后代所獲的某個等位基因標(biāo)記來自它親本的同一個等位標(biāo)記的可能性大小(彭銀輝等, 2008), 野生群體和養(yǎng)殖群體的平均PIC值均大于0.5, 表明兩個群體均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。野生群體的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s指數(shù)、期望雜合度和多態(tài)信息含量的平均值都高于養(yǎng)殖群體, 但對以上參數(shù)進(jìn)行F檢驗后發(fā)現(xiàn)均無顯著差異(P＞0.05)。一方面, 本結(jié)果說明許氏平鲉養(yǎng)殖群體仍保持有較高的遺傳多樣性, 原因可能與養(yǎng)殖群體的親本數(shù)量較大和選育代數(shù)較少有關(guān), 我們在進(jìn)行許氏平鲉群體選育時, 一般會選擇較大數(shù)量的優(yōu)質(zhì)個體作為親本, 從而有效地防止由于親本數(shù)量太少而造成選育子代遺傳多樣性降低的風(fēng)險; 另外由于本研究所用養(yǎng)殖群體為群體選育子一代, 較少的選育代數(shù)減少了近親交配風(fēng)險的發(fā)生, 從而也避免了選育子代遺傳多樣性降低的發(fā)生。另一方面, 單從數(shù)據(jù)上看野生群體的遺傳多樣性略高于養(yǎng)殖群體, 這說明人工定向選育對選育群體的遺傳多樣性也產(chǎn)生了一定的影響, 這提醒我們在下一步的良種選育中, 應(yīng)進(jìn)一步采取避免選育群體遺傳多樣性降低的措施,如定期補(bǔ)充野生個體作為親本等, 并利用微衛(wèi)星標(biāo)記對其選育后代繼續(xù)進(jìn)行遺傳監(jiān)控, 從而達(dá)到較好的選育效果。

本研究開發(fā)的24對許氏平鲉微衛(wèi)星標(biāo)記為其遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種提供了更多標(biāo)記選擇, 對野生群體和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析結(jié)果也為下一步的新品系選育提供了參考。

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