丹龍醒腦方對(duì)腦缺血再灌注大鼠側(cè)腦室室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及Hes1、Hes5表達(dá)的影響

陳娉婷 周小青 劉旺華 曹澤標(biāo) 陳昱文 李花

摘要：目的 觀(guān)察丹龍醒腦方對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠側(cè)腦室室管膜下區(qū)（SVZ）神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）增殖與Hes1、Hes5表達(dá)的影響，探討其促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖的作用機(jī)制。方法 將80只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉組（依達(dá)組）、丹龍醒腦方組（丹龍組）。采用線(xiàn)栓法制備局灶性腦缺血再灌注模型，再灌注7 d后取缺血側(cè)SVZ腦組織。Brdu免疫熒光法檢測(cè)SVZ NSCs增殖，RT-qPCR、Western blot分別檢測(cè)Hes1、Hes5 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，其余各組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞率增加，Hes1、Hes5 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，依達(dá)組、丹龍組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞率明顯增加，Hes1、Hes5 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng)（P<0.01）；丹龍組Hes1 mRNA表達(dá)水平優(yōu)于依達(dá)組（P<0.01），其余指標(biāo)均無(wú)明顯差異。結(jié)論 丹龍醒腦方可促進(jìn)腦缺血再灌注后大鼠SVZ NSCs增殖，并上調(diào)Hes1、Hes5表達(dá)水平，其機(jī)制可能與激活Notch信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：丹龍醒腦方；室管膜下區(qū)；神經(jīng)干細(xì)胞；增殖；Hes1；Hes5；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.016

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）01-0069-05

Effects of Danlong Xingnao Formula on Proliferation of Neural Stem Cells in Sub Ventricular Zone and Expressions of Hes1 and Hes5 in Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury Model Rats CHEN Ping-ting1，2， ZHOU Xiao-qing1，2，3， LIU Wang-hua1，2，3， CAO Ze-biao1，2， CHEN Yu-wen1，2， LI Hua1，2，3 （1. Institute of Diagnostics Traditional Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. The Key Laboratory of Diagnostics of Chinese Medicine in Hunan Province， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China； 3. Collaborative Center for Research and Innovation of Digital Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To study effects of Danlong Xingnao Formula （DLXNF） on proliferation of neural stem cells （NSCs） and the expressions of Hes1 and Hes5 in sub ventricular zone （SVZ） in cerebral ischemia-reperfusion injury model rats； To explore the mechanism of promoting the proliferation of NSCs Methods Eighty male SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group， edaravone group and DLXNF group. The focal cerebral ischemia reperfusion injury models were prepared by suture method， and 7 d after reperfusion， the SVZ brain tissue of ischemia side was taken. The proliferation of cells was detected by Brdu labeling fluorescence immunocytochemistry； Hes1， Hes5 mRNA and protein expressions were detected by fluorescence real-time quantitative PCR and Western blot method in each group. Results Compared with the sham-operation group， Brdu positive cell rate in other groups increased more obviously， and the expressions of Hes1， Hes5 mRNA and protein also increased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， Brdu positive cell rate increased significantly in edaravone group and DLXNF group， and the expressions of Hes1， Hes5 mRNA and protein increased significantly

（P<0.01）. The expression of Hes1 mRNA in DLXNF group was superior to that in edaravone group （P<0.01）， and other indexes had no significant difference. Conclusion DLXNF can promote the proliferation of NSCs in SVZ in cerebral ischemia-reperfusion injury model rats， and up-regulate the expressions of Hes1 and Hes5， whose mechanism may be related to the activation of Notch signaling pathway.

Key words： Danlong Xingnao Formula； sub ventricular zone； neural stem cell； proliferation； Hes1； Hes5； rats

腦卒中已成為當(dāng)前威脅人類(lèi)健康的第二大病因，其中缺血性腦卒中的發(fā)病率約占全部腦卒中2/3[1]，具有發(fā)病率、病死率和致殘率“三高”的特點(diǎn)。腦缺血后，神經(jīng)元大量丟失導(dǎo)致腦功能障礙，遺留不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀甚至肢體癱瘓。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）的發(fā)現(xiàn)使之成為腦缺血后神經(jīng)再生研究的新靶點(diǎn)。目前研究表明，腦缺血損傷能促使腦內(nèi)NSCs激活后增殖、遷移和分化，參與神經(jīng)再生和腦組織功能的恢復(fù)[2]。同時(shí)該過(guò)程受多種細(xì)胞信號(hào)通路和因子的調(diào)控，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Wnt與Notch信號(hào)通路是NSCs增殖作用機(jī)制的研究熱點(diǎn)[3]。丹龍醒腦方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)周小青教授治療缺血性腦血管病有效復(fù)方，功擅活血通絡(luò)、化痰開(kāi)竅、補(bǔ)腎生髓。前期實(shí)驗(yàn)研究顯示，本方能干預(yù)腦缺血后級(jí)聯(lián)反應(yīng)多環(huán)節(jié)，保護(hù)腦功能以促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)[4]，促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及干細(xì)胞增殖，并且可能與激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)采用線(xiàn)栓法制備腦缺血再灌注大鼠模型，觀(guān)察再灌注7 d后大鼠側(cè)腦室室管膜下區(qū)（sub ventricular zone，SVZ）NSCs增殖，以及對(duì)Notch信號(hào)通路的重要效應(yīng)分子Hes1、Hes5表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討本方對(duì)腦缺血后促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性2月齡清潔級(jí)SD大鼠120只，體質(zhì)量250～300 g，湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)公司提供，許可證號(hào)SCXK（湘）2013-0005。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開(kāi)始造模。

1.2 藥物

丹龍醒腦方由丹參15 g、三七12 g、地龍6 g、遠(yuǎn)志15 g、石菖蒲12 g、淫羊藿10 g、菟絲子12 g組成，飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。浸泡30 min，首煎加6倍水，水沸后文火煎60 min，第2煎加3倍水，水沸后文火煎30 min，2次藥汁混合，過(guò)濾，于水浴鍋內(nèi)蒸發(fā)濃縮為含原藥材1.6 g/mL，滅菌分裝，4 ℃冰箱冷藏。依達(dá)拉奉注射液，國(guó)瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)80-140118。

1.3 主要試劑與儀器

5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu），Sigma；Brdu抗體（ab6326）、Hes1兔源性多克隆抗體（2922-1），EPI；Hes5兔源性多克隆抗體（194111），abcam；熒光二抗CY3-山羊抗小鼠抗體（115-165-003）、HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體（GB23303）、Actin兔源性多克隆抗體（GB13001-1），武漢谷歌生物科技公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（#K1622），Thermo；引物（Invitrogen Biotechnology Co，LTD）；Trizol試劑盒（15596-026），Invitrogen Life Technologies。7300型熒光定量PCR儀（ABI），倒置熒光顯微鏡及彩色圖像分析系統(tǒng)（NIKON），AlphaEase FC專(zhuān)業(yè)灰度分析軟件（Innotech），線(xiàn)身直徑為0.28 mm成品MCAO線(xiàn)栓若干（北京西濃科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組

80只大鼠被毛染色法編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組12只和模型制備組68只。因本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛嬖谝欢ㄋ劳雎?，模型制備組于造模后，根據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分等級(jí)采取分層抽樣的形式均分為模型組、依達(dá)拉奉組（依達(dá)組）、丹龍醒腦方組（丹龍組），每組12只。

2.2 局灶性腦缺血再灌注模型制備及評(píng)價(jià)

參考文獻(xiàn)[7]方法，復(fù)制局灶性腦缺血再灌注大鼠模型。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，頸部常規(guī)備皮消毒，頸正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）、頸外動(dòng)脈（ECA）。結(jié)扎CCA近心端及ECA，在CCA結(jié)扎上近心端約0.5 cm處剪一切口，將線(xiàn)栓蘸取肝素后，由切口向頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢插入ICA，向入顱方向推進(jìn)，至有輕微阻力感停止[（18.0±0.5）mm]，扎緊并固定線(xiàn)栓，縫合皮下組織和皮膚。記錄插線(xiàn)時(shí)間，插線(xiàn)2 h后再次將大鼠麻醉，用直頭鑷夾住露出皮膚的栓線(xiàn)尾部柔和緩慢抽出，當(dāng)栓線(xiàn)球前端遇到頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎線(xiàn)時(shí)會(huì)有阻力，即停止拔線(xiàn)，剪除栓線(xiàn)的殘余末端。假手術(shù)組僅分離動(dòng)脈，不插線(xiàn)栓，全過(guò)程同其余組。術(shù)后再灌注24 h動(dòng)物完全清醒后，采用Zea-Longa等5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分并記錄[7]，評(píng)分為1～3者為成功模型，評(píng)分后按前述要求進(jìn)行分組。

2.3 給藥及取材

大鼠再灌注24 h后開(kāi)始給藥，每日1次，連續(xù)給藥7 d。丹龍組每日給藥劑量按70 kg成人每日服用82 g原藥材劑量進(jìn)行換算[8]，得出每日原藥材劑量約為7.4 g/kg。依達(dá)組每日給藥劑量約為3.2 mg/kg，用0.9%氯化鈉溶液配制腹腔注射給藥。假手術(shù)組和模型組予等體積蒸餾水灌胃。每組取6只于第7日給藥2 h后，10%水合氯醛麻醉，頸動(dòng)脈處死后迅速斷頭取腦，冰上快速分離缺血側(cè)SVZ腦組織，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）、Western blot檢測(cè)。其余大鼠于術(shù)后24 h給予腹腔注射Brdu 100 mg/kg，1次/d，連續(xù)7 d。于第7日注射藥物2 h后，麻醉，常規(guī)生理鹽水、4%多聚甲醛心臟灌流至肝臟變硬后斷頭，迅速取缺血側(cè)SVZ腦組織，放入4%多聚甲醛固定液中，脫水、透明、浸蠟，在視交叉前后連續(xù)制作厚度為5 ?m腦部冠狀切片，用于免疫熒光法檢測(cè)。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 免疫熒光法檢測(cè)室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖 常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2-甲醇室溫孵育30 min，微波修復(fù)，10%羊血清濕盒內(nèi)37 ℃孵育30 min，一抗Brdu抗體1∶100稀釋?zhuān)瑵窈袃?nèi)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗CY3-羊抗兔IgG 1∶300稀釋?zhuān)瑵窈袃?nèi)37 ℃孵育45 min，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。各步均用PBS震蕩漂洗3次，防淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。細(xì)胞核染色為藍(lán)色，細(xì)胞核出現(xiàn)紅色熒光者為Brdu陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)觀(guān)察5個(gè)不重疊高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%）。陽(yáng)性細(xì)胞百分率越高表示增殖細(xì)胞越多。

2.4.2 PCR檢測(cè)室管膜下區(qū)Hes1、Hes5 mRNA表達(dá) 分離0.1 g SVZ腦組織，應(yīng)用Trizol試劑盒提取總RNA，以紫外分光光度計(jì)A280、A260定量測(cè)定濃度；將總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見(jiàn)明顯的2條區(qū)帶（28 s、18 s），證明其完整性。以組織總mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，60 ℃退火，用SYBR法進(jìn)行RT-qCR。Taq酶催化，95 ℃預(yù)熱10 min后，40個(gè)PCR循環(huán)。采用2-ΔΔCt法，以2-ΔΔCt值反映目的基因表達(dá)水平，其數(shù)值越大，基因表達(dá)越強(qiáng)。各基因引物序列見(jiàn)表1。

2.4.3 Western blot檢測(cè)室管膜下區(qū)Hes1、Hes5蛋白表達(dá) SVZ腦組織經(jīng)蛋白質(zhì)抽提劑提取蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗4 ℃過(guò)夜，Hes1及β-actin稀釋比例均為1∶1000，Hes5稀釋比例為1∶2000；洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗山羊抗兔抗體，稀釋比例為1∶3000，室溫孵育1 h，加ECL膠片曝光后用AlphaEase FC軟件分析自身灰度值，以目的蛋白條帶灰度與管家蛋白β-actin條帶灰度的比值表示蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示。多組間比較采用方差分析，方差齊時(shí)選用LSD法，方差不齊時(shí)采用Tamhane's T2檢驗(yàn)法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 丹龍醒腦方對(duì)大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

與假手術(shù)組比較，其余各組SVZ Brdu陽(yáng)性細(xì)胞率明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，依達(dá)組、丹龍組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞率明顯增加（P<0.01）；丹龍組與依達(dá)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1、表2。

4.2 丹龍醒腦方對(duì)大鼠室管膜下區(qū)Hes1、Hes5 mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，其余各組Hes1、Hes5 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.01）；與模型組比較，依達(dá)組、丹龍組Hes1、Hes5 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.01）；依達(dá)組與丹龍組比較，Hes1 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而Hes5 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

4.3 丹龍醒腦方對(duì)大鼠室管膜下區(qū)Hes1、Hes5蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，其余各組Hes1、Hes5蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.01）；與模型組比較，依達(dá)組、丹龍組Hes1、Hes5蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.01）；依達(dá)組與丹龍組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3、圖2。

5 討論

NSCs廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)，在成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在2個(gè)聚集區(qū)：海馬齒狀回的顆粒下層和SVZ[9]。NSCs生理狀態(tài)下多處于“靜息”狀態(tài)，在缺血或創(chuàng)傷性損傷刺激下，NSCs可被激活，通過(guò)對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)分裂增殖，進(jìn)一步分化成熟為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞，并遷移到大腦皮質(zhì)的顆粒層，最終整合到神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中修復(fù)神經(jīng)損傷，即神經(jīng)再生。然而內(nèi)源性NSCs的增殖數(shù)量有限，不足以進(jìn)行自我代償和修復(fù)。因此，促進(jìn)內(nèi)源性NSCs活化，恢復(fù)和重建神經(jīng)功能成為目前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。研究表明，腦缺血后的神經(jīng)再生受多種調(diào)節(jié)因子和信號(hào)通路的調(diào)控，主要有Notch、Wnt、Shh信號(hào)通路等。各信號(hào)通絡(luò)之間并非孤立的，而是相互緊密聯(lián)系，共同構(gòu)成了一個(gè)影響神經(jīng)再生的精密網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)[3]。Notch信號(hào)通路是通過(guò)相鄰細(xì)胞4種Notch受體（Notch1～4）與5種配體（Jagged1、2和Delta1、3、4）的結(jié)合，引起受體多次水解后釋放其胞內(nèi)域（NICD）而活化，NICD與CLS DNA結(jié)合蛋白結(jié)合后激活下游的效應(yīng)分子，主要是Hes等靶基因[10]。Hes屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族，包括Hes1～7共7個(gè)同源基因，其中Hes1/5是Notch信號(hào)通路的重要效應(yīng)分子，在干細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程中扮演重要角色。上調(diào)Hes1表達(dá)可抑制NSCs分化為神經(jīng)元，促進(jìn)增殖，若Hes1基因的缺失，可見(jiàn)神經(jīng)元的分化明顯增加[11]。Hes5也是各調(diào)控因子調(diào)控NSCs增殖的目的基因。如果敲除Notch的效應(yīng)分子Hes1、Hes5，可明顯觀(guān)察到中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)幾乎所有的NSCs都過(guò)早地分化為神經(jīng)元[12]。因此，Hes1、Hes5對(duì)調(diào)控NSCs增殖具有重要作用，能反映Notch通路的激活狀態(tài)。

有研究顯示，成年大鼠腦缺血后NSCs增殖在7～10 d達(dá)高峰[13]，之后逐漸回落。Notch信號(hào)通路在正常情況下低表達(dá)，而腦缺血后可促進(jìn)其通路組分的表達(dá)[14]。本研究采用線(xiàn)栓法成功建立MCAO/R大鼠模型，通過(guò)Brdu免疫熒光法觀(guān)察腦缺血再灌注7 d后丹龍醒腦方對(duì)大鼠SVZ NSCs增殖，并檢測(cè)Hes1、Hes5 mRNA和蛋白表達(dá)，探討Notch信號(hào)通路在其中的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹龍醒腦方干預(yù)后在缺血后SVZ NSCs增殖明顯增多，即陽(yáng)性細(xì)胞率增加，與之前研究結(jié)果一致[6]；與假手術(shù)組、模型組比較，丹龍組和依達(dá)組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞率明顯增加，同時(shí)Hes1、Hes5蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且不同分子水平其趨勢(shì)基本一致，提示丹龍醒腦方可上調(diào)SVZ Hes1、Hes5表達(dá)水平，促進(jìn)NSCs增殖的機(jī)制可能與調(diào)控Notch信號(hào)通路有關(guān)。此外，各條信號(hào)通路之間存在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，已知Hes1、Hes5是Notch信號(hào)通路主要靶基因，而其他信號(hào)通路也可能通過(guò)交叉網(wǎng)絡(luò)間接發(fā)揮作用。比如Notch通路與Wnt、Shh等信號(hào)通路存在的“crosstalk”（串話(huà)）[3]，Notch與Wnt兩通路之間關(guān)系復(fù)雜，既相互制約又相互促進(jìn)，Wnt途徑的激活減少Notch信號(hào)通路下游靶基因Hes1、Hes5的表達(dá)；Notch的激活又降低β-catenin積累，通過(guò)內(nèi)吞接頭蛋白Numb抑制Wnt通路[15]。Shh信號(hào)通路可以通過(guò)Smo調(diào)控Hes1的表達(dá)，Hes1是聯(lián)系Notch及Shh信號(hào)通路的一個(gè)重要網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)[16]。因此，有待下一步探討本方對(duì)Notch信號(hào)通路上的受體、配體及其他相關(guān)分子的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證是否激活Notch信號(hào)通路。

丹龍醒腦方中丹參為君，田七、遠(yuǎn)志、石菖蒲為臣，佐以地龍、淫羊藿、菟絲子。全方通補(bǔ)兼施，以通為主，共奏活血通絡(luò)、化痰開(kāi)竅、補(bǔ)腎生髓之功。孟氏等[17]研究顯示，益氣活血方和補(bǔ)腎生髓方能通過(guò)增強(qiáng)缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)Hes1和Hes5的表達(dá)，調(diào)節(jié)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。另外，現(xiàn)代藥理研究表明，大鼠腦缺血后應(yīng)用丹參酮[18]、三七總皂苷[19]、淫羊藿及其提取物[20]等均能促進(jìn)NSCs增殖。

綜上所述，丹龍醒腦方能促進(jìn)腦缺血后SVZ NSCs增殖，其機(jī)制與通過(guò)上調(diào)Hes1、Hes5水平有關(guān)，可能通過(guò)激活Notch信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。但由于γ-分泌肽酶抑制劑DAPT（Notch通路阻滯劑）有明顯腸道毒性，且參與體內(nèi)多個(gè)信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，其應(yīng)用造成如癡呆樣的不良反應(yīng)，嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)的觀(guān)察。因此，本研究未設(shè)置Notch通路抑制劑對(duì)照組，有待今后體外研究進(jìn)一步驗(yàn)證。該通路上游的配體和受體等其他組成成分表達(dá)情況未進(jìn)行觀(guān)察，與Notch通路直接相關(guān)及相關(guān)的程度也有待今后進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2015-08-10；編輯：華強(qiáng)）