夏枯草總?cè)普{(diào)控ERK、TGF-β1/Smad通路對肝纖維化大鼠的保護作用研究

章圣朋，何　勇，徐　濤，黃　成，謝加力，鄧子煜，李　俊

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230032；2.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖　241002；3.安徽省創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性研究院，安徽 合肥　230032； 4.蕪湖市第二人民醫(yī)院藥劑科,安徽 蕪湖　241001；5.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥　230601)

夏枯草總?cè)普{(diào)控ERK、TGF-β1/Smad通路對肝纖維化大鼠的保護作用研究

章圣朋1,2，何勇1,3，徐濤1,3，黃成1,3，謝加力4，鄧子煜5，李俊1,3

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230032；2.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖241002；3.安徽省創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性研究院，安徽 合肥230032； 4.蕪湖市第二人民醫(yī)院藥劑科,安徽 蕪湖241001；5.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥230601)

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.47；R329.24；R575.2

摘要：目的研究夏枯草總?cè)?TTP)對四氯化碳(CCl4)致肝纖維化大鼠的保護作用及其分子機制。方法SD大鼠隨機分為正常組、模型組、TTP(25、50、100 mg·kg-1)組和陽性對照組(秋水仙堿0.1 mg·kg-1)，除正常組外，其余各組分別于大鼠背部皮下注射CCl40.1 ml·(100 g)-1，每周2次，連續(xù)12周，自造模第5周起開始給藥，各給藥組分別給予相應(yīng)的藥物，正常組、模型組給予等體積的溶媒，每天1次。實驗結(jié)束后，比色法測定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)含量；放免法測定透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)含量；同時取固定部位肝組織，蘇木精伊紅染色(HE)、Masson染色觀察肝纖維化程度；制備100 g·L-1肝勻漿，進行丙二醛(MDA)、超(過)氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、羥脯氨酸(Hyp)含量測定；RT-PCR法檢測α-SMA、Procollagen I、Smad2、Smad3 和 Smad7 mRNA表達；Western blot法檢測p-ERK蛋白表達。結(jié)果與模型組相比，TTP(25、50、100 mg·kg-1)給藥組不僅能降低肝纖維化大鼠ALT、AST、HA、CⅣ、PCⅢ、Hyp水平，改善肝臟病變程度，降低MDA水平，增強SOD以及GSH-Px活性，還可抑制肝組織中α-SMA、Procollagen I、Smad2、Smad3及p-ERK表達，升高Smad7表達。結(jié)論夏枯草總?cè)茖Cl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠具有較好的保護作用，其機制可能與下調(diào)p-ERK表達，調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：夏枯草總?cè)?；肝纖維化；四氯化碳；脂質(zhì)過氧化；TGF-β1/Smad信號通路；大鼠

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)激活是HF的中心環(huán)節(jié)，活化的HSC增生擴散，分泌細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)等多種物質(zhì)，使ECM合成與降解失衡，在肝臟過度沉積，肝臟結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致肝纖維化[1]。夏枯草為一味傳統(tǒng)中藥，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤功效[2]，現(xiàn)代臨床多用于治療急性傳染性肝炎等疾病。文獻報道[3]，夏枯草水提取物可抑制人肝癌細胞金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活性。 MMP-2和MMP-9均可促進HSC增殖，上調(diào)肝臟TGF-β1表達，因此，夏枯草水提取物具有治療HF的潛在作用。三萜類物質(zhì)是夏枯草主要成分，與其藥理作用明顯相關(guān)[4]。前期研究顯示[5]，夏枯草總?cè)?total triterpenoid of Prunella vulgaris L.,TTP)對CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型具有保護作用。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，研究TTP對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的防治作用，觀察TTP對肝纖維化膠原Procollagen Ⅰ分泌、HSC活化標(biāo)志α-SMA的影響，并探討TTP對p-ERK以及TGF-β1/Smad信號通路的影響，為防治肝纖維化提供實驗和理論依據(jù)。

1材料

1.1藥品與試劑夏枯草總?cè)?，購自西安小草科技股份有限公司，含?75%； 秋水仙堿購于西雙版納藥業(yè)有限公司，以5g·L-1羧甲基纖維素鈉溶液配成相應(yīng)濃度的混懸液使用。CCl4，購于汕頭西隴化工廠，臨用前用魯花花生油1 ∶1稀釋 。ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px、Hyp試劑盒購于南京建成生物工程研究所。HA、CⅣ、PCⅢ放射免疫試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所。TRIzol Reagent試劑購自Invitrogen Life Technologies公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自Fermentas公司。α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3、Smad7、β-actin引物序列由上海生工工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。大鼠p-ERK抗體購于美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購于北京中杉公司；ECL發(fā)光試劑盒購于Pierce公司。

1.2實驗動物♂ SD大鼠，體質(zhì)量180~220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于透氣籠中，每組10只，自由攝食飲水，溫度18℃~22℃，正常光照。

2方法

2.1動物分組與處理大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組、TTP給藥組(25、50、100 mg·kg-1)、陽性對照組(秋水仙堿0.1 mg·kg-1)，每組10只。除正常組外，其余各組分別于大鼠背部皮下注射CCl40.1 ml·(100 g)-1，每周2次，連續(xù)12周。自造模第五周起開始給藥，各給藥組分別給予相應(yīng)的藥物，正常組、模型組給予等體積的溶媒，每天1次，至實驗結(jié)束，每周稱重1次，調(diào)整用藥劑量。末次給藥后，禁食8h處死動物，制備血清，取肝臟組織，檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.2血清學(xué)指標(biāo)檢測大鼠血樣4℃、3 500 r·min-1離心15 min，取血清。檢測血清中AST、ALT、HA、CⅣ、PCⅢ含量。

2.3病理學(xué)指標(biāo)檢測肝組織脫水，石蠟包埋處理，HE、Masson染色切片，光鏡下觀察纖維化的有無及程度。

2.4組織學(xué)指標(biāo)檢測取適量肝右葉組織，用冷生理鹽水制成100 g·L-1肝勻漿，4℃、3 500 r·min-1離心15 min，取上清，進行MDA、SOD、GSH-Px 、Hyp含量測定。

2.5RT-PCR分析α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA水平取100 mg肝組織，按TRIzol試劑盒說明書提取肝組織總RNA，按RT-PCR試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。各引物序列、產(chǎn)物大小及反應(yīng)條件見Tab 1。擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，拍照，以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)進行密度掃描，以目的基因與β-actin光密度比值表示目的基因的相對量。

Tab 1　Primers

2.6Western blot 檢測肝組織中p-ERK蛋白水平取100 mg肝組織，加入1 mL RIPA 組織裂解液(每mL裂解液中加10 μL PMSF)，冰上進行組織勻漿，12 000 r·min-1離心10 min，取上清。加上樣緩沖液，100℃加熱10 min使蛋白變性。每孔加入8 μL總蛋白，進行SDS-PAGE電泳。結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，電壓15V，時間30 min。膜在室溫下用50 g·L-1脫脂奶粉封閉，漂洗后加入一抗，4℃過夜孵育。再加入相匹配的二抗，放置1 h。ECL試劑盒顯影，以ERK為內(nèi)參，分析條帶吸光度值。

3結(jié)果

3.1TTP對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中AST、ALT、HA、CⅣ、PCⅢ含量的影響結(jié)果如Tab 2所示，與正常組相比，模型組血清ALT、AST水平明顯升高(P<0.01)，TTP各劑量組可降低模型大鼠血清ALT、AST水平(P<0.05，P<0.01)；模型組大鼠血清纖維化指標(biāo)HA、CⅣ、PCⅢ與正常組相比明顯增加(P<0.01)，TTP各劑量組明顯降低模型大鼠血清HA、CⅣ、PCⅢ含量(P<0.05，P<0.01)，提示TTP具有肝臟保護作用。

Tab 2　Effect of TTP on serum ALT, AST, HA, CⅣ, PCⅢ±s,n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

3.2TTP對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)影響HE染色顯示，正常組大鼠肝細胞完整，肝組織無異常纖維增生；模型組可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，成纖維細胞出現(xiàn)，假小葉形成，肝組織中有明顯炎性細胞浸潤；TTP低、中、高劑量組和秋水仙堿組可見匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生減少，有少量炎性細胞浸潤，未見假小葉形成，肝纖維化呈現(xiàn)好轉(zhuǎn)的趨勢(Fig 1)。Masson染色結(jié)果顯示，正常大鼠肝細胞完整，無纖維組織增生。模型組大鼠有較多的成纖維細胞出現(xiàn)，纖維結(jié)締組織增生，肝索排列紊亂并伴有假小葉形成。TTP治療組肝纖維化均有不同程度的改善，結(jié)締組織增生減少，炎性浸潤程度減輕，其中以TTP 100 mg·kg-1最為明顯，脂肪變性基本消失，肝組織結(jié)構(gòu)趨向正常(Fig 2)。

Fig 1Photomicrographs of liver sections stained

with HE′s trichrome(×200)

A:Normal; B:Model; C:TTP (25 mg·kg-1); D: TTP (50 mg·kg-1); E: TTP (100 mg·kg-1); F: Colchicine (0.1 mg·kg-1)

Fig 2Photomicrographs of liver sections stained

with Masson′s trichrome(×100)

A:Normal; B:Model; C:TTP (25 mg·kg-1); D: TTP (50 mg·kg-1); E: TTP (100 mg·kg-1); F: Colchicine (0.1 mg·kg-1)

所示，相比正常組，模型組大鼠肝組織MDA和Hyp水平明顯上升(P<0.01)，SOD和GSH-Px水平明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，TTP和秋水仙堿組能明顯降低MDA和Hyp水平(P<0.05，P<0.01)，增加SOD含量，上調(diào)GSH-Px表達水平(P<0.05，P<0.01)。

3.4TTP對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達影響如Fig 3 所示，與正常組相比，模型組大鼠肝組織中α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3 mRNA表達均明顯升高(P<0.01)，Smad7 mRNA表達降低(P<0.01)；與模型組相比，TTP給藥組可降低α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3 mRNA表達(P<0.05，P<0.01)，升高Smad7 mRNA表達(P<0.05，P<0.01)。

GroupDose/mg·kg-1Hyp/μg·g-1SOD/kU·g-1ProMDA/μmol·g-1ProGSH-Px/kU·g-1ProNormal-114.75±17.87143.76±22.52.66±0.39188.35±26.47Model-404.26±58.50**87.55±14.30**4.73±0.68**76.97±13.72**TTP25358.12±41.9995.61±17.03#3.95±0.92#100.05±20.59#50259.37±36.17##107.11±16.05##3.55±0.79#130.11±21.63#100162.82±20.25##122.31±18.76##3.30±0.56#161.23±29.94#Colchicine0.1184.18±21.24##107.20±17.75##3.38±0.64##113.02±16.60##

**P<0.01vsnormal;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Fig 3　Effect of TTP on α-SMA, procollagen I, Smad2, Smad3

1:Normal; 2:Model; 3:TTP (25 mg·kg-1); 4: TTP (50 mg·kg-1); 5: TTP (100 mg·kg-1).**P<0.01vsnormal group;#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

3.5TTP對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟p-ERK蛋白表達影響結(jié)果如Fig 4所示，模型組大鼠肝組織中p-ERK蛋白表達水平高，與正常組相比，差異具有顯著性(P<0.01)。與模型組相比較，TTP作用大鼠后，肝組織中p-ERK蛋白表達明顯降低(P<0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，表明TTP可以降低肝纖維化大鼠肝組織中p-ERK蛋白表達。

4討論

臨床實踐表明，HA、CⅣ、PCⅢ水平與肝組織炎癥和纖維化緊密相關(guān)[6-7]。HA主要在肝臟內(nèi)清除，肝臟損傷時其分解HA的功能遭到破壞，因此HA是反映肝功能和肝纖維化的良好指標(biāo)。CⅣ隨著肝臟炎癥程度增加，其表達也逐步升高[8]。PCⅢ與肝纖維化程度呈正相關(guān)。肝纖維化以ECM過度沉積為病理學(xué)特征，ECM主要成分為膠原纖維，由膠原蛋白構(gòu)成，Hyp常被認為是膠原蛋白特有成分，因此，肝組織Hyp含量可間接反映肝纖維化程度[9]。聯(lián)合檢測以上指標(biāo)，對于診斷肝纖維化具有重要價值。本研究發(fā)現(xiàn)，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中ALT、AST、HA、CⅣ、PCⅢ以及肝組織中Hyp含量明顯升高，提示肝纖維化模型建立成功；TTP各劑量組可明顯降低肝纖維化大鼠ALT、AST、HA、CⅣ、PCⅢ、Hyp水平；病理學(xué)檢測顯示，TTP給藥組明顯減少肝組織中炎性細胞浸潤與膠原組織增生；RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TTP可明顯降低Procollagen Ⅰ膠原的分泌。以上研究結(jié)果提示，TTP對于CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化具有有效的保護作用。

Fig 4Effect of TTP on p-ERK protein expression

1:Normal; 2:Model; 3:TTP (25 mg·kg-1); 4: TTP (50 mg·kg-1); 5: TTP (100 mg·kg-1).**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group

氧自由基及其引起的脂質(zhì)過氧化在肝纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可以直接激活HSC，介導(dǎo)HSC增殖、分化和膠原形成[10]。SOD是機體超氧自由基消除劑，常被作為抗氧化能力的敏感指標(biāo)。MDA表達異?？蓪?dǎo)致炎癥和肝細胞損傷，其含量與機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度相平行。GSH-Px可保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，清除體內(nèi)過多的脂質(zhì)過氧化物。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TTP各劑量組可明顯降低MDA水平，增強SOD以及GSH-Px活性，這表明TTP具有減輕肝臟脂質(zhì)過氧化損傷，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，增強肝臟抗氧化能力作用。這可能是TTP作用機制之一。

HSC是肝臟分泌ECM的主要細胞，HSC激活是HF形成的中心環(huán)節(jié)。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝纖維化大鼠HSC活化標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)與正常組比較明顯增高。細胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)對HSC活化起著重要的作用，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是其中重要的細胞因子。TGF-β1通過庫否細胞分泌產(chǎn)生，激活HSC，同時能促進HSC自分泌TGF-β1，激活臨近HSC大量合成Ⅰ型前膠原、Ⅲ型膠原[11]。研究證實，TGF-β1可通過TGF-β1/Smad和ERK信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)HSC膠原生產(chǎn)。Smads蛋白家族是TGF-β1/Smad信號過程中最重要的胞內(nèi)效應(yīng)分子， Smad2、Smad3在HSC中被TGF-β1磷酸化，與 Smad4形成異源寡聚物，將TGF-β1信號從胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位聚集；Smad7是TGF-β1/Smad信號通路的抑制因子，阻止Smad2、Smad3的磷酸化，從而對TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮負性調(diào)控[12-13]。HSC激活過程中，抑制ERK活性后能有效減少HSC自分泌TGF-β1，提示ERK信號通路參與調(diào)控HSC自分泌TGF-β1過程。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠肝組織中，Smad2、Smad3 mRNA以及p-ERK蛋白表達增高，Smad7 mRNA表達降低；而TTP對模型大鼠α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3、p-ERK有明顯的降低作用，對 Smad7 有升高作用。以上結(jié)果說明，TTP對肝纖維化的防治作用可能與下調(diào)p-ERK表達，抑制TGF-β1/Smad通路有關(guān)。

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網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.023.html

Regulatory effects of total triterpenoid of Prunella vulgarisL.on activities of

ERK and TGF-β1/Smad signaling pathway in protecting hepatic fibrosis in rats

ZHANG Sheng-peng1,2, HE Yong1,3, XU Tao1,3, HUANG Cheng1,3, XIE Jia-li4, DENG Zi-yu5, LI Jun1,3

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 2.SchoolofPharmacy,Wannan

MedicalCollege,WuhuAnhui241002,China; 3.AnhuiInstituteofInnovativeDrugs,Hefei230032,China;

4.DeptofPharmacy,WuhuNO.2People′sHospital,WuhuAnhui241001,China; 5.DeptofPharmacy,

theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China)

Abstract:AimTo investigate the protective effects of total triterpenoid from Prunella vulgaris L.(TTP) on

CCl4-induced hepatic fibrosis in rats and its mechanism. MethodsRat liver fibrosis was induced by 50% CCl4twice a week for 12 weeks. From the 5th week, all the therapeutic groups were treated with the TTP(25, 50, 100 mg·kg-1) and the colchicine (0.1 mg·kg-1) respectively once a day for 8 weeks. At the end of the twelfth week, the levels of ALT, AST, HA, PCⅢ, CⅣ, MDA, SOD, GSH-Px, Hyp were measured. HE and Masson staining were used to evalulate the degree of hepatic fibrosis. The mRNA expression of α-SMA, procollagen I, Smad2, Smad3, Smad7 in liver was detected by RT-PCR, and the p-ERK protein expression was evaluated by Western blot. ResultsCompared with the model group, TTP(25, 50, 100 mg·kg-1) not only reduced serum content of ALT, AST, HA, PCⅢ, CⅣ and Hyp, MDA in liver tissue, improved the morphologic changes of hepatic fibrosis, but also increased SOD and GSH-Px activity. Moreover, it decreased the α-SMA, procollagen I, Smad2, Smad3 mRNA expression and increased Smad7 mRNA expression in liver tissues obviously. Furthermore, TTP reduced the protein expression of p-ERK. ConclusionsTTP can protect rats from CCl4-induced liver fibrosis. The mechanism of this process may involve inhibiting the expression of p-ERK and interference with TGF-β1/Smad signal transduction pathway.

Key words:total triterpenoid of Prunella vulgarisL.(TTP); liver fibrosis; CCl4; lipid peroxidation; TGF-β1/Smad signaling pathway; rat

通訊作者李俊(1960-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：肝臟藥理學(xué)、抗炎免疫藥理學(xué)，，Tel: 0551-65161001，E-mail: lijun@ahmu.edu.cn

作者簡介：章圣朋(1984-)，男，碩士，助教，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，Tel：0553-3932185，E-mail：wnmczhang@sina.com；

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81273526)；安徽省科技廳項目(No KJ2012A156)

收稿日期:2014-10-24,修回日期:2014-11-20

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0261-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.023