短時間機(jī)械循環(huán)壓力對3D培養(yǎng)脊柱終板軟骨細(xì)胞的影響

短時間機(jī)械循環(huán)壓力對3D培養(yǎng)脊柱終板軟骨細(xì)胞的影響

張巍，徐宏光，俞云飛

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院脊柱外科，安徽蕪湖241001)

【摘要】目的：探究短時間的機(jī)械循環(huán)壓力對終板軟骨細(xì)胞的影響，并探討其機(jī)制。方法：大鼠終板軟骨細(xì)胞的分離制備大鼠終板軟骨細(xì)胞瓊脂糖模板進(jìn)行培養(yǎng)，然后通過FX-5000T對大鼠終板軟骨細(xì)胞瓊脂糖模板加載短時間的機(jī)械循環(huán)壓力。通過活死染色對細(xì)胞進(jìn)行活死分析，通過RT-PCR和Western blotting檢測ANK基因表達(dá)。通過RT-PCR和ELISA檢測TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果：大鼠終板軟骨細(xì)胞加載短時間的機(jī)械循環(huán)壓力后ANK基因和TGF-β1表達(dá)量增加，加載短時間的機(jī)械循環(huán)壓力的實驗組跟實驗對照組活死染色沒有顯著改變。結(jié)論：短時間的壓力刺激下終板軟骨ANK基因和TGF-β1表達(dá)量上調(diào)抑制終板軟骨的退變，短時間的壓力刺激并不影響終板軟件細(xì)胞的活死。這個實驗結(jié)果可能在椎間盤退變的防治中提供一種新的方法。

【關(guān)鍵詞】短時間機(jī)械循環(huán)壓力；終板軟骨細(xì)胞；椎間盤；ANK基因；TGF-β1表達(dá)

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】【中圖號】R 681.5A

DOI【】10.3969/j.issn.1002-0217.2015.01.005

文章編號：1002-0217(2015)01-0030-03

收稿日期：2014-04-05

作者簡介：邱鈞(1963-)，男，副主任醫(yī)師，(電話)13505531206，(電子信箱)13505531206@163.com.

文章編號：1002-0217(2015)01-0021-05

收稿日期：2014-08-08

作者簡介：強(qiáng)娣(1980-),女，住院醫(yī)師，碩士，(電話)15855971687,(電子信箱)qd-1980@163.com.

Short-term effects on the 3D cultured spinal endplate chondrocytesinvitroby cyclic mechanical stimulationZHANGWei,XUHongguang,YUYunfei

Department of Orthopedic Surgery,Yijishan Hospital,Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Abstract【】Objective： To investigate the mechanisms and short-term impact on the 3D cultured spinal endplate chondrocytes in vitro by exerting cyclic mechanical stimulation.Methods:The endplate chondrocytes were isolated from rats and cultured in agarose constructs for 48 hours.Then FX-5000TTM Flexercell? Tension PlusTM unit was applied to exert short-term cyclic mechanical stimulation on the cultured chondrocytes.Endplate chondrocytes viability was determined with LIVE/DEAD viability/cytotoxicity kit,and ANK gene expression was examined by RT-PCR and Western blot.Both RT-PCR and ELISA were performed to measure TGF-β1 expression.Results:Short-term cyclic mechanical stimulation increased the ANK gene and TGF-β1 expression in rat endplate chondrocytes.Live/Dead assay verified that the non-loading (NC) group and experimental group had no change in viability following the application of short-term cyclic mechanical compression.Conclusion:Short-term cyclic mechanical stimulation increased the ANK gene and TGF-β1 expression in endplate chondrocytes and inhibited the cartilage degeneration of endplate,yet failed to cause viability of the chondrocytes.The findings suggest that this may be a new approach to treatment of the intervertebral disc degeneration.

【Key words】 short-term cyclic mechanical stimulation;end-plate chondrocytes;intervertebral disc degeneration;ANK gene;TGF-β1 expression

椎間盤由椎體間的薄層透明軟骨與髓核及纖維環(huán)組成，是人體內(nèi)最大的無血管組織，對維持椎體的正常功能形態(tài)和營養(yǎng)交換以及保護(hù)椎間盤應(yīng)對外界力學(xué)刺激等方面均起著非常重要的作用。終板軟骨途徑作為椎間盤的主要營養(yǎng)通路，主要通過椎體的骨髓腔-血竇-軟骨終板彌散途徑來獲取營養(yǎng)。終板途徑的營養(yǎng)障礙最終會導(dǎo)致椎間盤的退變[1-2]。在椎間盤退變模型中不穩(wěn)定的機(jī)械刺激作用于頸椎或腰椎可觀測到終板軟骨的異常鈣化，提示終板鈣化參與椎間盤退變過程中[3-4]。因此，我們推斷椎間盤終板軟骨鈣化可能與椎間盤所受的力學(xué)刺激相關(guān)。眾所周知，ANK基因作為軟骨鈣化相關(guān)基因?qū)τ谲浌氢}化起著非常重要的作用，而TGF-β1作為細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡中非常重要的細(xì)胞因子，在終板軟骨的鈣化中也起著重要的作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)長時間的間歇循環(huán)張力可以通過TGF-β1下調(diào)終板軟骨ANK基因mRNA和蛋白表達(dá)水平[12]，而體外短時間張力的機(jī)械刺激可以通過TGF-β1-p38-MAPK通路調(diào)控終板軟骨ANK基因的表達(dá)[15]，但壓力刺激對于其作用仍不明確。因此,在研究中,我們通過觀察體外3D培養(yǎng)的終板軟骨細(xì)胞加載短時間的間歇機(jī)械循環(huán)壓力后TGF-β1及ANK的表達(dá)，檢測短時間機(jī)械刺激對終板軟骨細(xì)胞鈣化的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物10只清潔級SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量(160±20)g(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)，合格證號：SCXK(滬)2003-0004。

1.1.2試劑和儀器胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶(美國Sigma-A1drich)，DMEM/F12(美國Hyclone)，胎牛血清(美國GlBICO)，Cell Counting Kit-8(CCK-8，Dojind)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和ECL發(fā)光液(上海碧云天公司)，ANK及GAPDH兔抗大鼠多克隆抗體(CST)，羊抗兔辣根過氧化物酶lgG(上海碧云天公司)，Nano-Drop 2000 (美國Thermo & Scintific)細(xì)胞計數(shù)儀和TRIzol(美國Invitrogen)，實時PCR試劑盒(中國TOYOBO);實時PCR儀(德國RocheLightCycler480)PCR反應(yīng)體系和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas,USA)，PCR儀(德國Eppendorf),倒置熒光顯微鏡TE2000-U(日本 Nikon)牽張力系統(tǒng)Flexcell FX-5000TM(美國 Flexcell International Corporation)，BioFlexTM多向加力板(美國Flexcell International Corporation)。

1.2方法

1.2.1大鼠終板軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)取SD大鼠10只。采取斷頸法處死，然后浸泡于75%乙醇消毒10 min。以下步驟均超凈臺中實施，取出整個大鼠脊椎，取下L1～L5，削去髓核及纖維環(huán)，提取所有的終板軟骨。用含青霉素和鏈霉素的PBS液(終濃度為青霉素 50 U/mL和鏈霉50 μg/mL)沖洗 2遍，用眼科剪剪碎，骨塊控制在約1 mm×1 mm× 1 mm大小，吸除PBS。用 0.2%的Ⅱ型膠原酶室溫消化10 min后，放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)消化4 h，收集所有消化液，并用120目不銹鋼濾篩網(wǎng)過濾懸濁液，將過濾后的液體離心10 min(1 000 r/min)，吸除上清液，并用PBS漂洗2次，加入8 mL含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)。然后將收集的細(xì)胞，用DMEM/F12(20%FBS)反復(fù)吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，按2×105/mL密度均勻種植于10 cm2培養(yǎng)皿中，再將其放入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞增殖融合為層時進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳至第二代(P2)后終止傳代。吸除所有培養(yǎng)液，并PBS清洗，再取0.25%胰蛋白酶2 mL加入培養(yǎng)皿，37°C孵育1～2 min，后加入10%胎牛血清2 mL以終止胰酶消化，離心10 min(1 000 r/min)收集細(xì)胞。

1.2.2 制備大鼠終板軟骨細(xì)胞瓊脂糖模板取收集的P2終板軟骨細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞計數(shù)后加入含有1%雙抗和0.29 mg/mL谷酰胺的培養(yǎng)基，使瓊脂糖溶液在37°C時達(dá)到每mL 107個細(xì)胞。細(xì)胞瓊脂糖于室溫下在一個專門設(shè)計的模具內(nèi)膠凝10 min，細(xì)胞瓊脂糖模板(直徑8 mm,厚1.5 mm)。

1.2.3細(xì)胞的3D培養(yǎng)和加載循環(huán)機(jī)械壓力終極軟骨細(xì)胞(P2)瓊脂糖的模板放置在FlexCell壓力專用的加力板中央進(jìn)行培養(yǎng)48 h后，實驗組的軟骨細(xì)胞瓊脂糖模板通過FX-5000T加載1Hz 10%的機(jī)械循環(huán)壓力，分別加載了20 min和40 min。細(xì)胞培養(yǎng)于37°C、5%CO2，細(xì)胞經(jīng)機(jī)械循環(huán)壓力加載后收集。

1.2.4ELISA分析收集對照組和加載了機(jī)械循環(huán)壓力的實驗組培養(yǎng)板上清液，使用ELISA法進(jìn)行TGF-β1的檢測。

1.2.5細(xì)胞活死分析將收集的細(xì)胞瓊脂糖模板通過丙酮固定后進(jìn)行蔗糖梯度脫水，將脫水后的終板軟骨細(xì)胞模板進(jìn)行O.C.T.包埋后冰切。切片后的細(xì)胞通過活死染色進(jìn)行分析。

1.2.6RNA提取和實時PCR取出加力板內(nèi)的瓊脂糖模板，用PBS沖洗2次，加入Trlzol，按照說明書提取RNA。首先將樣品使用玻璃攪拌器短暫攪拌混勻，然后在室溫下孵育5 min。加入氯仿混合30 s后,通過離心法(12 000 g,15 min,4°C)將混合物分離成上層水相下層酚氯仿相，上層清液轉(zhuǎn)移到一個新的EP管后,添加異丙醇室溫孵育15 min沉淀后離心(12 000 g，10 min，4°C)提取RNA和瓊脂糖混合物，75%乙醇清洗和-80°C過夜后室溫下晾干，然后加入焦碳酸二乙酯搖勻后離心(12 000 g,15 min,4°C)，從瓊脂糖中提取出RNA是用于分析基因表達(dá)。實時PCR：檢測Ⅱ型膠原、Sox-9、蛋白多糖轉(zhuǎn)錄因子和Ank的表達(dá)變化。

1.2.7Western blotting 檢測取出的終板軟骨細(xì)胞瓊脂糖模板用PBS沖洗2次后置于0.125 mol/L Tris-HCl、5%SDS緩沖液、10%2-巰基乙醇、20%蔗糖、0.04%溴酚藍(lán)(每個模板100 μL緩沖液) 中加熱至100°C 5 min，后-80°C過夜,過夜后離心(12 000 g,10 min,4°C)分離蛋白溶液。BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，用0.22 μm孔徑的PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1 h，一抗4°C過夜，然后用0.05%TBST洗10 min，一共3次；二抗室溫孵育1 h，0.05%TBST洗3次，常規(guī)ECL發(fā)光液顯色。

表1實時PCR引物列表

Tab 1Sequences of primers used in the realtime RT-PCR

引物序列(5'→3')產(chǎn)物長度(bp)GAPDH上游:CTCAACTACATGGTCTACATGTTC-CA81下游:CTTCCCATTCTCAGCCTTGACTⅡ型膠原上游:CCTGAAACTCTGCCACCCAG151下游:GTTCTTCCGAGGCACAGTCG蛋白多糖上游:ACACCCCTACCCTTGCTTCT124下游:AAAGTGTCCAAGGCATCCACSox-9上游:CGTCAACGGCTCCAGCA69下游:TGCGCCCACACCATGAANK上游TTCAAGATCCTGGACCGAGTGAC142下游:AGACACCATCCTGGCGAGTTTC

注：ANK 鈣化相關(guān)蛋白；GAPDH:磷酸甘油醛脫氫酶

1.3統(tǒng)計學(xué)分析多組間采用F檢驗，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞活死分析細(xì)胞活死染色的結(jié)果顯示，實驗組和對照組終板軟骨細(xì)胞的存活率沒有顯著差異(圖1)。

2.2ELISA分析對收集的培養(yǎng)板上清液，使用ELISA法進(jìn)行TGF-β1檢測，分別比較實驗組與對照組、加載20 min和40 min的機(jī)械循環(huán)壓力的實驗組，結(jié)果顯示短時間的機(jī)械循環(huán)壓力的刺激下終板軟骨細(xì)胞的TGF-β1的表達(dá)量呈上升的趨勢(F=22.576 7,P<0.05),見圖2。

After the application of ICMC,LIVE/DEAD assay,there is no significant viability of endplate chondrocytes of NC groups,20 min groups and 40 min groups.Original magnification:100×,n=3.NC indicates nonloading;ICMC,intermittent cyclic mechanical compress

圖1加載機(jī)械循環(huán)壓力20 min、40 min后，細(xì)胞活死染色的倒置相差顯微鏡×100觀察比較(n=3)

Fig 1 The changes of endplate chondrocytes after loading of ICMC

The columns represent themean±SE.*P< 0.05

圖2ELISA法檢測實驗對照組、加載20 min和40 min的機(jī)械循環(huán)壓力的實驗組的TGF-β1(n=3)

Fig 2The result of ELISA showed up-regulation of TGF- β 1 expression after 20 min and 40 min ICMC

2.3實時PCR實時PCR結(jié)果表明，加載循環(huán)壓力20 min和40 min的實驗組中，Ⅱ型膠原的mRNA水平表達(dá)明顯高于對照組(1.44±0.08、1.92±0.20、1.04±0.01，P<0.05)，ANK的mRNA水平表達(dá)明顯高于對照組(1.42±0.09、2.10±0.33、1.05±0.03，P<0.05)，見表2。

基因?qū)φ战M20min40minF值P值TypeⅡ1.04±0.011.44±0.08*1.92±0.20*37.70420.0004Aggrecan1.16±0.091.39±0.08*2.03±0.39*11.29010.0092SOX-91.10±0.031.62±0.14*1.85±0.13*38.63520.0003ANK1.05±0.031.42±0.09*2.10±0.33*21.87400.0016

注：與對照組相比，*P<0.05

2.4Western blottingWestern blotting檢測結(jié)果顯示，分別加載機(jī)械循環(huán)壓力20 min和40 min的實驗組，ANK的表達(dá)量都明顯高于實驗對照組。

圖33組終板軟骨細(xì)胞中ANK基因的蛋白表達(dá)量(n=3)

Fig 3The ANK expression of both protein were increased after 20 min and 40 min ICMC(n=3)

3討論

頸肩痛、腰腿痛的主要原因——椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是脊柱退行性疾病發(fā)生的始動因素。隨著年齡的增長，人椎間盤退變的程度也在逐漸加深，其主要表現(xiàn)為髓核中細(xì)胞數(shù)的減少，基質(zhì)的降解以及終板軟骨鈣化的形成[7]。軟骨終板作為位于椎間盤與椎體間的薄層透明軟骨，是椎間盤的主要營養(yǎng)途徑，對于椎間盤的營養(yǎng)提供以及力學(xué)性能的維持都具有十分重要的作用。大量研究表明[8-9]，對脊椎施加異常應(yīng)力刺激可以誘導(dǎo)軟骨終板及椎間盤出現(xiàn)退變現(xiàn)象，而在此異常應(yīng)力刺激下，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打破，基質(zhì)中成分出現(xiàn)了急劇變化，進(jìn)而引起終板軟骨鈣化，致使終板軟骨的生物學(xué)功能結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，削弱其吸收振蕩和均勻傳遞載荷的能力，導(dǎo)致終板軟骨退變。終板軟骨細(xì)胞中Shahin等[10]通過對人類組織工程軟骨施加一個靜態(tài)的機(jī)械壓力(軸向應(yīng)變6.5%)2.5周后，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞中的粘多糖和Ⅱ型膠原合成量明顯增多。堿性磷酸鈣(BCP)作為軟骨內(nèi)異常鈣化重要的鈣鹽類型，其存在3種形式，羥基磷灰石(HA)、碳酸磷灰石、磷酸八鈣，而羥基磷灰石(HA)是終板軟骨鈣化中的主要鈣鹽亞型。焦磷酸作為一種鈣鹽形成的有效抑制劑，可以抑制軟骨中鈣鹽的形成，其生成過少將導(dǎo)致堿性磷酸鈣(BCP)的形成，從而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞鈣化現(xiàn)象的發(fā)生。ANK蛋白作為一種陰離子通道，廣泛存在于終板軟骨細(xì)胞上，其作為一種多次跨膜蛋白，可以將細(xì)胞內(nèi)的焦磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，同時通過細(xì)胞外焦磷酸酶將核苷酸分解生成焦磷酸，起到非常重要的抑制礦化調(diào)控作用。Ho等[11]通過觀察ANK基因突變的老鼠發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)內(nèi)和周圍存在大量堿性磷酸鈣沉積，誘導(dǎo)骨贅形成，破壞關(guān)節(jié)軟骨的正常結(jié)構(gòu)功能，最后因不能活動而致死。我們前期工作[12]也發(fā)現(xiàn)，間歇循環(huán)張力可以通過改變TGF-β1來調(diào)控ANK基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)大鼠終板軟骨細(xì)胞鈣化現(xiàn)象的發(fā)生，而在終板軟骨退變過程中的間歇機(jī)械壓力以及與ANK基因的相互作用，尚不十分清楚。本實驗通過對大鼠終板軟骨細(xì)胞加載短期機(jī)械循環(huán)壓力刺激，觀察終板軟骨細(xì)胞變化發(fā)現(xiàn)，隨著壓力刺激時間的延長，軟骨標(biāo)志基因Ⅱ型膠原、蛋白多糖、轉(zhuǎn)錄因子Sox-9以及ANK基因的表達(dá)水平也呈現(xiàn)時間依賴性的增高趨勢，與上述研究結(jié)果一致。由此，我們認(rèn)為在短期的機(jī)械循環(huán)壓力刺激下，終板軟骨細(xì)胞中的ANK基因存在一種類似快速應(yīng)激機(jī)制。由于焦磷酸不能正常通過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞外，壓力刺激下合成增加的ANK蛋白，可以將細(xì)胞內(nèi)生成的焦磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，從而抑制細(xì)胞外堿性磷酸鈣的沉積，并抑制軟骨細(xì)胞的鈣化進(jìn)程。

TGF-β1作為一種重要的細(xì)胞生長因子，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)合成，從而有效阻止和修復(fù)軟骨的損傷，但其過度的表達(dá)可以誘導(dǎo)骨贅的形成，如果其表達(dá)過少，則促使軟骨基質(zhì)降解。Davidson等[13]通過對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，在正常膝關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)TGF-β1表達(dá)很高，而在發(fā)生退變的軟骨中表達(dá)很低。Derfus等[14]發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞內(nèi)的TGF-β1可以刺激細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外焦磷酸明顯增多。TGF-β1可通過上調(diào)ANK基因的表達(dá)，阻止細(xì)胞外堿性磷酸鈣結(jié)晶的沉積。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)[12]，內(nèi)源性TGF-β1可以刺激終板軟骨細(xì)胞內(nèi)ANK基因表達(dá)水平的增加；同時在機(jī)械循環(huán)張力誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞鈣化的過程中，內(nèi)源性TGF-βl與ANK基因的表達(dá)均呈現(xiàn)明顯的刺激時間依賴性下調(diào)，而在機(jī)械循環(huán)壓力條件下，兩者的變化及相互作用尚不明確。本實驗通過對大鼠終板軟骨細(xì)胞加載短期機(jī)械循環(huán)壓力刺激，觀察終板軟骨細(xì)胞變化發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以明顯刺激細(xì)胞內(nèi)ANK基因的表達(dá)上調(diào)，同時隨著壓力刺激時間的延長，內(nèi)源性TGF-β1呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢。我們推測短期的機(jī)械循環(huán)壓力對于終板軟骨細(xì)胞表型的維持起著極其重要的作用，可以上調(diào)標(biāo)志基因Ⅱ型膠原、蛋白多糖、轉(zhuǎn)錄因子Sox-9的表達(dá)，同時可以上調(diào)內(nèi)源性TGF-β1的表達(dá)增加，從而調(diào)節(jié)ANK基因的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞外焦磷酸生成的增加，抑制細(xì)胞外堿性磷酸鈣結(jié)晶沉積，進(jìn)而阻礙細(xì)胞鈣化進(jìn)程，兩者之間具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明對脊柱終板軟骨細(xì)胞進(jìn)行較短時間的機(jī)械循環(huán)壓力刺激后細(xì)胞的ANK基因和TGF-β1表達(dá)量上調(diào)。較短時間的機(jī)械循環(huán)壓力刺激并不影響終板軟骨細(xì)胞的活死，同時通過上調(diào)TGF-β1來調(diào)控細(xì)胞ANK基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞外焦磷酸生成的增加，抑制細(xì)胞外堿性磷酸鈣結(jié)晶的沉積，進(jìn)而阻礙細(xì)胞鈣化現(xiàn)象的發(fā)生及發(fā)展，研究結(jié)果可以為椎間盤退變的治療提供一種新的方法。

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