對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒編碼蛋白的相互作用研究*

陳沈雪 魏永偉 苗 亮 陳 炯

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211)

傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infection hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)是感染對(duì)蝦的一種重要病原, 首次發(fā)現(xiàn)于美國夏威夷地區(qū)的南美藍(lán)對(duì)蝦(Litopenaeus stylirostris), IHHNV感染可引起南美藍(lán)對(duì)蝦幼蝦 90%的死亡(Tang et al,2000; Tang et al, 2001; Encinas-García et al, 2015)。IHHNV亦可感染南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei),但不引起對(duì)蝦的死亡, 而引起慢性矮小殘缺綜合征(Runt Deformity Syndrome, RDS)(Hsieh et al, 2006;Dhar et al, 2007, Lightner, 2011), 患病對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢,導(dǎo)致其產(chǎn)量和質(zhì)量急劇下降, 給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Galván-Alvarez et al, 2012; Silva et al,2014; Encinas-García et al, 2015)。

IHHNV是單鏈線性DNA病毒, 無囊膜, 為二十面體, 直徑為 22—23 nm, 屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、濃核病毒亞科(Densovirinae), 是目前已知最小的對(duì)蝦病毒(Lightner, 1999; Mendoza-Cano et al, 2014; Silva et al, 2014; Shen et al, 2015)。IHHNV基因組全長(zhǎng)約3.9—4 kb, 含有3個(gè)開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF), ORF1和ORF2分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白1和2 (nonstructural protein 1, NS1; nonstructural protein 2, NS2), ORF3編碼病毒的衣殼蛋白(capsid protein, CP)。NS1、NS2和CP分別含666個(gè)氨基酸(75.77 kDa), 343個(gè)氨基酸(42.11 kDa)和329個(gè)氨基酸(37.48 kDa) (Shike et al, 2000; Vega-Heredia et al,2012)。Tang等(2003)研究認(rèn)為NS1可能參與調(diào)控病毒轉(zhuǎn)錄及復(fù)制過程中的酶活性; Geng等(2012)研究發(fā)現(xiàn) NS2可與對(duì)蝦肌動(dòng)蛋白相互作用, 并在病毒感染過程中起著重要作用; Hou等(2009)將CP進(jìn)行原核表達(dá)后, 發(fā)現(xiàn)該重組蛋白能夠自我組裝成病毒樣顆粒(virus-like particles, VLPs)。除上述報(bào)道外, 目前針對(duì)IHHNV編碼蛋白的相關(guān)基礎(chǔ)研究鮮有報(bào)道。病毒編碼蛋白間的相互作用在病毒生命周期中發(fā)揮重要作用, 能夠直接影響病毒復(fù)制和侵染, 因此, 研究病毒編碼蛋白間的相互作用有助于深入理解病毒感染過程和病毒與宿主間的相互作用(Guoet al, 2001; Lianet al, 2014)。然而, 目前尚未有IHHNV編碼蛋白間相互作用展開相關(guān)研究的報(bào)道。本研究構(gòu)建了 IHHNV編碼的三種蛋白NS1、NS2和CP的酵母雙雜交載體,研究3個(gè)編碼蛋白間的相互作用情況, 以期為深入研究IHHNV的組裝機(jī)制和致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌TG1、酵母菌株AH109, 載體pGADT7、pGBKT7、pGADT7-T、pGBKT7-53、pGBKT7-lam由本實(shí)驗(yàn)室保存。SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Ade/-Leu、SD/-His/-Leu、SD/-Ade/-Trp、SD/-His/-Trp、SD/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、Minimal SD Base、X-α-gal購自 Clontech公司; PCR相關(guān)試劑、pMD19-T Vector Cloning Kit、NdeI、BamHI等購自TaKaRa公司; GEL Extraction Kit和Plasmid Mini Kit I購自O(shè)mega公司; 引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成; 序列由上海華大基因進(jìn)行測(cè)定。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增IHHNV NS1、NS2、CP序列 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室克隆的 IHHNV的基因組全長(zhǎng)序列(KP733862)設(shè)計(jì)引物(見表 1), 以本實(shí)驗(yàn)室提取的IHHNV Wenzhou株基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性2 min, 94℃ 30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸 2 min, 共 35個(gè)循環(huán), 最后 72℃延伸10 min。參照GEL Extraction Kit回收PCR產(chǎn)物,并將其克隆至pMD19-T載體。將重組載體命名為pMD19-NS1、pMD19-NS2、pMD19-CP。

表1 本研究用到的寡核苷酸引物Tab.1 The oligonucleotide primers used in this study

1.2.2 獵物載體及誘餌載體的構(gòu)建及鑒定 參照Plasmid Mini Kit I精抽重組質(zhì)粒, 用NdeI和BamHI進(jìn)行雙酶切, 并用同樣的酶雙酶切 pGADT7和pGBKT7?；厥彰盖挟a(chǎn)物并進(jìn)行連接, 構(gòu)建酵母獵物載體 pGADT7-NS1、pGADT7-NS2、pGADT7-CP,誘餌載體pGBKT7-NS1、pGBKT7-NS2、pGBKT7-CP,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TG1, 涂布于含有氨芐霉素(100 μg/mL)或卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板。挑選單菌落經(jīng)PCR初步驗(yàn)證, 再用NdeI和BamHI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證后,將陽性克隆送至上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 獵物蛋白及誘餌蛋白對(duì)酵母 AH109的毒性檢測(cè) 用滅菌的牙簽挑取含有重組獵物載體或誘餌載體的酵母 AH109 陽性克隆至 50 mL SD/-Leu/Amp (20μg/ml)或 SD/-Trp/Kan (20 μg/mL)液體培養(yǎng)基中, 30℃, 230 r/min培養(yǎng)24 h后, 檢測(cè)其OD值。

1.2.4 獵物蛋白及誘餌蛋白自激活檢測(cè) 將AH109/pGADT7-NS1、AH109/pGADT7-NS2、AH109/pGADT7-CP 菌液涂布于 SD/-Leu/X-α-gal、SD/-His/-Leu/X-α-gal、SD/-Ade/-Leu/X-α-gal, AH109/pGBKT7-NS1、AH109/pGBKT7-NS2、AH09/pGBKT7-CP菌液涂布于 SD/-Trp/X-α-gal、SD/-His/-Trp/X-α-gal、SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板, 30℃倒置培養(yǎng) 3—5 d, 觀察其生長(zhǎng)情況和顏色變化。

1.2.5 獵物載體及誘餌載體共轉(zhuǎn)化酵母 酵母獵物載體及誘餌載體精抽后, 根據(jù) LiAc法共轉(zhuǎn)化至酵母AH109中, 涂布于SD/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基, 30℃倒置培養(yǎng) 3—4 d。隨機(jī)挑取 6個(gè)單菌落至SD/-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基, 30℃, 230 r/min培養(yǎng)24 h。經(jīng)菌液 PCR驗(yàn)證后, 點(diǎn)種至 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal固體培養(yǎng)基, 倒置培養(yǎng)3—5 d, 并觀察其生長(zhǎng)及顏色變化。

1.2.6 IHHNV CP自身作用區(qū)域的鑒定 參照方法1.2.1和1.2.2, 根據(jù)IHHNV的CP序列設(shè)計(jì)引物(見表1), 以本實(shí)驗(yàn)室提取的IHHNV Wenzhou株基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。切膠回收目的片段, 并分別克隆至pMD19-T載體, 經(jīng)Nde I和BamH I雙酶切后, 連接到經(jīng)相同酶切的pGBKT7載體, 構(gòu)建CP缺失誘餌載體 pGBKT7-CP151(+)、pGBKT7-CP301(+)、pGBKT7-CP451(+)、pGBKT7-CP601(+)、pGBKT7-CP387(-)、pGBKT7-CP537(-)、pGBKT7-CP687(-)、pGBKT7-CP837(-)。隨后, PCR和雙酶切驗(yàn)證重組CP缺失誘餌載體, 經(jīng)測(cè)序無誤后, 再分別與獵物載體pGADT7-CP共轉(zhuǎn)化至酵母 AH109中, 涂布于SD/-Leu/-Trp平板, 并進(jìn)一步點(diǎn)種于 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal平板, 觀察其生長(zhǎng)及顏色變化。

2 結(jié)果

2.1 IHHNV編碼蛋白序列的擴(kuò)增

以本實(shí)驗(yàn)室提取的IHHNV Wenzhou株基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增NS1、NS2、CP序列, 得到約2 kb、1.1 kb、1 kb的片段(圖1), 與預(yù)期目的片段大小相符合。

2.2 獵物載體及誘餌載體的鑒定

重組獵物載體及誘餌載體經(jīng) PCR及 Nde I和BamH I雙酶切分析, 結(jié)果表明NS1、NS2、CP已成功插入到 pGADT7(圖 2A)和 pGBKT7載體(圖 2B)。測(cè)序結(jié)果顯示, 目的片段已正確插入到獵物載體和誘餌載體, NS1、NS2、CP序列無任何堿基的缺失或突變。

圖1 IHHNV NS1、NS2、CP基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of IHHNV NS1, NS2 and CP

2.3 獵物蛋白及誘餌蛋白對(duì)酵母AH109的毒性檢測(cè)

挑取 AH109/pGADT7-NS1、AH109/pGADT7-NS2、AH109/pGADT7-CP單克隆于50 mL SD/-Leu/Amp (20 μg/mL)培養(yǎng)基中, pGBKT7-NS1、pGBKT7-NS2、pGBKT7-CP 于 SD/-Trp/Kan (20 μg/ml)培養(yǎng)基中, 30℃振蕩培養(yǎng)24 h, 測(cè)得菌液OD600分別為0.83、1.02、1.16, 均大于 0.8, 表明獵物蛋白及誘餌蛋白對(duì)酵母AH109無毒性作用, 可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的展開。

2.4 獵物蛋白及誘餌蛋白的自激活檢測(cè)

將 AH109/pGADT7-NS1、AH109/pGADT7-NS2、AH109/pGADT7-CP 涂布于 SD/-Leu/X-α-gal、SD/-His/-Leu/X-α-gal、SD/-Ade/-Leu/X-α-gal, 觀察到其均能在 SD/-Leu/X-α-gal平板上生長(zhǎng)但不顯藍(lán)(圖 3A),而在 SD/-His/-Leu/X-α-gal 和 SD/-Ade/-Leu/X-α-gal平板均不能生長(zhǎng)(圖 3B和 3C); 將 AH109/pGBKT7-NS1、AH109/pGBKT7-NS2、AH109/pGBKT7-CP 涂布于 SD/-Trp/X-α-gal、SD/-His/-Trp/X-α-gal 和 SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上, 觀察到其能在 SD/-Trp/X-α-gal平板上生長(zhǎng)但不顯藍(lán)(圖 3D), 在 SD/-His/-Trp/X-α-gal 和 SD/-Ade/-Trp/X-α-gal 平板均不能生長(zhǎng)(圖3E和3F)。結(jié)果表明, 該重組獵物載體及誘餌載體表達(dá)的蛋白無自激活特性, 不能自激活 AH109報(bào)告基因ADE2、HIS3和MEL1的表達(dá), 可應(yīng)用該酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行IHHNV 編碼的NS1、NS2和CP蛋白間相互作用研究。

圖2 重組獵物載體及誘餌載體雙酶切及PCR鑒定Fig.2 Digestion and PCR identification of recombined prey vectors and bait vectors

圖3 獵物蛋白和誘餌蛋白自激活作用檢測(cè)Fig.3 Self-activation analysis of prey proteins and bait proteins

2.5 編碼蛋白間相互作用的鑒定

共轉(zhuǎn)化有pGADT7-NS1/pGBKT7-NS1、pGADT7-NS1/pGBKT7-NS2、pGADT7-NS1/pGBKT7-CP、pGADT7-NS2/pGBKT7-NS1、pGADT7-NS2/pGBKT7-NS2、pGADT7-NS2/pGBKT7-CP、pGADT7-CP/pGBKT7-NS1、pGADT7-CP/pGBKT7-NS2、pGADT7-CP/pGBKT7-CP、pGADT7-T/pGBKT7-lam、pGADT7-T/pGBKT7-53的酵母重組子AH109均能夠在SD-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng), 挑取各酵母重組子點(diǎn)種至 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal固體培養(yǎng)基, 只有轉(zhuǎn)化有pGADT7-CP/pGBKT7-CP的酵母重組子能夠在該固體培養(yǎng)基上上生長(zhǎng)并顯藍(lán), 與陽性對(duì)照(共轉(zhuǎn)化有pGADT7-T/pGBKT7-53的酵母AH109)生長(zhǎng)狀況一致,而其它酵母重組子均與陰性對(duì)照(共轉(zhuǎn)化有pGADT7-T/pGBKT7-lam 的酵母 AH109)一樣不能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(圖4)。說明IHHNV編碼蛋白CP-CP能夠相互作用, 并激活A(yù)H109報(bào)告基因ADE2、HIS3和MEL1的表達(dá), 而其它編碼蛋白間不存在相互作用(表 2)。

表2 酵母雙雜交分析IHHNV編碼蛋白間的相互作用Tab.2 Yeast two hybrid analysis of the interactions among IHHNV encoding proteins

2.6 IHHNV CP自身作用區(qū)域的鑒定

為進(jìn)一步確定 CP蛋白自身互作的作用位點(diǎn), 分別對(duì)CP蛋白的N端和C端進(jìn)行逐段缺失, 構(gòu)建新的CP缺失型誘餌載體 pGBKT7-CP151(+)、pGBKT7-CP301(+)、pGBKT7-CP451(+)、pGBKT7-CP601(+)、pGBKT7-CP387(－)、pGBKT7-CP537(－)、pGBKT7-CP687(－)、pGBKT7-CP837(－)(圖 5A), 并與獵物載體 pGADT7-CP共轉(zhuǎn)至酵母 AH109中, 涂布于SD/-Leu/-Trp平板, 并進(jìn)一步點(diǎn)種于 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal平板。結(jié)果顯示構(gòu)建的任何缺失體均未觀察到酵母重組子生長(zhǎng)(圖5B), 說明IHHNV CP序列任何較小片段的缺失都會(huì)導(dǎo)致自身互作的喪失。

圖4 IHHNV編碼蛋白間相互作用鑒定Fig.4 Identification of the interactions between IHHNV encoding proteins

圖5 IHHNV CP自身互作作用位點(diǎn)鑒定Fig.5 Identification of the functional sites of CP for self-interaction

3 討論

酵母雙雜交是一種體內(nèi)鑒定和分析蛋白-蛋白相互作用的重要技術(shù)方法, 能夠檢測(cè)蛋白間微弱和短暫的相互作用。此外, 由于蛋白之間的相互作用是在真核酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行, 蛋白質(zhì)可以其天然折疊狀態(tài)存在, 能夠增加檢測(cè)的靈敏度和可信度。目前, 該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病毒蛋白相互作用的研究。例如,Tacken等(2003)利用酵母雙雜交技術(shù)鑒定傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV) VP2、VP3、VP4和VP5同型蛋白間的相互作用, 并用篩減突變法進(jìn)一步確定這些蛋白自身互作的位點(diǎn); Wang等(2015)利用酵母雙雜交技術(shù)鑒定瓜類褪綠黃化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)各編碼蛋白間的相互作用, 發(fā)現(xiàn)P59和P9能夠自身互作, 進(jìn)一步分析其自身互作的作用位點(diǎn)后, 發(fā)現(xiàn)P59的中間區(qū)域(第 173—344個(gè)氨基酸)是自身互作的必要位點(diǎn), 而P9的3個(gè)不同截短位點(diǎn)與全長(zhǎng)P9均無相互作用; Lian等(2014)用酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)水稻條紋病毒(Rice stripe virus, RSV)的核蛋白(nucleocapsid protein,NP)N端第 1—47個(gè)氨基酸是其自身互作所必需的,并且第 42—47個(gè)氨基酸是該作用最重要的氨基酸殘基。本研究成功構(gòu)建了IHHNV編碼的NS1、NS2和CP蛋白酵母獵物載體pGADT7-NS1、pGADT7-NS2、pGADT7-CP和誘餌載體 pGBKT7-NS1、 pGBKT7-NS2、pGBKT7-CP, 并且這些重組載體無自激活活性,不能激活酵母AH109下游報(bào)告基因的表達(dá)。此外, 由于某些融合蛋白可能對(duì)酵母具有一定的毒性作用,本研究也測(cè)定了各酵母重組子在 SD/-Leu/Amp或SD/-Trp/Kan液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24h后的吸光值,結(jié)果顯示各重組子的 OD600均大于 0.8, 表明融合蛋白對(duì)酵母AH109無毒性作用。

病毒蛋白-蛋白間的相互作用在病毒基因組復(fù)制及病毒粒子的組裝等過程中發(fā)揮重要的作用(Li et al,2013b)。如風(fēng)疹病毒(Rubella virus, RV)結(jié)構(gòu)蛋白CP能夠通過與非結(jié)構(gòu)蛋白p150相互作用促進(jìn)病毒RNA的復(fù)制(Tzeng et al, 2006; Sakata et al, 2014); 水稻矮縮病毒(rice dwarf virus, RDV)非結(jié)構(gòu)蛋白 Pns12與Pns11間存在相互作用, 而Pns6與Pns11間也存在相互作用, 這兩組非結(jié)構(gòu)蛋白間的相互作用均能影響病毒的復(fù)制(Chen et al, 2015); 輪狀病毒(Rotavirus)非結(jié)構(gòu)蛋白 NSP5與非結(jié)構(gòu)蛋白 NSP2的相互作用,以及結(jié)構(gòu)蛋白VP1與NSP5間強(qiáng)烈的相互作用共同促進(jìn)病毒的復(fù)制及病毒粒子的形成(Eichwald et al, 2004;Arnoldi et al, 2007)。本研究對(duì)IHHNV各編碼蛋白間的相互作用進(jìn)行研究, 結(jié)果顯示, IHHNV的結(jié)構(gòu)蛋白CP與非結(jié)構(gòu)蛋白間NS1、NS2或者非結(jié)構(gòu)蛋白NS1與 NS2間不存在異型相互作用, 而只有病毒的結(jié)構(gòu)蛋白 CP存在同型相互作用。然而, 人們?cè)谘芯客瑢偌?xì)小病毒科的脊椎動(dòng)物病毒時(shí)發(fā)現(xiàn), 非結(jié)構(gòu)蛋白NS1能夠增強(qiáng)病毒CP基因的表達(dá)(Shike et al, 2000), 因此, 細(xì)小病毒科的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1通過何種方式調(diào)控CP基因的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。

研究病毒衣殼蛋白間的自身互作是開展病毒自我復(fù)制和裝配的基礎(chǔ)性研究, Hallan和Gafni在研究番茄黃曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)全長(zhǎng)CP和誘變CP同型蛋白間的相互作用時(shí),全長(zhǎng) CP能夠自身互作, 截短的蛋白序列能夠與全長(zhǎng)CP互作, 而不與其自身截短的蛋白序列互作, 從而推測(cè) CP-CP間的相互作用是源于其中一個(gè) CP的 N端序列與另一個(gè)CP的C末端序列相互作用(Hallan et al, 2001); Kang等在研究大豆花葉病毒(soybean mosaic virus, SMV)編碼蛋白間的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)CP能夠自身互作, C末端序列(第170—256 個(gè)氨基酸)的截短會(huì)導(dǎo)致其自身互作的喪失, 由于預(yù)測(cè)C末端具有很強(qiáng)的螺旋結(jié)構(gòu), 研究認(rèn)為C末端參與CP的自身互作能夠促進(jìn)病毒的組裝(Kang et al, 2004; Kang et al,2006)。然而, 本研究發(fā)現(xiàn)IHHNV的CP截短后不能夠與全長(zhǎng) CP發(fā)生相互作用, 這表明 CP的自身互作是高度敏感的, 任何較少氨基酸序列的截短將導(dǎo)致其自身互作的喪失。Hou 等(2009)在對(duì)IHHNV的CP進(jìn)行原核表達(dá)時(shí), 發(fā)現(xiàn) CP能夠自我組裝成與天然IHHNV病毒粒子相同大小和形狀的VLPs, 因此, 我們推測(cè) CP-CP的自身互作參與病毒顆粒的自我組裝過程, 而 CP部分氨基酸序列的缺失將導(dǎo)致其自我組裝效率的降低。

對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)是世界經(jīng)濟(jì)的重要組成部分, 其中南美白對(duì)蝦為主要的對(duì)蝦養(yǎng)殖種類。雖然近幾年對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷增長(zhǎng), 但因?qū)ξr疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失每年約達(dá)10億美元(Li et al, 2013a)。大部分的對(duì)蝦疾病是由細(xì)菌和病毒引起, 而抗生素的使用并不能有效防治病毒引起的疾病。對(duì)蝦缺乏脊椎動(dòng)物所特有的獲得性免疫應(yīng)答, 由于缺乏抗體應(yīng)答, 利用 VLPs進(jìn)行藥物傳遞或進(jìn)行基因治療將成為防治對(duì)蝦病毒感染的有效方法。近些年研究認(rèn)為利用 VLPs傳遞siRNA 或 dsRNA等干擾 RNA (interfering RNA,iRNA)將能夠有效抑制對(duì)蝦病毒的復(fù)制(Hou et al,2009), 本研究中, IHHNV CP的自身互作及其自身互作的高度敏感性, 將為尋找有效途徑防治對(duì)蝦病毒感染提供指導(dǎo)意義。

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