稻瘟病菌孢子的分離和保存方法

趙沙沙　田永宏　余華強(qiáng)　孫永建　曹國(guó)長(zhǎng)　陳波　房振兵　范兵

摘要：介紹了稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]孢子的分離和保存方法，并加以比較和分析。結(jié)果表明，將發(fā)病組織進(jìn)行保濕培養(yǎng)，產(chǎn)孢后用洗耳球?qū)㈡咦哟档脚囵B(yǎng)基上挑取單一菌落，采用濾紙片法保存，可以很好地分離和保存稻瘟病菌單孢。

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]； 單孢； 分離； 保存

中圖分類號(hào)：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）24-6252-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.040

Abstract： The methods of isolation and preservation of single spore of rice blast fungus were introduced， which were taken into comparison and analysis. The results showed that the diseased tissues were cultured by moisture-retaining， then the spores produced were blown into the plate culture medium to pick a single colony with ear washing bulb and preservated by filter paper method， which could isolate and preservate the single spore of rice blast fungus commendably.

Key words： rice blast fungus[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]； single spore； isolation； preservation

由稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]引起的稻瘟病是世界上水稻三大病害之一，給水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量造成了嚴(yán)重的影響。長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐證明，選育和種植抗稻瘟病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效和安全的措施，符合人類對(duì)綠色食物的要求[1]。選育抗稻瘟病品種需要在田間對(duì)待選材料苗期、分蘗盛期和孕穗初期進(jìn)行人工接種鑒定，選擇出抗病且大田表現(xiàn)較好的水稻材料，其中關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)就是獲取足夠量的接種體——稻瘟病菌分生孢子。這就需要從發(fā)病的水稻標(biāo)樣上分離得到不同稻瘟病菌株的單孢并加以保存。本研究介紹了稻瘟病菌孢子的一些分離和保存方法，并加以比較和分析，為育種工作者分離和保存稻瘟病菌孢子并進(jìn)行接種鑒定提供參考。

1 稻瘟病菌孢子的分離方法

1.1 手工直接挑取孢子的單孢分離法

張君成[2]的單孢分離法是用手工直接挑取孢子，所需材料設(shè)備比較簡(jiǎn)單，但操作難度大，技巧性強(qiáng)。首先在酒精燈上將接種針針尖燒紅，然后用鑷子將針尖彎曲1 cm左右，制成所需要的接種針。用無菌刀片將清水瓊脂（WA）平板切成2 cm×1 cm的瓊脂塊，挑取一塊置于無菌的載玻片上，制成挑孢瓊脂塊。

在超凈工作臺(tái)上，取出穗頸瘟標(biāo)樣，用接種針的彎曲部分輕輕觸碰標(biāo)樣黏附孢子，然后沿挑孢瓊脂塊的對(duì)角線輕輕劃一下，將孢子轉(zhuǎn)移到挑孢瓊脂塊表面。將含有孢子的瓊脂塊放到載物臺(tái)上，尋找分散的單個(gè)孢子，并將其移至視野中央。用接種針輕輕靠碰視野中央的單個(gè)孢子，使孢子黏附到針尖上，然后輕輕抬起針頭，移離顯微鏡。

左手取準(zhǔn)備好的試管斜面培養(yǎng)基，右手將黏有孢子的接種針小心移入試管內(nèi)，在培養(yǎng)基斜面上將針尖快速滑動(dòng)1～4次，即可將孢子釋放到培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)后長(zhǎng)成單孢菌落。

手工直接挑取單孢的方法所需材料設(shè)備簡(jiǎn)單易得，試驗(yàn)過程在一般的場(chǎng)地即可進(jìn)行，并且適用性好，可以分離不同大小和種類的孢子，但是這種方法操作難度比較大，技巧性強(qiáng)，對(duì)操作人員的要求很高，初學(xué)者一般很難掌握。

1.2 連續(xù)變倍體視顯微鏡單孢分離法

張書建等[3]在平板稀釋法和震落法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，總結(jié)出了一種較為簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的單孢分離法。首先對(duì)發(fā)病的組織進(jìn)行保濕培養(yǎng)。取新采集的穗頸瘟標(biāo)樣，浸泡在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次。在一次性培養(yǎng)皿中放入2層吸水紙或1張濾紙，加入少量無菌水，浸濕吸水紙或?yàn)V紙即可。然后把消過毒的穗頸瘟標(biāo)樣放在培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋好后室溫保濕2～3 d，直至標(biāo)樣表面出現(xiàn)深灰色的霉層。

用無菌的鑷子夾起已長(zhǎng)出霉層的發(fā)病組織，在清水瓊脂（WA）平板的上方用力持續(xù)捏洗耳球，產(chǎn)生的氣流就會(huì)帶動(dòng)孢子落在培養(yǎng)基上。此時(shí)，應(yīng)注意標(biāo)樣上不要有水珠，否則容易造成污染。然后適溫培養(yǎng)8～12 h，直至大多數(shù)孢子已萌發(fā)但尚未進(jìn)行分枝。

將連續(xù)變倍體視顯微鏡放在超凈工作臺(tái)上，把帶有孢子的WA平板放在載物臺(tái)上，在視野中尋找剛萌發(fā)尚未進(jìn)行分支的分散的單個(gè)孢子，然后用接種針輕輕挑取一小塊孢子所在位置的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng)基中，且?guī)в墟咦拥囊幻婢o貼培養(yǎng)基表面，適溫培養(yǎng)后得到單孢菌株。

稻瘟病菌的產(chǎn)孢過程屬于營(yíng)養(yǎng)貧瘠型，連續(xù)變倍體視顯微鏡單孢分離法就利用了稻瘟病菌產(chǎn)孢的這一特點(diǎn)。對(duì)發(fā)病的組織先進(jìn)行保濕培養(yǎng)，使其在貧瘠的營(yíng)養(yǎng)條件下產(chǎn)孢，再盡可能地將單個(gè)孢子分離出來，可以顯著提高稻瘟病菌分離孢子的成功率。這種方法用洗耳球直接將孢子從發(fā)病標(biāo)樣吹到平板培養(yǎng)基上，這樣可以方便地進(jìn)行鏡檢分離單孢，并且連續(xù)變倍體視顯微鏡分離孢子時(shí)優(yōu)于普通生物學(xué)顯微鏡，便于操作。該方法的不足之處是發(fā)病標(biāo)樣上可能有其他雜菌，連同孢子一起吹到培養(yǎng)基上，造成污染，并且標(biāo)樣上可能有多個(gè)稻瘟病生理小種，最后獲得的不一定是單孢菌株。

1.3 毛細(xì)管打孔單孢分離法

董娟華等[4]用毛細(xì)管打孔法進(jìn)行單孢分離。將2 g瓊脂粉加入到100 mL無菌水中，滅菌后制成2%水瓊脂。在超凈工作臺(tái)上，用無菌移液槍吸取水瓊脂涂布在無菌載玻片上，制成厚度均勻的水瓊脂片。用無菌接種針黏取發(fā)病標(biāo)樣上的孢子，并將其黏附到水瓊脂片上，然后用滅菌玻璃棒沾取無菌水，稀釋涂布孢子。在顯微鏡下觀察涂有孢子的水瓊脂片，找到分散的單個(gè)孢子后，將其移入視野中央，然后下移載物臺(tái)。取內(nèi)徑為1 mm彎成直角的毛細(xì)管滅菌后，短臂端部對(duì)準(zhǔn)物鏡鏡頭下的光斑中央，在水瓊脂上打取直徑為1 mm的瓊脂餅。然后觀察瓊脂餅上是否有目標(biāo)孢子，如果沒有，則重新選取孢子，直至瓊脂餅上有單個(gè)孢子。

用無菌接種針挑取帶有目標(biāo)孢子的瓊脂餅，轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng)基中，并使帶有孢子的一面緊貼培養(yǎng)基表面，適溫培養(yǎng)后得到純化的單個(gè)菌株。

毛細(xì)管打孔單孢分離法可操作性強(qiáng)，污染少，單孢分離成功率比較高，特別適合強(qiáng)寄生真菌的分離培養(yǎng)。但是操作過程有些復(fù)雜，分離速度較慢，并且所需工具制作繁瑣。

1.4 挑針轉(zhuǎn)移法

邱小燕等[5]通過組織分離、孢子懸浮液涂布和挑針轉(zhuǎn)移等步驟，研究出一種可靠并且適應(yīng)性廣泛的單孢分離技術(shù)。將采集回的穗頸瘟標(biāo)樣，浸泡在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次。用滅菌的鑷子夾起標(biāo)樣，放在滅菌后的濾紙上吸收多余水分，然后置于燕麥片培養(yǎng)基平板上，27 ℃黑暗培養(yǎng)。

培養(yǎng)5～10 d后，取出已經(jīng)充分產(chǎn)孢的稻瘟病菌，在超凈工作臺(tái)上用接種針挑取一小塊布滿菌絲的培養(yǎng)基，放在無菌空試管中，加入4～5 mL無菌水，力度適中地振蕩數(shù)次后制成孢子懸浮液。用玻璃棒蘸取一滴孢子懸浮液涂布在載玻片上，并在顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，將孢子懸浮液的濃度調(diào)節(jié)為40倍視野下一個(gè)孢子。將制備好的孢子懸浮液靜置2～3 min后，直接將試管上半部分的孢子懸浮液倒入WA平板中，然后用滅菌涂布器涂布均勻，并用無菌風(fēng)吹干。封口膜密封后28 ℃培養(yǎng)10 h左右，用于后續(xù)的單孢分離。

用解剖刀將制備好的涂布有孢子懸浮液的WA平板切成1.5 cm×5.0 cm左右的小塊，然后把瓊脂塊放到載玻片上，40倍顯微鏡下調(diào)節(jié)視野，使視野中央只有分散的單個(gè)孢子。然后用解剖刀小心切下視野中央的瓊脂塊，并通過顯微鏡觀察瓊脂塊中只有一個(gè)孢子。最后用接種針挑取帶有單個(gè)孢子的瓊脂塊，轉(zhuǎn)移至試管斜面培養(yǎng)基中，且?guī)в墟咦拥囊幻婢o貼培養(yǎng)基表面，適溫培養(yǎng)后得到純化的單個(gè)菌株。

挑針轉(zhuǎn)移法所需材料設(shè)備簡(jiǎn)單，可以保證所挑單孢的可靠性，并且成功率高，適用性廣，但操作過程相對(duì)而言仍有些繁瑣。

通過對(duì)稻瘟病菌幾種分離單孢方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析，認(rèn)為將發(fā)病組織進(jìn)行保濕培養(yǎng)，產(chǎn)孢后用洗耳球?qū)㈡咦哟档狡桨迮囵B(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)可以很好地分離稻瘟病菌單孢。該方法的不足之處是發(fā)病標(biāo)樣上可能有其他雜菌或者多個(gè)稻瘟病菌生理小種，最后獲得的不一定是單孢菌株。但可以挑取平板培養(yǎng)基上的單一菌落，并分別保存以獲得單一的、純化的稻瘟病菌菌株。

2 稻瘟病菌孢子的保存方法

2.1 干燥低溫保存法

孔秀英[6]用干燥低溫的方法可以短期保存稻瘟病菌的分生孢子。首先將平板培養(yǎng)基上的孢子洗下制成孢子懸浮液，然后用真空泵將孢子收集在濾紙上進(jìn)行干燥，干燥后的帶有孢子的濾紙放入干燥器內(nèi)，-20 ℃冷凍保存。幾個(gè)月后稻瘟病菌的致病性基本沒有變化，可以在平板培養(yǎng)基上活化后使用。干燥低溫保存法可以短期保存稻瘟病菌株，但需要抽真空，略顯復(fù)雜。

2.2 高粱粒保存法

將高粱粒煮至八分熟，用清水沖洗幾遍直至水澄清后，瀝干水裝入錐形瓶中，塞上棉塞，牛皮紙封口，滅菌（至少40 min）后使用。在超凈工作臺(tái)，在試管斜面培養(yǎng)基中挑取一塊長(zhǎng)滿菌絲的培養(yǎng)基放入裝有高粱粒的錐形瓶中，密封后室溫保存。7 d后，部分高粱粒長(zhǎng)有菌絲，將其搖散擴(kuò)大培養(yǎng)。兩周后，所有的高粱粒上即可長(zhǎng)滿菌絲。取一些長(zhǎng)滿菌絲的高粱粒放入小試管中，試管塞封口。大約15 d等高粱粒完全干燥后，-20 ℃冷凍保存。使用時(shí)在培養(yǎng)基上活化即可。高粱粒保存法可以大量地保存稻瘟病菌株，但保存過程復(fù)雜，容易發(fā)生霉變污染，并且保存時(shí)所占體積較大。

2.3 濾紙片保存法

金曉春等[7]用一種簡(jiǎn)單可靠的濾紙片法保存稻瘟病菌分生孢子。將分離得到的稻瘟病菌單孢在試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d左右，等培養(yǎng)基上長(zhǎng)滿菌絲后，將濾紙片剪成若干小紙片滅菌后放入斜面中，使濾紙片緊貼斜面，2～3 d后濾紙片即可長(zhǎng)滿孢子。取出濾紙片，在超凈工作臺(tái)中用無菌風(fēng)吹干，裝入滅菌的硫酸紙袋中-20 ℃冷凍保存。使用時(shí)在平板培養(yǎng)基上活化即可。

濾紙片保存法所需工具簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，污染較少，所占空間也小，并且經(jīng)過很長(zhǎng)一段時(shí)間后，稻瘟病菌的致病性基本沒有變化，可以很好地用來保存稻瘟病菌的孢子。

干燥和低溫是延長(zhǎng)孢子存活期，穩(wěn)定稻瘟病菌致病性的兩個(gè)主要因素，其中干燥尤為重要，而低溫只有在干燥的前提下才能發(fā)揮作用。分離的稻瘟病菌株用濾紙片法保存，平板培養(yǎng)基活化后仍能保持很強(qiáng)的活性和致病性。

通過比較和分析稻瘟病菌幾種分離和保存孢子的方法，認(rèn)為用病組織保濕法分離單孢和濾紙片法保存菌種，提高了分離的效率，降低了保存的難度，為今后培養(yǎng)大量的稻瘟病菌并進(jìn)行接種鑒定奠定了很好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉占領(lǐng)，雷財(cái)林，程治軍，等.水稻稻瘟病抗性基因定位與克隆研究進(jìn)展[J].作物雜志，2007（3）：16-19.

[2] 張君成.手工挑取真菌單孢子顯微操作技巧[J].植物保護(hù)，2008，34（2）：98-100.

[3] 張書建，何月秋.介紹一種簡(jiǎn)單的真菌單孢子分離法[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，18（3）：315-316.

[4] 董娟華，羅 麗，王彩霞，等.一種強(qiáng)寄生病原真菌的分離方法——毛細(xì)管打孔單孢分離法[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（3）：210-212.

[5] 邱小燕，湯智鵬，張 敏，等.一種適用于多數(shù)植物病原真菌的單孢分離方法[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（9）：5263-5264.

[6] 孔秀英.稻瘟病菌分生孢子的誘發(fā)及保存方法[J].微生物學(xué)通報(bào)，1995，22（5）：308-310.

[7] 金曉春，李志新，張海生，等.稻瘟病菌分離及保存方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（17）：7308，7390.