單條膠黏藻(Dumontia simplex Cotton)孢子早期發(fā)育及其生活史的研究*

姜 朋 趙樹雨 李 芳 王宏偉

(遼寧師范大學生命科學學院 大連 116081)

單條膠黏藻(Dumontia simplex Cotton)隸屬于紅藻門(Rhodophyta), 杉藻目(Gigartinales), 膠黏藻科(Dumontiaceae), 膠黏藻屬(Dumontia Lamouroux), 藻體直立, 多數(shù)叢生, 單條不分枝, 基部有小盤狀固著器, 其上有一短細的楔形柄, 向上逐漸擴張成為一個倒披針形或線形的扁平葉片, 長度可達 3—35cm, 寬度有 2—22cm, 一般藻體呈紫紅色, 生長在低潮帶的石沼中(圖1)。囊果12月至次年1月成熟, 四分孢子囊冬季至春季成熟, 除遼寧的大連、長?？h外, 在山東的青島、煙臺及威海等地均有分布(夏邦美, 2004;曾呈奎, 2009)。

單條膠黏藻具有較高食用價值, 含有較多蛋白質(zhì)和多糖(Su et al, 2004)。夏邦美(2004)及曾呈奎(2009)對其外部形態(tài)、內(nèi)部構(gòu)造進行了研究。Saunders(2005)對單條膠黏藻細胞色素 c氧化酶亞基I(COI)基因序列進行了分析, Saunders等(2011)又對其進行了核酮糖1,5-二磷酸梭化酶/氧化酶大亞基(rbcL)基因和核糖體大亞基(LSUrRNA)基因序列的分析等。溫度、光強和鹽度是影響海藻生長、發(fā)育等生命活動的重要因子(王波等, 2007; Chen et al, 2012; 丁蘭平等, 2013), 但有關(guān)環(huán)境因子對該藻的孢子發(fā)育影響及生活史方面尚未見報道。

本文通過開展溫度、光強和鹽度等環(huán)境因子對單條膠黏藻孢子早期發(fā)育影響的研究, 探討其孢子發(fā)生類型和生活史, 旨在為單條膠黏藻的種質(zhì)保存、育苗和人工養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

圖1 單條膠黏藻的野外生境Fig.1 Habitat of D. simplex from Fujiazhuang, Dalian

1 材料與方法

1.1 材料采集

單條膠黏藻標本于2014年1月15日和2014年2月15日采于大連市付家莊低潮帶的石沼中, 分別將帶有成熟囊果的雌配子體、帶有四分孢子囊的四分孢子體活體置于盛有海水的保溫箱中, 帶回實驗室。

實驗用海水取自付家莊海域的天然海水, 經(jīng)ST20S手持式鹽度計(購自美國 Ohaus公司)測量, 海水鹽度為30。

1.2 材料預處理

將天然海水經(jīng)過濾、滅菌, 冷卻后用于實驗。不同鹽度的海水, 是通過將滅菌后的海水蒸發(fā)濃縮, 再經(jīng)蒸餾水稀釋后獲得。

將四分孢子體和雌配子體進行藻體表面去污處理, 使用解剖針和軟毛刷輕輕去除藻體表面的附著物, 再以滅菌的海水將其沖洗數(shù)次。將處理后的藻體分別暫養(yǎng)于已滅菌的玻璃缸(20cm×10cm×10cm)中,玻璃缸底部鋪滿載玻片, 倒入消毒海水并充氣培養(yǎng),暫養(yǎng)條件為溫度 12°C、光照強度 160μmol/(m2·s)、鹽度 30, 光周期為光(L)︰暗(D)=12︰12。經(jīng)過約 24h的暫養(yǎng), 將載玻片取出放在顯微鏡(Nikon 216987)下觀察, 待視野中(10×10倍)觀察到的孢子附著量達到20—25個時, 取出進行后續(xù)培養(yǎng)及觀察實驗。

1.3 實驗設(shè)計

溫度組試驗: 溫度設(shè)置為 6、9、12、15、20、30°C六個梯度, 光照強度設(shè)置為 160μmol/(m2·s), 鹽度為30, 光照周期為L︰D=12︰12。

光照強度組試驗: 光照強度設(shè)置為80、120、160、200、240、300、400μmol/(m2·s)七個梯度, 溫度為 12°C,鹽度為30, 光照周期為L︰D=12︰12。

鹽度組試驗: 鹽度設(shè)置為 15、20、25、30、35、40、50 七個梯度, 溫度為 12°C, 光強為 160μmol/(m2·s),光照周期為L:D=12:12。

每組實驗重復3次, 將已經(jīng)附著了果孢子和四分孢子的載玻片分別放入滅菌后的D15cm培養(yǎng)皿中并編碼,倒入相應(yīng)處理的polyethersulphone (PES)培養(yǎng)液(PES培養(yǎng)液是PES原液:滅菌海水=1:49, 每1000 mL的培養(yǎng)液中加2mg的GeO2, 防止硅藻生長)至培養(yǎng)皿2/3體積處,將培養(yǎng)皿放置在相應(yīng)條件的光溫控制培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng), 培養(yǎng)過程中每4天更換1次培養(yǎng)液。

1.4 觀察方法與統(tǒng)計分析

培養(yǎng)期間每 2天一次取出載玻片觀察孢子的萌發(fā)情況, 用Olympus BH2數(shù)碼相機(Olympus Beijing Co. Ltd., China)照相保存, 形成盤狀體后即測量其直徑, 隨后每周每組隨機抽取 10個盤狀體測量一次。盤狀體平均相對生長速率利用公式求得:

RGR(%/d)=(lnWt-lnW0)/t×100%

式中, W0表示初始盤狀體直徑, t是培養(yǎng)的天數(shù)(d), Wt表示培養(yǎng)t天后的盤狀體直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 單條膠黏藻孢子(果孢子)的發(fā)育過程

雌配子體表面形成的囊果較小, 散生于內(nèi)皮層,呈小斑點狀(圖 2a), 暫養(yǎng)條件下培養(yǎng)約 24h, 果孢子放散后附著在載玻片上, 單個附著或多個附著于一起, 呈黃褐色, 近球形, 直徑為 5—10μm, 內(nèi)含有紅色和黃褐色色素(圖2b)。果孢子附著后開始分裂成四個細胞后并在此基礎(chǔ)不斷分裂(圖2c), 分裂期內(nèi)細胞生長不顯著, 繼續(xù)培養(yǎng), 整個細胞團的細胞數(shù)量增長明顯, 顯微鏡下觀察的細胞團仍為近球形(圖 2d—e)培養(yǎng)到第6—8天時細胞團的直徑達到約60μm, 形成了一個圓盤形的結(jié)構(gòu), 并出現(xiàn)了頂細胞和基細胞的分化, 該結(jié)構(gòu)發(fā)育成了盤狀體(圖 2f)。進入盤狀體生長階段, 細胞仍然不斷分裂, 盤狀體開始不斷地生長、增大(圖2g—h), 培養(yǎng)到30天左右時, 盤狀體停止生長, 其一側(cè)隆起, 繼續(xù)分裂伸長形成直立枝(圖2i)。

四分孢子的早期發(fā)育情況與果孢子基本一致。

2.2 溫度對孢子早期發(fā)育的影響

溫度對果孢子早期發(fā)育影響如圖3所示。溫度為6°C時, 盤狀體增長緩慢, 第36天時直徑接近190μm,相對生長速率為4.34%; 溫度為 9°C時, 果孢子最先萌發(fā)出盤狀體, 且盤狀體直徑增長最快, 初始盤狀體直徑達到60μm, 第36天時為290μm, 相對生長速率為5.53%; 溫度12°C時盤狀體增長較快, 36天時直徑達到240μm, 相對生長速率為4.98%; 溫度為15°C和20°C時, 果孢子萌發(fā)少許且盤狀體生長十分緩慢,培養(yǎng)到后期無法萌發(fā)出直立芽體; 溫度為 30°C時,果孢子不萌發(fā)。適合果孢子生長的溫度范圍為 9—12°C, 對其生長影響的優(yōu)劣順序為 9°C ＞ 12°C ＞ 6°C＞ 15°C, 最適培養(yǎng)溫度為 9°C。

圖2 單條膠黏藻果孢子的萌發(fā)過程Fig.2 The development of carpospores of D. simplex

圖3 溫度對培養(yǎng)36天果孢子的發(fā)育影響Fig.3 Effect of temperature on the development of carpospores cultured for 36 days

溫度對四分孢子早期發(fā)育影響見圖 4。溫度為6°C時, 培養(yǎng)34天時盤狀體直徑為210μm, 相對生長速率為4.79%; 在9°C和12°C時盤狀體發(fā)育最快, 培養(yǎng) 34天的直徑都接近 300μm, 相對生長速率分別為5.48%和 5.49%; 溫度為 15°C 時, 盤狀體發(fā)育較快,第34天的直徑和相對生長速率分別為230μm、4.89%;溫度為 20°C時四分孢子萌發(fā)少許, 盤狀體生長十分緩慢; 溫度為30°C時, 四分孢子不萌發(fā)。以上分析看出, 影響盤狀體生長的優(yōu)劣順序為 9°C=12°C ＞ 15°C＞ 6°C ＞ 20°C ＞ 30°C, 最適溫度范圍為 9—12°C。

2.3 光照強度對孢子早期發(fā)育的影響

圖5表示光照強度對果孢子早期發(fā)育的影響。光照強度為 80μmol/(m2·s)時, 盤狀體生長緩慢, 培養(yǎng) 36天的相對生長速率為 3.57%; 光強 120μmol/(m2·s)下的盤狀體在培養(yǎng) 36天時直徑接近 210μm, 相對生長速率為 4.42%; 光強為 160μmol/(m2·s)時, 盤狀體發(fā)育最快, 第 36天時直徑接近 300μm, 相對生長速率為 5.36%; 光強為 200μmol/(m2·s)時, 第 36 天時盤狀體直徑約為 240μm, 相對生長速率分別為 4.78%; 光強為 240μmol/(m2·s)和 300μmol/(m2·s)時, 盤狀體的生長受到明顯抑制, 培養(yǎng) 36天的相對生長速率分別為3.69%和 0.10%。光強為 400μmol/(m2·s)時, 盤狀體培養(yǎng)到后期逐漸死亡。以上分析表明, 在適宜盤狀體生長的光照強度范圍內(nèi), 優(yōu)劣順序為 160μmol/(m2·s) ＞200μmol/(m2·s) ＞ 120μmol/(m2·s)。

圖5 光強對培養(yǎng)36天果孢子發(fā)育的影響Fig.5 Effect of light intensity on the development of carpospores cultured for 36 days

光照強度對四分孢子早期發(fā)育的影響見圖6。光強為 80μmol/(m2·s)時, 盤狀體的生長受到明顯抑制,培養(yǎng)34天時相對生長速率僅為3.74%; 光強為120、160、200、240μmol/(m2·s)時, 盤狀體增長較快, 取培養(yǎng) 34天盤狀體直徑計算相對生長速率, 分別為光強120μmol/(m2·s)下的 4.56%、160μmol/(m2·s)下的 5.54%、200μmol/(m2·s)下 的 5.48% 和 240μmol/(m2·s)下 的4.71%; 高光強 300μmol/(m2·s)和 400μmol/(m2·s)下盤狀體增長又受到明顯抑制, 盤狀體萌發(fā)少許, 后期大量死亡, 光強 300μmol/(m2·s)下相對生長速率為3.48%。以上分析表明, 影響盤狀體生長的趨勢為160μmol/(m2·s) = 200μmol/(m2·s) ＞ 240μmol/(m2·s) ＞120μmol/(m2·s) ＞ 80μmol/(m2·s) ＞ 300μmol/(m2·s) ＞400μmol/(m2·s), 四分孢子生長的適宜范圍為 120—240μmol/(m2·s), 最適培養(yǎng)光強為 160—200μmol/(m2·s)。

圖6 光強對培養(yǎng)34天四分孢子發(fā)育的影響Fig.6 Effect of different light intensity on the development of tetraspore cultured for 34 days

2.4 鹽度對孢子早期發(fā)育的影響

不同鹽度條件下對由果孢子發(fā)育成的盤狀體進行直徑測量, 培養(yǎng)初期生長差距不明顯, 培養(yǎng)到后期各個時間點上的生長差距逐漸加大(圖7)。鹽度為15時, 盤狀體的生長受到明顯抑制, 發(fā)育緩慢; 鹽度范圍為 20、25、30、35時, 盤狀體生長較快, 取培養(yǎng)36天的盤狀體計算相對生長速率, 在鹽度 20時為4.10%、鹽度25時為5.04%、鹽度30時為5.53%和鹽度35時為4.69%; 鹽度為40和50時, 盤狀體的生長又受到明顯抑制, 培養(yǎng)到后期出現(xiàn)盤狀體大量死亡的情況。以上分析表明, 在適合盤狀體生長的鹽度范圍內(nèi), 鹽度影響其生長的關(guān)系為 30 ＞ 25 ＞ 35 ＞ 20,鹽度為30時盤狀體生長最好。

鹽度對四分孢子生長影響與果孢子一致。

圖7 鹽度對培養(yǎng)36天果孢子發(fā)育的影響Fig.7 Effect of seawater salinity on the development of carpospores cultured 36 days

2.5 生活史

圖8展示了單條膠黏藻生活史, 根據(jù)生殖發(fā)育可將其分為有性生殖和無性生殖兩個階段。

在有性生殖階段, 雄配子體外皮層細胞分裂生成精子囊母細胞, 經(jīng)有絲分裂生成精子囊, 精子囊多聚集成群, 成熟后釋放精子。雌配子體內(nèi)皮層細胞分化生成了輔助細胞枝叢和果胞枝叢, 均由 3—7個細胞組成, 末端細胞分別為輔助細胞和果胞。游離的精子通過受精絲與果胞內(nèi)卵子結(jié)合形成合子; 受精后,果胞與下位細胞融合產(chǎn)生聯(lián)絡(luò)絲; 合子通過聯(lián)絡(luò)絲進入輔助細胞并與之融合發(fā)育, 隨后產(chǎn)生產(chǎn)孢絲, 該產(chǎn)孢絲向外形成幼果孢子囊, 并不斷成熟為果孢子囊;同時由輔助細胞產(chǎn)生的營養(yǎng)絲與周圍的髓絲混雜, 圍繞產(chǎn)孢絲細胞形成一個絲狀囊果被, 并與果孢子囊一起形成近球形的果孢子體(囊果), 果孢子體頂端具小囊孔, 寄生于雌配子體中, 成熟后的果孢子體通過小囊孔釋放二倍體的果孢子。果孢子發(fā)育成盤狀體后繼續(xù)生長至萌發(fā)出直立枝, 直立枝生長成四分孢子體。

在無性生殖階段, 四分孢子體成熟后分化出四分孢子囊, 側(cè)生于內(nèi)皮層細胞, 四分孢子囊聚集成群,囊內(nèi)的原生質(zhì)體經(jīng)減數(shù)分裂形成 4個單倍體的孢子,為四分孢子。四分孢子外形相同, 但有性別分化, 成熟后即脫離母體, 其萌發(fā)與果孢子相類似, 分別萌發(fā)成雄配子體或雌配子體。

由上述結(jié)果可知, 單條膠黏藻的生活史是由單倍的雌、雄配子體和二倍的果孢子體及四分孢子體構(gòu)成, 配子體和四分孢子體外形一致, 交替出現(xiàn), 屬于典型的同型世代交替。

圖8 單條膠黏藻的生活史Fig.8 The life history of D. simplex

3 討論

我們觀察到單條膠黏藻果孢子和四分孢子的發(fā)生類型均為直接盤狀體型, 即孢子發(fā)育成盤狀體的過程中無任何形式的絲狀體出現(xiàn)。在培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn), 盤狀體直徑范圍220—320μm時萌發(fā)出直立枝, 之前有報道, 舌狀蜈蚣藻[Grateloupia livida (Harv.) Yamada]和角叉菜(Chondrus ocellatus Holmes)的盤狀體分別在直徑達到250—300μm和200—320μm時萌發(fā)出直立芽體(陳偉洲等, 2013; Li et al, 2010), 由此可見,不同紅藻的盤狀體萌發(fā)出直立芽體時的直徑各不相同。另外, 我們還發(fā)現(xiàn), 兩個或多個孢子能聯(lián)合成一個超級盤狀體(圖 9), 這種早期發(fā)生的盤狀體自融合現(xiàn)象, 在其他紅藻中均有報道(Ordu?a-Rojas et al,1999; Li et al, 2010; Zhao et al, 2010)。我們認為, 融合后的盤狀體面積增大, 可增加其固著能力, 這與該紅藻在潮間帶棲息適應(yīng)能力有關(guān)。因為大面積固著可以增加其抗海流的影響, 增加直立枝產(chǎn)生及成苗形成, 因此, 盤狀體的融合對單條膠黏藻孢子早期發(fā)育有重要的作用。

圖9 超級盤狀體Fig.9 Coalescence with different spores

溫度是影響紅藻生長發(fā)育的主要因子之一, 許多研究結(jié)果都證明了這一點(Rietema, 1982; 湯曉榮等, 1997)。對單條膠黏藻果孢子和四分孢子進行培養(yǎng)觀察, 發(fā)現(xiàn)其生長最適溫度略有不同, 其中四分孢子對溫度的耐受性更強, 但孢子在溫度范圍9—12°C時的發(fā)育效果均優(yōu)于其他條件, 這表明孢子適合生長于低溫條件, 但溫度太低(6°C以下)則不利于其生長。這與其他紅藻孢子發(fā)育有差異, 如舌狀蜈蚣藻[G.livida (Harv.) Yamada]和帶形蜈蚣藻(G. turuturu Yamada)孢子最適發(fā)育溫度分別為 25—30°C和 25°C(陳偉洲等, 2013; Wei et al, 2013), 亞洲蜈蚣藻(G.asiatica Kawaguchi et Wang)和細弱蜈蚣藻(G. tenuis Wang et Luan)孢子最適發(fā)育溫度為 20°C 和 24°C(Adharini et al, 2014; 曹翠翠等, 2015), 而與同屬的D. contorta (S. G. Gmelin) Ruprecht最為接近(最適培養(yǎng)溫度為12°C)(Rietema et al, 1982)。自然環(huán)境中, 單條膠黏藻生長在冬季和春季, 初春季節(jié)大連附近黃渤海海區(qū)的海面溫度在 10°C以下(湯明義等, 1986),這與低溫更適合單條膠黏藻孢子生長結(jié)果相符。

實驗室條件下, 四分孢子與果孢子相比, 對光強耐受能性更強, 但在 120—200μmol/(m2·s)時, 兩者發(fā)育成的盤狀體均生長較快, 相對生長速率大, 這與D.contorta (S. G. Gmelin) Ruprecht最適培養(yǎng)光強為160μmol/(m2·s)相接近(Rietema, 1982); 當光強高于240μmol/(m2·s)時, 其盤狀體生長緩慢, 這說明高光強明顯抑制盤狀體的生長、發(fā)育。據(jù)報道, 光強也會影響海藻的垂直分布(Satoh et al, 1983; Gevaert et al,2002), 本研究觀察到單條膠黏藻位于低潮帶和潮下帶緣區(qū), 暴露在強光照下時間較短, 故推測單條膠黏藻的飽和光強很弱, 這與其生長在冬季、春季的時間相吻合。因為春季光強明顯弱于夏季, 初春到夏末海面光強升高很多, 期間單條膠黏藻生活在低潮帶和潮下帶緣的石沼中和巖石上, 隨著潮汐漲落會暴露在陽光下, 過高光強會抑制其生長。

鹽度是影響海藻生長的重要環(huán)境因子(丁蘭平等,2013; Guo et al, 2015; 朱曉文等, 2015)。一般來講,單條膠黏藻孢子生長鹽度范圍為 20—35, 高鹽和低鹽均能抑制其正常生長、發(fā)育。另外, 鹽度不僅影響海藻的生物量, 還能影響其垂直分布(Fong et al,1996; Iwamoto et al, 2003), 單條膠黏藻生長于低潮帶的石沼中, 暴露在空氣中的時間較短, 因海水蒸發(fā)或降水引發(fā)鹽度變化不太大, 我們檢測到暴露在潮間帶石沼中的海水鹽度為 33, 這與本研究設(shè)置的鹽度 35較接近, 因此, 單條膠黏藻孢子適宜生長在20—35的鹽度范圍內(nèi)。

我們通過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn), 單條膠黏藻四分孢子和果孢子外形相同, 但最適培養(yǎng)條件下, 四分孢子從孢子附著到萌發(fā)出直立枝所用時間比果孢子平均短了 4天, 故推測, 這與四分孢子和果孢子最適培養(yǎng)條件存在差異有關(guān)。另外, 從培養(yǎng)孢子所需時間來看, 其生活史的完成約需要半年, 對生長在潮間帶成熟藻體的季節(jié)性變化調(diào)查時發(fā)現(xiàn)其冬季出現(xiàn)、6月份解體,與實驗室條件得出的結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

(1) 單條膠黏藻孢子(果孢子和四分孢子)的發(fā)育過程中無絲狀體出現(xiàn), 發(fā)育類型為直接盤狀體型。

(2) 溫度、光強和鹽度對孢子(果孢子和四分孢子)的早期發(fā)育均有影響。其中果孢子發(fā)育最適條件為溫度 9°C、光強 160μmol/(m2·s)和鹽度 30, 四分孢子發(fā)育最適條件為溫度 9—12°C、光強 160—200μmol/(m2·s)和鹽度 30, 四分孢子與果孢子相比, 對溫度和光強的耐受性強, 對鹽度的耐受性相同。

(3) 單條膠黏藻的生活史由單倍的雌、雄配子體和二倍的果孢子體及四分孢子體構(gòu)成, 配子體和四分孢子體外形一致, 交替出現(xiàn), 屬于典型的同型世代交替。

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