印度-太平洋石鱸亞科魚類DNA條形碼及分子系統(tǒng)進(jìn)化研究*

梁日深 吳麗鈺 蘇國茂 程 碩 周 萌 吳灶和

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510225)

石鱸亞科(Haemulinae)隸屬鱸形目Perciformes、仿石鱸科 Haemulidae, 主要分布于印度-太平洋亞熱帶及熱帶海區(qū), 少數(shù)分布于東大西洋, 是重要的海洋經(jīng)濟(jì)食用及觀賞性魚類。世界上石鱸亞科約15屬90余種, 中國僅記錄石鱸屬 1屬 3—6種(Mckay, 1984;成慶泰等, 1987; 沈世杰, 1993; 黃宗國, 1994; 孟慶聞等, 1995; Carpenter et al, 2001), 主要分布在南海。

形態(tài)上, 石鱸亞科魚類近緣物種異常相似, 鑒定存在難度, 故許多物種分類命名一直懸而未決, 大多數(shù)種類但僅憑外部的可辨析成分難以有效區(qū)分, 需要輔以內(nèi)部解剖分析才能最終確定, 這給石鱸亞科物種快速鑒定造成了很大的不便, 同時還會破壞標(biāo)本的完整性。目前形態(tài)分類資料上, 石鱸亞科不少物種出現(xiàn)誤鑒, 分類命名相互混淆, 許多種類的物種有效性與同種異名爭議長期存在分歧。如國內(nèi)絕大部分資料利用P. hasta表示斷斑石鱸, P. kaakan表示點石鱸(成慶泰等, 1987; 孟慶聞等, 1995), 而國外資料卻認(rèn)為P. hasta是P. kaakan的同種異名, P. kaakan是斷斑石鱸的有效種名, 點石鱸學(xué)名為 P. argenteus(Mckay, 1984; Carpenter et al, 2001; Froese et al, 2013;FAO-FIES, 2014), 但P. argenteus在其它資料中卻又表示另外一個種類——銀石鱸(沈世杰, 1993); 又如:部分資料認(rèn)為細(xì)紋石鱸(Pomadasys perotaei)與佩氏石鱸(Pomadasys peroteti)是獨(dú)立的物種(Mckay, 1984;Randall, 2005), 另有資料卻認(rèn)為它們是同種異名(Froese et al, 2013; FAO-FIES, 2014)而有關(guān)石鱸亞科分子分類學(xué)方面的研究報道較少, 大部分研究是在石鱸科魚類系統(tǒng)發(fā)育分析中涉及相關(guān)石鱸亞科的魚類(朱世華等, 2006; 任崗等, 2007; Sanciangco et al,2011; Tavera et al, 2012), 而利用DNA條形碼技術(shù)(DNA barcode)對石鱸亞科魚類進(jìn)行物種聚類及分子鑒定的研究至今仍未見報道。

DNA條形碼是通過一個標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列分析進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)(Hebert, 2003a, b)。在魚類上, 該標(biāo)準(zhǔn)基因是線粒體細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I(COⅠ)基因5端一段長度為648bp的片段, 它能夠在分子水平上成功區(qū)分物種, 為生物的分類提供一種快速簡便、可信可靠的分類方法(Hubert et al, 2008)。目前, DNA條形碼技術(shù)在魚類分子分類與鑒定上已得到了廣泛的應(yīng)用, 彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)分類鑒定的局限性, 有效解決魚類形態(tài)分類上許多爭議問題(Schlei et al, 2008; Pereira et al, 2013; 毛云濤等, 2014; 宋超等,2014)。如Pereira等(2013)利用COⅠ條形碼序列對新熱帶區(qū)的254種淡水魚類進(jìn)行分子鑒定, 其中252種魚類能被清晰區(qū)分, 并確定 23個隱存種; 宋超等(2014)基因 COⅠ序列對長江口舌鰨科魚類的遺傳差異進(jìn)行分析, 有效澄清了短吻三線舌鰨與紫斑舌鰨,長吻紅舌鰨與短吻紅舌鰨等同種異名的爭議。

本研究在形態(tài)學(xué)分類鑒定的基礎(chǔ)上, 對 29種石鱸亞科線粒體 COⅠ基因進(jìn)行序分析, 構(gòu)建石鱸亞科魚類分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系, 探討 DNA條形碼在石鱸亞科魚類物種分子鑒定中的適用性及完善其檢索系統(tǒng)的可行性, 為石鱸亞科物種有效鑒定, 解決物種分類問題, 保護(hù)種質(zhì)資源提供分子水平的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗樣品采集于世界各地, 其中國內(nèi)石鱸屬樣品主要在南海采集, 世界其它地區(qū)的樣品由國外多個科研單位提供: 南非水生物多樣性研究院(South African Institute for Aquatic Biodiversity, SAIAB), 美國堪薩斯大學(xué)生物多樣性研究中心(Biodiversity Institute, University of Kansas); 南太平洋島國新喀里多尼亞努美阿瀉湖水族館(Noumea Aquarium des Lagons)。最后共采集石鱸亞科樣品材料29種 91個個體, 歸類于7個屬。標(biāo)本種類與來源見圖1及表1。同時GenBank下載藍(lán)頰石鱸 Pomadasys argyreus、切齒石鱸 Pomadasys incisus、巴拿石鱸 Pomadasys panamensis、紅鋸鰓石鱸Orthopristis rubber的COⅠ序列統(tǒng)一進(jìn)行分析。

圖1 實驗樣品采集地理分布圖Fig.1 Geographic distribution of experimental samples

表1 實驗材料的種類和采集地Tab.1 Species and collections of experimental samples

1.2 總基因組DNA的提取

基因組 DNA提取采用常規(guī)提取方法, 蛋白酶 K 55°C消化3—4h, 酚-氯仿抽提, 提取的DNA于50μL滅菌水中溶解, 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質(zhì)量,–20°C保存并用于下游實驗。

1.3 PCR擴(kuò)增及序列測定

PCR擴(kuò)增的目的片段為COⅠ 5’端長度為651bp的序列。擴(kuò)增引物為DNA 條形碼通用引物, 由上海英駿公司合成, 序列為: COⅠ-F1: 5- TCA ACY AAT CAY AAA GAT ATY GGC AC -3, COⅠ-R1: 5- ACT TCY GGG TGR CCR AAR AAT CA -3(Ward et al,2005)。PCR反應(yīng)體系為 50μL, 其中 10×PCR緩沖液(含 Mg2+)5μL, dNTPs (各 2.5mmol/L) 2μL, 上游與下游引物各 1μL, 2μLDNA 聚合酶(1U/μL), ddH2O 37μL。PCR 反應(yīng)擴(kuò)增程序為: 94°C 預(yù)變性 5min, 94°C變性30s, 54°C退火30s, 72°C延伸1min, 33個循環(huán),最后72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測, 特異片段純化后送到上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所獲序列利用 BioEdit生物軟件分析測序結(jié)果,并于 NCBI上利用 Blast進(jìn)行序列相似性檢索, 驗證序列的準(zhǔn)確性。與 GenBank下載的序列一起利用Clustal W (Thompson et al, 1994)進(jìn)行序列比對, 同時輔以手工校正, 僅保留一致性序列區(qū)域。利用MEGA5.0 (Tamura et al, 2011)計算序列的堿基組成、變異位點、簡約信息位點數(shù)、轉(zhuǎn)換顛換頻率, 基于Kimura-2-parameter模型計算各物種種內(nèi)、種間的遺傳距離。分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建利用最大似然法(Maximum likelihood, ML)和最大簡約法(Maximum parsimony, MP)。最大似然樹在PHYML v2.4.4軟件中完成, 最大簡約法在 PAUP Version 4.0b 10(Swofford, 2003)軟件包中完成, 使用啟發(fā)式搜尋, 樹二等分再連接 tree-bisection-reconnection (TBR)參數(shù)構(gòu)樹, 所有數(shù)據(jù)未加權(quán)。系統(tǒng)進(jìn)化樹各分支的支持率采用1000次重復(fù)抽樣分析(Bootstrap analysis)進(jìn)行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

試驗測得29種石鱸亞科COⅠ序列為651bp片段序列, 編碼272個氨基酸, 序列中無堿基的插入、缺失。與GenBank下載的序列一起分析計算可知: 除去外類群, 序列中 A、T、G、C堿基平均含量分別為21.9%、27.5%、19.7%、30.9%, 其中A+T含量(49.4%)略低于G+C含量(50.6%)。在651bp COⅠ基因編碼序列中, 密碼子第1位四種堿基含量差異不大, 相對最高的是G-1(31.7%); 密碼子第2位中, T-2含量(41.0%)最高, 并明顯高于其它三種堿基; 密碼子第 3位中C-3含量最高(36.9%), G-3含量最低(12.2%), 表現(xiàn)出明顯的反G偏倚(圖2)。在G+C含量中, 密碼子第1位點 G+C含量(59.0%)高于第 2和第 3位(43.8%,49.1%)。此外, 在長度為651bp序列中, 除去外類群,保守位點417個(64.1%), 變異位點234(35.9%), 簡約性信息位點224(34.4%)。石鱸屬各物種兩兩之間變異位點數(shù)為 14—130, 其中黃鰭石鱸與切齒石鱸之間變異位點數(shù)最少, 而黃鰭石鱸與其它石鱸屬種類變異位點數(shù)均較高(106—130, 大多超過 113), 甚至超過了其與石鱸亞科其它屬魚類的變異位點數(shù), 如與仿石鱸屬(104—118), 異孔石鱸屬(107—111), 八帶石鱸屬(107—111)等。此外, 佩氏石鱸(109—127), 切齒石鱸(100—127)也存在屬內(nèi)種間變異位點數(shù)超過屬間變異位點數(shù)的現(xiàn)象。

圖2 COⅠ基因第一、二、三位密碼子堿基組成Fig.2 The base composition of the 1st, 2nd, and 3rd codon of COⅠ gene

基于 Kimura-2-parameter模型計算出 COⅠ序列中轉(zhuǎn)換與顛換之比值為2.50 , 轉(zhuǎn)換大于顛換, 序列位點沒有突變飽和, 可直接用于分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建分析。在所有位點中, 不變位點有549個, 轉(zhuǎn)換位點68個, 顛換位點34個。其中不變位點數(shù)在密碼子第2位中最多, 為217個; 而轉(zhuǎn)換位點和顛換位點均屬密碼子第 3位最多, 分別為 63個和 34個(表 2)。堿基替換中轉(zhuǎn)換形式以 T-C轉(zhuǎn)換為主, 顛換形式A-T、A-C的顛換多于G-T、G-C(表2)。

表2 COⅠ片段堿基轉(zhuǎn)換和顛換數(shù)Tab.2 Numbers of transition and transversion of COⅠsequences

2.2 種間及種內(nèi)的遺傳距離

基于Kimura 2-parameter模型計算29種石鱸亞科魚類COⅠ基因序列種內(nèi)與種間遺傳距離如表3所示,在所有石鱸亞科魚類中, 種內(nèi)遺傳距離為 0.000—0.009, 平均值為0.004, 顯著低于Hebert等(2003a, b)所提出的 0.020(2%)作為物種鑒定最小種間遺傳距離。29種魚類種間遺傳距離范圍在0.021— 0.240之間, 平均值為 0.184, 98%以上遺傳距離大于 0.100,90%以上大于 0.150, 其中最大種間遺傳距離為腋斑小仿石鱸與普氏仿石鱸(0.240); 最小種間遺傳距離為黃鰭石鱸與切齒石鱸(0.021), 均大于 Hebert等(2003a, b)設(shè)定的2%(0.020)的遺傳差異。石鱸屬屬內(nèi)種間遺傳距離為 0.086—0.238, 平均遺傳距離 0.189,石鱸屬與石鱸亞科其它屬的遺傳距離范圍是: 仿石鱸屬(0.156—0.229), 異孔石鱸屬(0.151—0.212), 八帶石鱸(0.140—0.205), 小仿石鱸屬(0.142—0.234),鋸鰓石鱸屬(0.156—0.219), 比較分析可知, 石鱸屬部分種類屬內(nèi)種間遺傳距離甚至超出了其與石鱸亞科其它屬之間的屬間遺傳距離: 如黃鰭石鱸(0.186—0.237), 佩氏石鱸(0.194—0.231), 側(cè)扁石鱸(0.184—0.229)等, 其與石鱸屬其它種類遺傳距離數(shù)據(jù)大多在0.200以上, 顯示石鱸屬內(nèi)部部分種類在分子遺傳水平上已呈現(xiàn)出較大的分化。

2.3 石鱸亞科科魚類分類及分子系統(tǒng)樹

基于所得的 COⅠ序列, 以胡椒鯛亞科的種類作為外類群, 采用ML法和MP法, 構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹, 兩種方法構(gòu)建的進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大致相同(圖3)。樹上各節(jié)點上的數(shù)值分別為 Bootstrap統(tǒng)計分析后對該分支 ML/MP的支持率。進(jìn)化樹上, 石鱸亞科同一物種不同個體均能聚成一支, 形成物種內(nèi)的單系。不同物種之間, 石鱸亞科7個屬的種類大致形成8個分支, 其中石鱸屬魚類未能形成一個嚴(yán)格的單系, 在進(jìn)化樹上分成了5個小分支, 除了分支IV由6種石鱸聚成的石鱸屬一個主要類群外, 其它石鱸屬種類都分散在進(jìn)化樹其它位置, 與石鱸亞科其它屬的種類相聚。其中, 側(cè)扁石鱸與小仿石鱸屬種類聚在一起,巴拿石鱸、縱帶石鱸與鋸鰓石鱸聚在一起, 不過支持率相對較低, 大棘石鱸與紅海石鱸單獨(dú)形成一支, 佩氏石鱸, 黃鰭石鱸, 切齒石鱸聚在一起, 單獨(dú)形成一支, 位于整個石鱸亞科類群進(jìn)化樹的基部。

3 討論

3.1 DNA條形碼在石鱸亞科魚類物種鑒定中的適用性

自Hebert等(2003a, 2003b)提出以COⅠ基因作為DNA條形碼以來, 該基因在不同生物類群中應(yīng)用的有效性得到了越來越多的驗證(Johnsonet al, 2008;Schleiet al, 2008; Keskinet al, 2013; Keskinet al,2013; 毛云濤等, 2014)。Hebert等(2003a)對 11個門13320個物種的COⅠ基因序列進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)COⅠ序列間的差異能夠很好的區(qū)分所研究的物種, 物種內(nèi)的COⅠ遺傳距離很少有大于2%, 大部分小于1%。Hebert等(2003a, b)提出, 物種種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離是COⅠ序列能夠進(jìn)行物種有效鑒別的關(guān)鍵條件, 并且兩者距離差異大約為 10倍。本研究分析了29種石鱸亞科魚類91個個體的COⅠ序列, 其種內(nèi)遺傳距離平均值為 0.004, 種間遺傳距離平均值為0.184, 種間遺傳距離是種內(nèi)的46倍。此外, 石鱸亞科魚類種內(nèi)遺傳距離范圍為 0.000—0.009, 顯著低于Hebert等(2003a)所推薦的0.200(2%)作為物種鑒定最小種間遺傳距離; 而種間遺傳距離范圍為 0.021—0.240, 均大于 Hebert設(shè)定的 2%的遺傳差異?？芍?在石鱸亞科魚類物種鑒定研究中, COⅠ基因序列可對石鱸亞科魚類進(jìn)行有效的物種DNA鑒定。

圖3 基于COⅠ序列的最大似然法與最大簡約法構(gòu)建的29種石鱸亞科魚類分子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Molecular phylogenetic trees of 29 Haemulinae fish in COⅠsequence constructed by maximum likelihood and maximum parsimony method

3.2 基于 DNA條形碼序列石鱸亞科魚類分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

DNA條形碼基因 COⅠ序列分析主要用于生物分類系統(tǒng)的分子鑒定, 而許多研究也表明 COⅠ在系統(tǒng)進(jìn)化分析上也能提供豐富的進(jìn)化信息。本研究基于COⅠ序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹, 石鱸亞科同種魚類不同個體均可聚為同一分支, 形成嚴(yán)格的單系。在屬內(nèi)種間分類關(guān)系中, 大部分同屬的物種均能聚在一起,形成屬級階元的分支, 但也有個別類群無法形成單系, 如石鱸屬, 所研究的石鱸屬魚類在進(jìn)化樹上形成多個分散的獨(dú)立分支, 無法構(gòu)成單系。但該結(jié)果與近幾年的研究報道一致, 如 Sanciangco等(2011)與Tavera等(2012)基于多個分子標(biāo)記對東太平洋及周邊水域的石鱸科魚類的分類研究就揭示石鱸屬是非單系群。在Sanciangco等(2011)研究中, 10種石鱸屬魚類主要分成三個獨(dú)立的分支(I: 東大西洋, II: 印度-西太平洋, III: 美洲海區(qū)), 不同分支上的石鱸屬魚類與所在的地理分布存在一定的聯(lián)系。Tavera等(2012)認(rèn)為棲息地與地理隔離協(xié)同影響著石鱸屬魚類的多樣性, 其研究中分布美洲石鱸屬魚類與美洲石鱸亞科的物種聚在一起, 相同的棲息地與分布環(huán)境影響著石鱸屬魚類的遺傳分化。本研究中14種石鱸屬魚類共形成5個分支, 其中類群 V的三種石鱸(佩氏石鱸+黃鰭石鱸+切齒石鱸)分類地位較低, 位于石鱸亞科類群基部, 除了佩氏石鱸外, 另外兩種石鱸均分布在東大西洋。類群IV形成一個石鱸屬較大的分支, 其包括的 6種石鱸主要分布在印度-西太平洋。其它石鱸均與分布于東太平洋(新大陸)的石鱸亞科其它屬的種類聚一起, 大棘石鱸與異孔石鱸屬+仿石鱸屬+八帶石鱸, 側(cè)扁石鱸與小仿石鱸屬, 巴拿石鱸、縱帶石鱸與鋸鰓石鱸屬, 除了縱帶石鱸外, 其它三種石鱸均分布于東太平洋。

除了石鱸屬魚類初步揭示并非單系群外, 仿石鱸屬(Haemulon)與小仿石鱸屬(Haemulopsis)在進(jìn)化樹上同樣顯示為非單系群。在仿石鱸屬的分支中包含了異石鱸屬(北美異石鱸 X. californiensis), 小仿石鱸屬分支中包含了石鱸屬(側(cè)扁石鱸 P. corvinaeformis)的種類。對于北美異石鱸, Jordan等(1882)曾采用多個形態(tài)學(xué)與解剖學(xué)的數(shù)據(jù)將其與仿石鱸屬的種類進(jìn)行比較分析, 發(fā)現(xiàn)其與仿石鱸屬的種類具有許多相似的形態(tài)學(xué)特征, Sanciangco等(2011)利用多個分子標(biāo)記構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹也驗證了北美異石鱸位于仿石鱸屬類群內(nèi)部, 認(rèn)為北美異石鱸應(yīng)該歸為仿石鱸屬, 學(xué)名改為Haemulon californiensis。對于側(cè)扁石鱸 P. commersonnii,前人有研究認(rèn)為它應(yīng)該歸為小仿石鱸屬(Haemulopsis)(López, 1981), Tavera等(2012)在北美石鱸亞科魚類系統(tǒng)發(fā)育研究中也揭示, 在分子水平上, 側(cè)扁石鱸 P.corvinaeformis位于小仿石鱸屬(Haemulopsis)內(nèi)部, 學(xué)名改為: Haemulopsis corvinaeformis。本研究的結(jié)果也支持這上述兩種魚類分類的觀點。

4 結(jié)論

本研究利用 DNA條形碼基因 COⅠ序列分析了印度-太平洋海區(qū)石鱸亞科7個屬29種魚類分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系, 并探討 COⅠ序列在石鱸亞科魚類物種分子鑒定的有效性。結(jié)果顯示COⅠ序列在不同石鱸亞科魚類之間差異均大于 2%, 能有效區(qū)分不同物種,可作為石鱸亞科物種有效鑒定的條形碼基因。而基于COⅠ序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹, 石鱸亞科中歸為同一屬的物種并沒有構(gòu)成嚴(yán)格的單系群, 但其分類關(guān)系與其各自的地理分布有一定的相關(guān)性。由于全球性分布的石鱸亞科魚類數(shù)量眾多, 且不同地理分布的物種可能出現(xiàn)了較大的遺傳分化, COⅠ序列長度僅為650 bp左右, 能提供的系統(tǒng)發(fā)育信息有限。故要澄清石鱸屬以及石鱸亞科各種屬直接的分類進(jìn)化關(guān)系, 需要更廣泛采集石鱸亞科各種屬的代表性樣品,結(jié)合多個分子標(biāo)記的序列的分析才得以有效解決。

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