牛支原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

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牛支原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

劉威1，袁芳艷1，周丹娜1，劉澤文1，楊克禮1，段正贏1，郭銳1，肖少波2，田永祥1*

(1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎與分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064)

摘要：病原菌的相互作用組學(xué)研究是揭示潛在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和新型藥物靶標(biāo)的有力工具。通過同源蛋白映射的方法構(gòu)建了牛支原體的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，所構(gòu)建的互作網(wǎng)絡(luò)包含138個(gè)蛋白和693個(gè)相互作用關(guān)系。通過蛋白的互作頻率分析，確定了在牛支原體中互作頻率最高的20個(gè)蛋白，這些蛋白主要與轉(zhuǎn)錄、翻譯、分子伴侶等功能相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，伴侶蛋白DnaK和ClpB發(fā)生互作的頻率較高，能與核糖體蛋白、代謝相關(guān)蛋白等多種功能蛋白發(fā)生相互作用。結(jié)果提示，若DnaK和ClpB的功能受到抑制，將會(huì)對(duì)牛支原體的正常生命活動(dòng)造成較大的影響。

關(guān)鍵詞：牛支原體；蛋白相互作用；互作網(wǎng)絡(luò)

牛支原體(Mycoplasmabovis)是感染牛的一種重要的致病性病原體，可導(dǎo)致牛肺炎、耳炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜炎、流產(chǎn)或不孕等多種疾病[1-2]。該病在世界范圍內(nèi)廣泛存在，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，歐洲每年約25%～33%的犢牛肺炎是由牛支原體引起，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1.44億～1.92億歐元，其中英國每年約190萬頭?；贾гw肺炎；美國每年因牛支原體感染造成的經(jīng)濟(jì)損失約1.40億美元[4]。2008年，在中國湖北省首次發(fā)現(xiàn)了疑似牛肺疫的呼吸道疾病，發(fā)病2 476頭(發(fā)病率高達(dá)50%～100%)，死亡610頭，隨后貴州省和寧夏回族自治區(qū)也報(bào)道了類似病例[5]。通過檢測(cè)核酸，發(fā)現(xiàn)此呼吸道疾病并非牛肺疫復(fù)發(fā)，而是一種我國從未出現(xiàn)過的新發(fā)支原體傳染病[6]。目前，已有內(nèi)蒙古、廣西、天津、重慶、四川、河南等10多個(gè)省市自治區(qū)報(bào)道了類似疫情，牛支原體已經(jīng)成為威脅我國養(yǎng)牛業(yè)的重要病原[7]。

牛支原體感染后的臨床癥狀與牛肺疫類似，感染初期癥狀不明顯，待出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，病情已十分嚴(yán)重。感染初期，病牛體溫升高至39℃～40℃，食欲不振，精神沉郁，呼吸急促，干咳，有黏液性或化膿性鼻分泌物[8]。隨著病情加劇，體溫繼續(xù)升高至40℃～41℃，采食量急劇下降，清晨和采食后咳嗽明顯，使用抗生素治療后病情略有好轉(zhuǎn)，但病情反復(fù)，隨后病畜開始死亡，大部分病牛剖檢后肺部可觀察到明顯的粘連[9]。目前世界上僅有兩家美國公司的牛支原體疫苗獲得美國農(nóng)業(yè)部授權(quán)，但是并沒有充足的數(shù)據(jù)證實(shí)疫苗保護(hù)的有效性[10]。一方面，牛支原體的抗體水平與保護(hù)率并不一致，即使抗體在機(jī)體中處于較高水平，但是長途運(yùn)輸和飼養(yǎng)環(huán)境變化，依然可以誘發(fā)牛支原體肺炎的暴發(fā)。另一方面，牛支原體菌株表面存在一個(gè)由13個(gè)基因組成的Vsp家族，Vsp蛋白容易發(fā)生漂移，繼而引起抗原表位的變化，這也是疫苗保護(hù)效果并不理想的又一個(gè)重要原因[11]。在藥物治療方面，支原體由于缺乏細(xì)胞壁，對(duì)常用的作用于細(xì)胞壁的抗生素不敏感。一些牛支原體敏感的藥物，如四環(huán)素類、喹諾酮類藥物，因?yàn)樵陴B(yǎng)殖生產(chǎn)中的大量使用甚至濫用，催生出了許多耐藥菌株，顯著降低了抗生素的治療效果[12]。利用現(xiàn)代生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)尋找牛支原體新的藥物靶標(biāo)，將為牛支原體病的防控奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為新型藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1基因組序列與數(shù)據(jù)庫牛支原體Hubei-1的全基因組序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫，氨基酸序列通過Artemis導(dǎo)出。直系同源分析時(shí)涉及到的數(shù)據(jù)來源于Database of Interaction Protein(DIP)數(shù)據(jù)庫(數(shù)據(jù)更新至20150101)。

1.2方法

1.2.1同源蛋白映射DIP數(shù)據(jù)庫中蛋白與蛋白間的互作關(guān)系已經(jīng)通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等試驗(yàn)驗(yàn)證確定。同源蛋白映射(HPM)是通過整合試驗(yàn)中已確定的蛋白-蛋白相互作用信息，來預(yù)測(cè)未知蛋白間的互作網(wǎng)絡(luò)[13]。圖1展示了同源蛋白映射的原理。如DIP數(shù)據(jù)庫中C與D能發(fā)生互作，而蛋白A與C同源，B與D同源，那么A和B極可能發(fā)生相互作用。基于此通過HPM構(gòu)筑蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建DIP數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列從DIP網(wǎng)站上下載獲得(20150101)。Blast軟件包和牛支原體的基因組序列從NCBI FTP服務(wù)器下載。利用Formatdb將牛支原體的氨基酸序列建庫，DIP數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列與牛支原體氨基酸序列的同源性通過Blastp確定(E-value 1e-30)(表1)。Blastp得到的初步比對(duì)結(jié)果通過本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的script程序映射成互作網(wǎng)絡(luò)，以獲得最終的牛支原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)通過可視化軟件Cytoscape[14]展示。

2結(jié)果

2.1牛支原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

牛支原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)通過同源蛋白映射的方法構(gòu)建完成(圖1)。預(yù)測(cè)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中包含138個(gè)蛋白和693個(gè)相互作用關(guān)系，蛋白用圓形的節(jié)點(diǎn)表示，相互作用關(guān)系用直線表示。

圖1　同源蛋白映射方法的原理

程序/數(shù)據(jù)庫名稱Software/database主要用途Mainuses網(wǎng)絡(luò)資源NetworkresourceArtemis基因組可視化Visualizationofgenomehttp://www.sanger.ac.uk/resources/software/artemis/Blastp同源比對(duì)Sequencehomologyanalysishttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Cytoscape可視化分析Visualizationanalysiswww.cytoscape.org/COG蛋白質(zhì)功能分類Classificationofproteinfunctionhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/COGDIP蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫DatabaseofInteractingProteinhttp://dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/Main.cgiPerlPerl語言Perllanguagehttp://www.perl.org/

2.2蛋白相互作用發(fā)生頻率的分析

在蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，互作頻率表示某單一蛋白與其他蛋白發(fā)生相互作用的數(shù)量?；プ黝l率較高的蛋白往往參與細(xì)胞的多種生命活動(dòng)，在細(xì)胞的生存中起著十分關(guān)鍵的作用。表2列出了互作頻率最高的20個(gè)蛋白，在這20個(gè)蛋白中，大多數(shù)蛋白與轉(zhuǎn)錄、翻譯、分子伴侶等功能相關(guān)。MMB0149和 MMB0664分別編碼伴侶蛋白DnaK和ClpB，這兩個(gè)蛋白的互作頻率較高，且都能與核酸代謝蛋白(如MMB0047等)、運(yùn)輸相關(guān)蛋白(如SecA等)、DNA復(fù)制與修復(fù)相關(guān)蛋白(如MMB0242，MMB0606等)、氨基酸合成相關(guān)蛋白(如MMB0192等)發(fā)生相互作用。若DnaK和ClpB的功能受到抑制，將嚴(yán)重影響牛支原體的生存和繁殖，結(jié)果提示DnaK和ClpB可以作為新型藥物的潛在靶標(biāo)。

2.3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中不同功能蛋白的分布

蛋白質(zhì)直系同源簇(COGs)數(shù)據(jù)庫是對(duì)細(xì)菌、藻類和真核生物的21個(gè)完整基因組的編碼蛋白，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分類構(gòu)建而成。COGs庫常用于未知蛋白的功能預(yù)測(cè)和蛋白功能的分類研究中。我們對(duì)牛支原體蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中互作頻率高于10次的蛋白進(jìn)行了功能分布分析，首先將互作頻率高于10次的蛋白根據(jù)蛋白質(zhì)直系同源簇(COGs)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能分類，隨后對(duì)不同COGs功能類別的蛋白個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖3所示：互作頻率較高的功能蛋白主要與核糖體結(jié)構(gòu)、復(fù)制、翻譯、分子伴侶和防御等功能相關(guān)。核糖體是細(xì)胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒，由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其唯一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)器。MMB0182編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，拓?fù)洚悩?gòu)酶是生物體內(nèi)的基礎(chǔ)酶類，參與到所有涉及DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化的生命活動(dòng)中，如DNA的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和重組。細(xì)菌細(xì)胞中，三分之一的蛋白質(zhì)是在合成后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)外才發(fā)揮功能的。其中大多數(shù)蛋白是通過Sec途徑(即分泌途徑secretion pathway)進(jìn)行跨膜運(yùn)動(dòng)的。MMB0288編碼水解ATP的動(dòng)力蛋白SecA，SecA和膜蛋白三聚體SecYEG共同構(gòu)成了Sec轉(zhuǎn)運(yùn)酶的核心。MMB0192編碼磷酸核糖焦磷酸，是一種重要的代謝中間物，參與嘌呤核苷酸與嘧啶核苷酸的從頭合成和補(bǔ)救合成、某些核苷酸類輔酶如輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ、以及某些氨基酸如組氨酸和色氨酸的合成。上述蛋白在維持細(xì)胞正常的生命活動(dòng)中都起著十分關(guān)鍵的作用，若這些蛋白的功能受到抑制將嚴(yán)重影響牛支原體的生存與繁殖。

圖2　 牛支原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

3討論

病原菌互作蛋白組學(xué)分析是解析毒力相關(guān)信號(hào)通路和挖掘潛在藥物靶標(biāo)的重要工具[13]。本研究通過HPM的方法構(gòu)建了牛支原體的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，所構(gòu)建的互作網(wǎng)絡(luò)包括138個(gè)蛋白和693個(gè)相互作用關(guān)系。HPM的方法主要通過計(jì)算蛋白序列的同源性，因此會(huì)造成少數(shù)假陽性的結(jié)果。為了減少假陽性的發(fā)生，我們?cè)跇?gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)時(shí)，通過結(jié)合序列覆蓋率和E-value[15]值綜合評(píng)價(jià)單一蛋白和互作關(guān)系的準(zhǔn)確性，以確定最終的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

在蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，蛋白發(fā)生互作的頻率越高，提示這一蛋白在病原菌的生命活動(dòng)中越重要。在完成了牛支原體蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建后，通過COGs對(duì)互作頻率最高的20個(gè)蛋白進(jìn)行了功能分類。在這20個(gè)蛋白中，大多數(shù)蛋白與轉(zhuǎn)錄、翻譯、分子伴侶等功能相關(guān)。分子伴侶和核糖體蛋白往往在細(xì)胞的生命活動(dòng)中起著關(guān)鍵的作用，如伴侶蛋白能幫助蛋白正確折疊和降解，這對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原菌抵抗宿主細(xì)胞的環(huán)境壓力十分重要。在牛支原體蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，DnaK和ClpB發(fā)生互作的頻率較高，能與核糖體蛋白、代謝相關(guān)蛋白等多種蛋白發(fā)生相互作用。一旦DnaK和ClpB的功能受到抑制，將會(huì)對(duì)牛支原體的正常生命活動(dòng)造成不小的影響。綜上所述，通過HPM的方法構(gòu)建了牛支原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將為新型藥物靶標(biāo)的尋找、新的信號(hào)分子的篩選提供依據(jù)。

表2　相互作用網(wǎng)絡(luò)中互作頻率較高的20個(gè)蛋白

C.能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換；E.氨基酸運(yùn)輸和代謝；F.核酸運(yùn)輸和代謝；G.碳水化合物運(yùn)輸和代謝；H.輔酶代謝；J.翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生；K. 轉(zhuǎn)錄；L. DNA復(fù)制，重組和修復(fù)；O.轉(zhuǎn)譯后的修飾，伴侶蛋白；R.常規(guī)功能；U.細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，分泌和囊膜運(yùn)輸；V.防衛(wèi)機(jī)制

C.Energy production and conversion；E.Amino acid transport and metabolism；F.Nucleotide transport and metabolism；G. Carbohydrate transport and metabolism；H.Coenzyme metabolism；J.Translation, ribosomal structure and biogenesis；K.Transcription；L.DNA replication, recombination and repair；O.Posttranslational modification, protein turnover, chaperones；R.General function prediction only；U.Intracellular trafficking, secretion and vesicular transport；V.Defense mechanisms

圖3 牛支原體蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中不同功能蛋白的分布

Fig.3The COGs distribution in the protein-protein interaction network ofMycoplasmabovis

參考文獻(xiàn):

[1]Morton J,Malmo J,House J,et al.Mycoplasmabovisin Australian dairy herds[J]. Aust Vet J,2014, 92(9)：322-323.

[2]張瑞，崔朋，巴曉亮，等．牛支原體臨床分離株牛體毒力和免疫原性比較[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34(6)：126-132．

[3]Aebi M,van den Borne BH,Raemy A,et al.Mycoplasmabovisinfections in Swiss dairy cattle: a clinical investigation[J]. Acta Vet Scand，2015，57:10. doi: 10.1186/s13028-015-0099-x.

[4]胡長敏，石磊，龔瑞，等. 牛支原體病研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30(8)：73-77.

[5]石磊，龔瑞，尹爭艷，等. 肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的初步診斷[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27(4)：572-572.

[6]辛九慶，李媛，郭丹，等. 國內(nèi)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30(9)：661-664.

[7]伍曉紅，儲(chǔ)岳峰，張軒，等．牛支原體的分離鑒定及16S rRNA基因序列分析[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33(12)：35-37．

[8]冉智光，謝建華，駱璐，等. 我國部分地區(qū)牛支原體肺炎和關(guān)節(jié)炎的病原體診斷[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32(1)：40-43.

[9]Radaelli E,Luini M,Loria G R,et al. Bacteriological, serological, pathological and immunohistochemical studies ofMycoplasmabovisrespiratory infection in veal calves and adult cattle at slaughter[J]. Res Vet Sci,2008,85(2): 282-290.

[10]Mulongo M,Prysliak T,Perez C J,et al. Vaccination of feedlot cattle with extracts and membrane fractions from twoMycoplasmabovisisolates results in strong humoral immune responses but does not protect against an experimental challenge[J]. Vaccine,2013,31: 1406-1412.

[11]Li Y,Zheng H,Liu Y,et al. The complete genome sequence ofMycoplasmabovisstrain Hubei-1[J]. PLoS One,2011,6(6): e20999.doi: 10.1371/Journal.pone.0020999.

[12]Bürki S,Frey J,Pilo P,et al. Virulence, persistence and dissemination ofMycoplasmabovis[J]. Vet Microbiol,2015,pii: S0378-1135(15)00079-6. doi: 10.1016/j.vetmic.

[13]Cui T,Zhang L,Wang X,et al.Uncovering new signaling proteins and potential drug targets through the interactome analysis of Mycobacterium tuberculosis[J]. BMC Genomics,2009,10:118.doi:10.1186/1471-2164-10-118.

[14]Shannon P,Markiel A,Ozier O,et al.Cytoscape:a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J]. Genome Res,2003,13:2498-2504.

[15]Zhaxybayeva O,Gogarten J P.Bootstrap, Bayesian probability and maximum likelihood mapping: exploring new tools for comparative genome analyses[J]. BMC Genomics，2002，3:4.

動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(11):20-24ProgressinVeterinaryMedicine

Construction of the Protein-protein Interaction Network ofMycoplasmabovis

LIU Wei1, YUAN Fang-yan1, ZHOU Dan-na1, LIU Ze-wen1, YANG Ke-li1,

DUAN Zheng-ying1,GUO Rui1, XIAO Shao-bo2, TIAN Yong-xiang1

(1.HubeiProvincialKeyLaboratoryofAnimalEmbryoandMolecularBreedingofAnimalHusbandry

andVeterinaryResearchInstituteofHubeiAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan,Hubei,430064,China;

2.StateKeyLaboratoryofagriculturalmicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430064,China)

Abstract:Analysis of the pathogen interactome is a powerfull approach for dissecting potential signal trasducion and new drug targets. We constructed a comprehensive protein-protein interaction network for Mycoplasma bovis consisting of 138 proteins and 693 interaction pairs. Our analysis unraveled 20 proteins with highest interactions in the network, most of them are related to the function of transcription, translation and molecular chaperone. The MMB0149/ MMB0664 gene and its gene product DnaK/ClpB were analyzed in detail because they showed high interactions with ribosomal and metabolism related proteins. Our analyses indicated that the chaperone DnaK and ClpB may be critical for the survival of Mycoplasma bovis. Collectively, this study therefore provides valuable clues in exploring new signaling protein and new drug targets.

Key words:Mycoplasma bovis; protein interaction; interaction network

文章編號(hào):1007-5038(2014)11-0020-05

中圖分類號(hào):S852.62;S852.653

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡介：劉威(1985-)，男，湖北武漢人，助理研究員，博士，主要從事動(dòng)物傳染病研究。 *

通訊作者

基金項(xiàng)目：湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(2015-620-004-001)

收稿日期：2015-05-12