頑痹清丸HPLC指紋圖譜研究

羅石任 王昭 李潔

摘要：目的 建立頑痹清丸高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜評(píng)價(jià)體系，為頑痹清丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法 以Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm，進(jìn)樣量20 μL。對(duì)10批頑痹清丸樣品進(jìn)行測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A）》建立頑痹清丸的標(biāo)準(zhǔn)指紋譜，并計(jì)算各批樣品的相似度。結(jié)果 所建立的頑痹清丸指紋圖譜共確定20個(gè)共有峰，相似度不低于0.98，5個(gè)峰得到化學(xué)確認(rèn)。結(jié)論 建立的HPLC指紋圖譜方法穩(wěn)定易行，重復(fù)性好，可用于頑痹清丸的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞：頑痹清丸；高效液相色譜法；指紋圖譜

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.023

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）01-0096-04

Study on HPLC Fingerprint of Wanbiqing Pills LUO Shi-ren， WANG Zhao， LI Jie （Luoyang Orthopedic Hospital of Henan Province， Orthopedic Hospital of Henan Province， Zhengzhou 450000， China）

Abstract： Objective To establish an evaluation system of HPLC fingerprint of Wanbiqing Pills； To provide references for the quality control of Wanbiqing Pills. Methods Wanbiqing Pills were analyzed with HPLC method. Analysis was performed on Agilent C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with the mobile phase of acetonitrile- 0.1%H3PO4 water gradient elution at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 258 nm. Sample injection was 20 μL. Standard fingerprint of Wanbiqing Pills was established based on Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （Version 2004 A）. The similarity of Wanbiqing Pills from different batches was computed. Results A standard HPLC fingerprint procedure was developed for Wanbiqing Pills with 20 common peaks. The similarity of 10 batches of Wanbiqing Pills was not lower than 0.98. Five peaks received chemical confirmation. Conclusion The HPLC method is stable and feasible and with good repeatability， which can be used for the quality control of Wanbiqing Pills.

Key words： Wanbiqing Pills； HPLC； fingerprint

頑痹清丸為本院醫(yī)院制劑[豫藥制字Z20120245（洛）]，由忍冬藤、絡(luò)石藤、桑枝、黃芩等14味藥組成，具有清熱除濕、祛風(fēng)通絡(luò)功效，適用于風(fēng)濕熱痹阻經(jīng)絡(luò)所致風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎等。中藥指紋圖譜能全面反映中藥內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，利用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果可直觀分析不同批次制劑的質(zhì)量差異，指導(dǎo)制劑生產(chǎn)過(guò)程中原藥材的選擇及生產(chǎn)工藝的優(yōu)化[1-3]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立頑痹清丸指紋圖譜，為全面控制其質(zhì)量及進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)），XS205DU型分析天平（梅特勒-托利多有限公司），TP300型超

通訊作者：王昭，E-mail：18337960862@163.com

聲波提取器（天鵬電子新技術(shù)北京有限公司），HH- S26s型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）。

頑痹清丸（批號(hào)20101109、20101220、20110105、20110214、20110321、20110510、20110615、20110723、20110903、20111020），河南省正骨研究所提供；對(duì)照品馬錢(qián)苷（批號(hào)111640-201005）、黃芩苷（批號(hào)110715-201016）、蛻皮甾酮（批號(hào)110715-201016）、丹皮酚（批號(hào)110715-201016）、吳茱萸堿（批號(hào)110715-201016）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

取馬錢(qián)苷對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、丹皮酚對(duì)照品、吳茱萸對(duì)照品、蛻皮甾酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為40.50、138.8、124.3、68.5、118.9 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取各批次頑痹清丸適量，研細(xì)，取約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）40 min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，濾液濃縮并定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；記錄時(shí)間為77 min；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批樣品6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄指紋圖譜。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積積分值RSD均<3%，符合指紋圖譜要求，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液20 ?L，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜，結(jié)果顯示，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積積分值的RSD均<3%，表明該方法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別于0、4、6、8、12、24 h測(cè)定結(jié)果，記錄指紋圖譜，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積積分值RSD均<3%，符合指紋圖譜要求，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 頑痹清丸高效液相色譜指紋圖譜

2.5.1 指紋圖譜的建立 按“2.2”項(xiàng)下方法制備10批頑痹清丸樣品，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，得到10批頑痹清丸HPLC指紋圖譜，將其導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A）》，進(jìn)行色譜法匹配，結(jié)果見(jiàn)圖1。所得指紋圖譜共有模式見(jiàn)圖2。以15號(hào)峰作為參照，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

2.5.2 指紋圖譜相似度測(cè)定 采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A）》軟件，采用相關(guān)系數(shù)法對(duì)10批頑痹清丸進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，10批樣品相似度良好。

2.5.3 各峰歸屬的判斷 通過(guò)與對(duì)照品保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)照，確認(rèn)了其中5個(gè)指紋峰：5號(hào)峰為馬錢(qián)苷，7號(hào)峰為蛻皮甾酮，10號(hào)峰為黃芩苷，15號(hào)峰為丹皮酚，19號(hào)峰為吳茱萸堿。對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖3。

3 討論

本試驗(yàn)考察了甲醇、50%甲醇、70%甲醇3種提取溶劑的提取效果[4-6]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以50%甲醇作為提取溶劑的樣品溶液所得峰數(shù)較多，但雜質(zhì)也很多，很難使每個(gè)色譜峰完全分離，且所得色譜圖特征不明顯；甲醇為提取溶劑比70%甲醇和50%甲醇提取所得的樣品溶液色譜峰少；70%甲醇作為提取溶劑的樣品溶液所得的供試品峰數(shù)較多，且色譜峰分離度較好。因此選用70%甲醇作為提取溶劑。試驗(yàn)還考察了以70%甲醇為提取溶劑超聲和水浴回流2種提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取所得色譜峰比回流所得色譜峰多，因此采用超聲提取法作為供試品溶液的提取方法。

本試驗(yàn)曾采用甲醇-水、乙腈-水不同比例變化的流動(dòng)相梯度洗脫系統(tǒng)進(jìn)行洗脫[7-8]，結(jié)果乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)色譜峰分離效果比甲醇-水作為流動(dòng)相峰的分離效果好，且基線較為平穩(wěn)，但個(gè)別峰的分離效果不佳，在水相中加入0.1%磷酸進(jìn)行調(diào)節(jié)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)效果改善明顯，各色譜峰的分離效果較好，最后確定流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)為乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫[9]。試驗(yàn)曾采用236、258、265、274、280 nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定[10]，經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn)，258 nm波長(zhǎng)處基線平穩(wěn)、出峰穩(wěn)定，故確定258 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。選用Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）的分離效果較好，保留時(shí)間適宜，因此本試驗(yàn)選擇Agilent C18柱為檢測(cè)色譜柱。

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（收稿日期：2015-03-20）

（修回日期：2015-04-10；編輯：陳靜）