LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定CUMS大鼠血漿中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

臧雨馨，孫冰婷，趙文珠，容　納，戴國(guó)梁，居文政，談恒山

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院、 2.附屬醫(yī)院臨床藥理科，江蘇 南京　210029; 3.南京軍區(qū)總醫(yī)院臨床藥理科，江蘇 南京　210002)

LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定CUMS大鼠血漿中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

臧雨馨1，孫冰婷1，趙文珠1，容納1，戴國(guó)梁1，居文政2，談恒山3

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院、 2.附屬醫(yī)院臨床藥理科，江蘇 南京210029; 3.南京軍區(qū)總醫(yī)院臨床藥理科，江蘇 南京210002)

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R347；R446.11；R749.42; R977.1

摘要:目的建立測(cè)定大鼠血漿中五羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)的LC-MS/MS方法，觀察慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)抑郁大鼠血漿單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT、NE的變化情況。方法♂ SD大鼠22只，分為對(duì)照組(n=10)和模型組(n=12)，模型組每天給予9種慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和刺激因子，造模21 d后，分別于造模前后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)定及眼眶采血；采用苯甲酰氯作為柱前衍生化試劑，將3種待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)衍生化后進(jìn)入LC-MS/MS檢測(cè)，測(cè)定造模前后血漿中5-HT、NE、DA 3種神經(jīng)遞質(zhì)濃度。結(jié)果造模21d后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠體重明顯降低(P<0.05)，水平得分、垂直得分均明顯降低(P<0.01)，同時(shí)糖水消耗量明顯降低(P<0.01)。血漿中5-HT、NE、DA的濃度在1.47~752、1.75~898、2.05~1053 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限分別為1.47、 1.75、 2.05 μg·L-1, 以質(zhì)控樣品計(jì)算，在各濃度水平下，此法的回收率均大于70 %，日內(nèi)和日間精密度小于15 %，符合生物樣品分析要求。造模21 d后，模型組血漿中5-HT、NE、DA的濃度分別為(3.99±1.21)、(6.24±1.94)、(6.07±1.98) μg·L-1，與對(duì)照組相比均明顯降低(P<0.01)。結(jié)論CUMS造模成功后，血漿中的3種神經(jīng)遞質(zhì)分別呈下降趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：LC-MS/MS; CUMS; 大鼠; 血漿; 5-HT; DA; NE; 衍生化

抑郁癥(depression)是一種情感障礙性精神疾病，以明顯而持久的心境低落為主要特征，常伴有焦慮、軀體不適感、睡眠障礙、食欲及性欲減退等癥狀[1]。抑郁癥發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是與應(yīng)激密切相關(guān)的一類精神疾病，單胺遞質(zhì)假說(shuō)認(rèn)為其發(fā)生可能與腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)功能失衡有關(guān)。近年來(lái)，此假說(shuō)得到證實(shí)，去甲腎上腺素(NE)、五羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)被認(rèn)為是與抑郁癥的發(fā)生關(guān)系最為密切的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。抑郁狀態(tài)可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)及其受體功能產(chǎn)生明顯改變[2-5]。我們采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[6]，該模型是迄今為止較為理想的抑郁動(dòng)物模型，很好地模擬了慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激誘發(fā)抑郁的過(guò)程及生理生化改變[7],行為學(xué)及代謝組學(xué)研究均顯示CUMS造模較為成功。為了提升此類強(qiáng)極性神經(jīng)遞質(zhì)在LC-MS / MS測(cè)定中的靈敏度和分離效率，本文采用柱前衍生化結(jié)合LC-MS / MS首次同時(shí)測(cè)定CUMS模型下大鼠血漿中的3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑對(duì)照品鹽酸五羥色胺、鹽酸多巴胺均購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)分別為：1001528057、101280875)；重酒石酸去甲腎上腺素、內(nèi)標(biāo)咖啡酸均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)分別為：100169-201103、110885-200102)；苯甲酰氯購(gòu)自成都科龍化工試劑廠(批號(hào)為：20120529,分析純，98%)；甲醇、乙腈為色譜純，甲酸、乙酸銨等均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2儀器Waters Quattro Micro液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)，色譜工作站：Masslynx4.1；梅特勒-托利多AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Thermo Micro 17冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；Millipore Driet-Q5超純水機(jī)(法國(guó)Millipore公司)；WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；離心濃縮儀(美國(guó)Labconco公司)；游泳缸，自制敞箱；-80℃冰箱(海爾公司)。

1.3動(dòng)物及造模方法SD大鼠22只，♂，體質(zhì)量(200±20)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：scxk-(蘇)2014-0001。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(10只)和模型組(12只)，對(duì)照組5只/籠飼養(yǎng)，模型組每只單籠飼養(yǎng)，正常飲食、飲水。適應(yīng)3 d后，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。采用Katz法造模，使大鼠在21 d內(nèi)接受以下9種刺激因子：① 潮濕墊料和傾斜45°；② 禁食24 h；③ 熱刺激45℃環(huán)境(5 min)；④ 夾尾(用塑料夾子夾住距大鼠尾尖1 cm處，持續(xù)5 min后取下夾子)；⑤ 4℃冰水游泳(5 min)；⑥ 束縛應(yīng)激6 h；⑦ 禁水24 h；⑧ 觸摸陌生異常物品(塑料杯、木勺、碎布片等)；⑨ 晝夜顛倒24 h(于早9 ∶00時(shí)將大鼠的籠子蓋上黑色塑料袋，不開(kāi)燈使大鼠處于黑暗狀態(tài)；至晚21 ∶00時(shí)將籠子上的黑色塑料袋去掉，置于開(kāi)燈的房間，使動(dòng)物處于光照狀態(tài)，直至次日早9 ∶00時(shí))。每日給予一種刺激，每種刺激累計(jì)使用2~3次，順序隨機(jī)，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，持續(xù)3周。造模前、后分別于大鼠眼眶靜脈叢取血0.5 mL，置于肝素鈉浸泡過(guò)的1.5 mL EP管，取血時(shí)間前后須一致，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于干凈的EP管中，整個(gè)過(guò)程避光，并置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.4行為學(xué)測(cè)定兩組分別于造模前及造模21 d后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)定，包括體重變化、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、糖水消耗實(shí)驗(yàn)。

1.4.1體重變化CUMS抑郁模型動(dòng)物可出現(xiàn)食欲不振、體重降低等現(xiàn)象，因此體重變化可作為衡量模型動(dòng)物抑郁程度的標(biāo)準(zhǔn)之一。

1.4.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)將大鼠放入高40 cm，長(zhǎng)寬均為50 cm，內(nèi)壁涂黑，底面平均分為25個(gè)10 cm × 10 cm的小方格的箱內(nèi)底面中心，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)，以5 min內(nèi)大鼠穿越箱底面的方格數(shù)為水平得分(三爪以上跨入)，穿越一格得1分；以雙前肢抬起次數(shù)為垂直得分(兩前肢離地1 cm以上)，雙前肢離地一次得1分。

1.4.3糖水消耗d 1 : 給予每只大鼠兩瓶1%蔗糖水，每瓶各200 mL；d 2: 給予每只大鼠一瓶裝有1%蔗糖水，另一瓶裝有純凈水，每瓶各200 mL；d 3 : 所有大鼠均禁食禁水；d 4: 給予每只大鼠一瓶1%蔗糖水，另一瓶純凈水，每瓶各200 mL，24 h后，取走兩瓶并測(cè)量瓶中剩余液體體積，計(jì)算動(dòng)物的糖水消耗量。

1.5血樣處理取血漿100 μL,加入內(nèi)標(biāo)20 μL(咖啡酸：5 mg·L-1),加入200 μL乙腈，渦旋5 min,12 000 r·min-1離心10 min，取上清液200 μL，轉(zhuǎn)移至干凈EP管中，加入50 μL苯甲酰氯(體積分?jǐn)?shù)為0.02的苯甲酰氯溶解于乙腈溶液中)及50 μL四硼酸鈉緩沖溶液，室溫下渦旋5 min,12 000 r·min-1離心10 min,取200 μL上清液置于進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)樣量：10 μL。

1.6色譜條件色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)，美國(guó)Agilent公司；保護(hù)柱：Agilent Zorbax SB-C18(12.5 mm×2.1 mm, 5 μm)，美國(guó)Agilent公司；流動(dòng)相: 0.1 %甲酸水溶液(含2.0 mmol·L-1乙酸銨) ∶乙腈=35 ∶65; 流速：0.2 mL·min-1; 柱溫：35℃。

1.7質(zhì)譜條件離子化方式為電噴霧(ESI)；多反應(yīng)離子檢測(cè)(MRM); 檢測(cè)離子為正離子。5-HT為[M+H]+，母離子→子離子m/z ∶385.0→264.2；NE為[M+H]+，母離子→子離子m/z:482.0→105.0；DA為[M+Na]+，母離子→子離子m/z : 487.8→487.7；咖啡酸(IS)為[M+H]+，母離子→子離子m/z : 406.0→105.0。檢測(cè)電壓：3.0 kV；錐孔電壓分別為：40V、30V、50V、30 V；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣體流速：450 mL·min-1，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1　MRM parameters of three analytes and internal standard(IS)

2結(jié)果

2.1行為學(xué)結(jié)果造模21 d后，模型組大鼠食欲減退，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，和對(duì)照組相比，模型組大鼠體重明顯降低，水平得分、垂直得分、糖水消耗量均明顯降低，見(jiàn)Tab 2。

GroupControlgroupModelgroup0dWeight/g249.5±7.97251.7±8.35Open-field(5min)Horizontal55.4±6.3158.2±8.83Vertical20.0±3.5019.8±3.07Sugarconsumption/mL50.3±6.1151.8±9.4121dWeight/g314.5±16.06252.5±12.52*Open-field(5min)Horizontal49.1±6.0311.0±2.47**Vertical14.8±2.782.3±1.30**Sugarconsumption/mL54.7±8.1414.5±3.23**

*P<0.05，**P<0.01vs21 d control

Fig 1　Representative MRM chromatograms of 5-HT,NE,DA and IS in rat plasma samples

A: Derivatization reagent；B: Reference standards of 5-HT, NE, DA and IS dissolved in methanol；C: Blank plasma；D: Plasma added reference standards of 5-HT,NE,DA and IS. 1: IS；2: DA；3: NE；4: 5-HT

2.2色譜行為在本實(shí)驗(yàn)所采用的LC-MS/MS條件下，5-HT、NE、DA和內(nèi)標(biāo)互不干擾，峰形良好，無(wú)雜峰干擾，基線平穩(wěn)，保留時(shí)間分別為：3.83、4.42、6.20、4.63 min(Fig 1)。本方法具有良好的特異性和分離度，能準(zhǔn)確測(cè)定血漿中3種神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，重現(xiàn)性好。

2.3基質(zhì)效應(yīng)考察取EP管數(shù)支，分別精密加入376、449、526.5 μg·L-1；94、112、131.5 μg·L-1；1.47、1.75、2.05 μg·L-1的5-HT、NE、DA質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，再分別加入內(nèi)標(biāo)溶液(5 mg·L-1)20 μL，50 μL苯甲酰氯(體積分?jǐn)?shù)為0.02的苯甲酰氯溶解于乙腈溶液中)及50 μL四硼酸鈉緩沖液,渦旋5 min，12 000 r·min-1離心10 min，取80 μL進(jìn)樣分析，記錄峰面積A1。

另按“血樣處理”項(xiàng)下操作空白血漿數(shù)管，同上操作，記錄峰面積A2。(A2/A1)×100%即為基質(zhì)效應(yīng)ME(%)。5-HE、NE、DA和內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)分別在81.62 %~103.77 %、81.25 %~101.52 %、86.74 %~97.12 %、79.20%。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控取EP管數(shù)支，加入100 μL空白血漿，20 μL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)液(5.0 mg·L-1)，分別加入濃度分別為1.47、2.94、11.7、23.5、94、188、376、752 μg·L-1的5-HT標(biāo)準(zhǔn)溶液；1.75、3.5、14、28、112、224.5、449、898 μg·L-1的NE標(biāo)準(zhǔn)溶液；2.05、4.1、16.4、32.8、131.5、263.2、526.5、1 053 μg·L-1的DA標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，渦旋混勻，配成相應(yīng)濃度的含藥血漿，0點(diǎn)為空白血漿，按“血樣處理”項(xiàng)下操作。由于空白血漿中本來(lái)就有此類內(nèi)源性物質(zhì)存在，故測(cè)定時(shí)要扣除空白血漿所含的量。以各濃度點(diǎn)對(duì)0點(diǎn)的差值與內(nèi)標(biāo)之比作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)，血漿藥物濃度為橫坐標(biāo)。得3條回歸方程，結(jié)果見(jiàn)Tab 3。

Tab 3　Standard curves of 5-HT,NE and DA

2.5精密度和準(zhǔn)確度考察日內(nèi)精密度與日間精密度(3 d)。按標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法制備含5-HT、NE、DA濃度分別為376、449、526.5 μg·L-1；94、112、131.5 μg·L-1；1.47、1.75、2.05 μg·L-1含藥血漿質(zhì)控樣品，按“血樣處理”項(xiàng)下操作，根據(jù)隨行標(biāo)線測(cè)得實(shí)際濃度。實(shí)測(cè)濃度的RSD值即為精密度。實(shí)測(cè)濃度和加入濃度的比值即為準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)Tab 4。

2.6提取回收率同上操作制備含5-HT、NE、DA分別為376、449、526.5 μg·L-1；94、112、131.5 μg·L-1；1.47、1.75、2.05 μg·L-1的含藥血漿質(zhì)控樣品，按“血樣處理”項(xiàng)下操作，記錄峰面積A3。提取回收率R%=(A3/A1)×(17/10)×100%，結(jié)果如下，5-HT、NE、DA及內(nèi)標(biāo)的提取回收率分別為91.91%~106.75%(n=5)、74.34%~83.99%(n=5)、78.85%~86.81%(n=5)、106.54%(n=15)。

2.7穩(wěn)定性5-HT、NE、DA對(duì)照品儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)溶液室溫放置4 h，與立即測(cè)定相同中濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，以5-HT、NE、DA峰面積分別和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值折算成實(shí)測(cè)濃度計(jì)算，比值變化在89.72%~103.50%之間；5-HT、NE、DA和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液在4℃下放置30 d,以實(shí)測(cè)濃度計(jì)算，經(jīng)與當(dāng)天新配制的標(biāo)液進(jìn)行比較，5-HT、NE、DA和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的實(shí)測(cè)濃度分別為新配制的93.21%、94.36%、91.73%、92.32%，結(jié)果表明，5-HT、NE、DA和內(nèi)標(biāo)溶液室溫放置4 h和4℃冷藏30 d穩(wěn)定性良好。

分別考察了5-HT、NE、DA的各高、中、低濃度血漿質(zhì)控樣品在室溫下放置4 h的穩(wěn)定性，濃度變化在85.19 %~105.57 %；經(jīng)血樣處理之后的分析物室溫放置8 h，濃度變化在83.75 % ~110.38 %。24 h后濃度降低了37.40 %~77.50 %；反復(fù)凍融3次后，經(jīng)實(shí)測(cè)濃度與加入濃度進(jìn)行比較，濃度變化在91.01 %~109.47 %。結(jié)果表明，未處理的血漿樣品室溫下放置4 h內(nèi)穩(wěn)定，經(jīng)血漿處理方法后，8 h內(nèi)穩(wěn)定，反復(fù)凍融3次均穩(wěn)定，而血漿處理后樣品室溫放置24 h后有明顯降解，故應(yīng)當(dāng)在8 h內(nèi)完成測(cè)定。

2.8樣品測(cè)定于造模前和造模21 d后，對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠進(jìn)行眼眶取血，所得血漿按“血樣處理”項(xiàng)下進(jìn)行處理測(cè)定，與造模21d后的對(duì)照組相比，模型組大鼠血漿中5-HT、NE、DA含量均明顯降低。結(jié)果見(jiàn)Tab 5。

3討論

本文采用柱前衍生化法首次測(cè)定了CUMS模型下血漿中5-HT、NE、DA 3種神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，方法簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，可作為5-HT、NE、DA血漿含量測(cè)定方法。

實(shí)驗(yàn)中，采用最早由Katz提出的慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和刺激對(duì)大鼠進(jìn)行為期3周的造模，21 d后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)及糖水消耗實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該造模方法造成的抑郁狀態(tài)與臨床上抑郁癥的快感喪失、精神運(yùn)動(dòng)衰減等較為相似，該模型很好地模擬了慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激誘發(fā)抑郁的過(guò)程及生理生化改變，與經(jīng)典的5-HT能神經(jīng)低下假說(shuō)相符[8-11]。

5-HT、NE、DA均極性較強(qiáng)，在反相色譜柱上屬于弱保留，且在電噴霧離子化過(guò)程中較低的表面活性導(dǎo)致質(zhì)譜響應(yīng)較差。為了改善此類高極性化合物的色譜行為，我們采用了柱前化學(xué)衍生化的方法以提高靈敏度和分離效率。之所以選擇苯甲酰氯，是因?yàn)樗梢耘c伯胺、仲胺等在溫和條件下反應(yīng)，并且產(chǎn)率較高，同時(shí)該試劑廉價(jià)易得。

Tab 4　Accuracy and precision of 5-HT,NE and DA

Tab 5Concentration of 5-HT, NE and DA

Group5-HT/μg·L-1NE/μg·L-1DA/μg·L-10dControlgroup(n=10)18.74±3.4686.37±11.5125.37±8.13Modelgroup(n=12)19.74±4.9782.96±12.2423.06±3.2121dControlgroup(n=10)16.95±2.2256.64±8.0519.77±2.21Modelgroup(n=12)3.99±1.21**6.24±1.94**6.07±1.98**

**P<0.01vs21 d control

此外，兒茶酚胺類的不穩(wěn)定性在儲(chǔ)存和前處理過(guò)程中應(yīng)當(dāng)引起注意。我們向流動(dòng)相中加入適量甲酸以阻止其氧化。在相關(guān)文獻(xiàn)[12]基礎(chǔ)上，我們改用等度洗脫，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，對(duì)液相方法進(jìn)行了反復(fù)優(yōu)化，在0.1 %的甲酸水溶液中加入2 mmol·L-1乙酸銨后，發(fā)現(xiàn)峰形改善，同時(shí)比較了50 %、60 %、65 %、70 %、80 %的乙腈比例，選擇了最佳流動(dòng)相比例65 %的乙腈 ∶35 %的0.1 %甲酸水溶液(含2 mmol·L-1乙酸銨)，使得3種待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間分別為3.83、4.42、6.20 min，將分析時(shí)間縮短在8 min內(nèi)。同時(shí)省略了吹干步驟，直接于上清液中進(jìn)行衍生化，簡(jiǎn)化了前處理步驟，使得前處理操作方便快捷。柱前衍生化將待測(cè)物5-HT、NE、DA的響應(yīng)值提升1個(gè)數(shù)量級(jí)，定量下限可達(dá)1 μg·L-1。

該方法建立后，CUMS模型組和對(duì)照組之間的3種神經(jīng)遞質(zhì)的差異性可以被準(zhǔn)確定量，對(duì)造模成功與否提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn):

[1]張風(fēng)霞, 張華, 姜林芳. 抑郁癥臨床研究進(jìn)展[J]. 山東中醫(yī)雜志, 2010, 29 (1):61-2.

[1]Zhang F X, Zhang H, Jiang L F. Clinical study of depression[J].ShandongJTCM, 2010, 29(1):61-2.

[2]王步軍, 藍(lán)長(zhǎng)安. 2型糖尿病與抑郁癥的相關(guān)性[J]. 中國(guó)臨床康復(fù), 2006, 10 (46):149-51.

[2]Wang B J, Lan C A. Correlation between type 2 diabetes mellitus and depression[J].ChinJClinRehabil, 2006, 10 (46):149-51.

[3]郭麗麗, 史亞飛, 張彩霞. 腫瘤并發(fā)抑郁國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 16 (1):112-5.

[3]Guo L L, Shi Y F, Zhang C X. Current research status of cancer happened with depression in the world[J].LiaoningUnivTCM, 2014, 16 (1):112-5.

[4]劉子修, 劉史佳, 居文政, 談恒山. 黃葵膠囊對(duì)大鼠CYP450酶的影響[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2010, 15 (4) : 367-72.

[4]Liu Z X, Liu S J, Ju W Z, Tan H S. Effects of Huangkui capsule on CYP450 enzymes in rat[J].ChinJClinPharmacolTherap, 2010, 15 (4):367-72.

[5]陳姣, 楚世峰, 陳乃宏. 糖皮質(zhì)激素與抑郁發(fā)病相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2013, 29(11):1493-5.

[5]Chen J, Chu S F, Chen N H. Research progress in glucocorticoid and pathophysiology of depression[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(11): 1493-5.

[6]董洪坦, 韓剛, 朱曉晨, 郭蓉娟. 肝郁脾虛抑郁癥研究進(jìn)展[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2014, 7(2):146-50.

[6]Dong H T, Han G, Zhu X C, Guo R J. Study of liver spleen depression[J].GlobalChinMed, 2014, 7(2):146-50.

[7]蔣亞萍. 抗抑郁中藥的研究進(jìn)展[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志, 2010, 31 (10):76-8.

[7]Jiang Y P. Study of antidepressant medicine[J].YunnanJTraditChinMed, 2010, 31(10):76-8.

[8]Vitale G, Ruggieri V, Filaferro M, et al. Chronic treatment with the selective NOP receptor antagonist[Nphe 1,Arg 14,Lys 15]N/OFQ-NH 2(UFP-101)reverses the behavioural and biochemical effects of unpredictable chronic mild stress in rats[J].Psychopharmacology(Berl), 2009, 207 (2):173-89.

[9]Farley S,Apazoglou K,Witkin J M,et al. Antidepressant-like effects of an AMPA receptor potentiator under a chronic mild stress paradigm[J].IntJNeuropsychopharmacol,2010, 13(9):1207-18.

[10]Dai Y, Li Z, Xue L, et al. Metabolomics study on the anti-depression effect of xiaoyaosan on rat model of chronic unpredictable mild stress[J].JEthnopharmacol, 2010, 128(2):482-9.

[11]Kamper E F, Chatzigeorgiou A, Tsimpoukidi O, et al. Sex differences in oxidant/antioxidant balance under a chronic mild stress regime[J].PhysiolBehav, 2009, 98(1-2):215-22.

[12]Zheng X, Kang A, Dai C, et al. Quantitative analysis of neurochemical panel in rat brain and plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].AnalChem, 2012, 84(22): 10044-51.

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.025.html

LC-MS/MS method for simultaneous determination of three

monoamine neurotransmitters in rat plasma of CUMS

ZANG Yu-xin1, SUN Bing-ting1, ZHAO Wen-zhu1, RONG Na1, DAI Guo-liang1, JU Wen-zheng2, TAN Heng-shan3

(1.CollegeofPharmacy,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China; 2.Deptof

ClinicalPharmacology,AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China;

3.DeptofClinicalPharmacology,GeneralHospitalofNanjingMilitaryAreaCommand,Nanjing210002,China)

Abstract:AimTo establish a LC-MS/MS method for determination of 5-HT, NE, DA and observe the concentration of 5-HT, NE, DA in rat plasma of CUMS. MethodsTwenty-two male SD rats were divided into control group and model group. Model group was given 9 kinds chronic unpredictable mild stimulating factors every day. 21 days later, behavior and orbital blood were measured before and after modeling. Using benzoyl chloride as a pre-column derivatization reagent, three analytes and IS were derivatized before LC-MS/MS detection. Change in three kinds of neurotransmitter concentration was measured in rat plasma before and after modeling. ResultsAfter modeling, compared with control group,the weight of rats in model group was declined significantly(P<0.05). Horizontal scores, vertical scores and sugar consumption were declined significantly(P<0.01). Calibration curves of 5-HT, NE, DA were linear between 1.47~752,1.75~898,2.05~1 053 μg·L-1and LOQ were 1.47, 1.75, 2.046 μg·L-1,respectively. The recovery of 5-HT, NE, DA from plasma was over than 70%, and RSD of inter-day and intra-day assay was limited in 15%．Compared with control group, the concentration of 5-HT, NE, DA in rat plasma of model group was declined to (3.99±1.21), (6.24±1.94), (6.07±1.98) μg·L-1(P<0.01). ConclusionAfter making CUMS model of depression, three kinds of neurotransmitters in rat plasma are decreased.

Key words:LC-MS/MS; CUMS; rats; plasma; 5-HT; DA; NE; derivatization

通訊作者居文政(1965-)，男，博士，主任藥師，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥物代謝動(dòng)力學(xué)，，Tel：025-86617141-80518，E-mail：wzhju333@163.com

作者簡(jiǎn)介：臧雨馨(1990-)，女，碩士生，研究方向：藥物代謝, E-mail:celloloverzang@126.com;

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No 2012ZX09303009-002);江蘇省中醫(yī)藥領(lǐng)軍人才(No LJ200906)；江蘇高校優(yōu)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(2010)

收稿日期：2014-10-11, 修回日期：2014-11-11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2015)02-0273-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.025