周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)形態(tài)學(xué)改變及神經(jīng)生長因子含量的影響

周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)形態(tài)學(xué)改變及神經(jīng)生長因子含量的影響

姚鴻萍，封衛(wèi)毅*，魏友霞

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安710061)

摘要：目的觀察周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)形態(tài)學(xué)改變及神經(jīng)生長因子(NGF)含量的影響。方法采用鏈脲佐菌素糖尿病大鼠(STZ-D)模型，灌胃給藥8周，鋨酸染色觀察坐骨神經(jīng)形態(tài)變化，用ELISA法測(cè)定糖尿病大鼠血清中的NGF含量，用免疫組化法測(cè)定神經(jīng)組織中NGF含量。結(jié)果周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)改變有明顯保護(hù)作用；對(duì)血清NGF含量減少有明顯提高作用；對(duì)坐骨神經(jīng)組織中NGF的含量雖無明顯影響，但對(duì)坐骨神經(jīng)軸突內(nèi)NGF的減少有明顯的提高作用。結(jié)論周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變具有保護(hù)作用，對(duì)血清和坐骨神經(jīng)軸突內(nèi)NGF的減少具有明顯的提高作用。

關(guān)鍵詞：周絡(luò)通；糖尿病周圍神經(jīng)病變；神經(jīng)生長因子

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.017

中圖分類號(hào)：R965文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡介：姚鴻萍，女，碩士研究生，副主任藥師

收稿日期：(2015-03-22)

Effect of Zhouluotong on sciatic nerve morphology and nerve growth factor contents in streptozotocin-induced diabetic rats

YAO Hongping，F(xiàn)ENG Weiyi*，WEI Youxia (Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital， Health Science Center，

Xi′an Jiaotong University， Xi′an 710061， China )

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Zhouluotong on sciatic nerve morphology and nerve growth factor contents in streptozotocin-induced diabetic (STZ-D) rats with diabetic peripheral neuropathy (DPN). MethodsDrugs were administrated orally for 8 weeks continuingly after the streptozotocin treatment. Morphological changs in sciatic nerve were observed with histological staining. Nerve growth factor(NGF) contents in plasma and sciatic nerve tissues were determined with ELISA kit and immunohistochemical staining. ResultsMorphological degeneration in sciatic nerve， decrease of nerve growth factor concertration in rat plasma， as well as in nerve axis cylinder were ameliorated by oral administration of Zhouluotong to diabetic rats.Conclusion These observations suggested that Zhouluotong demonstrated curative effect on DPN in STZ-D rats.

Key words: Zhouluotong；diabetic peripheral neuropathy；nerve growth factor

*通信作者:封衛(wèi)毅，男，博士研究生，主任藥師

糖尿病神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病三大并發(fā)癥之一，其發(fā)病率和死亡率較高[1]，目前尚沒有特效的治療藥物。DPN的發(fā)生與體內(nèi)多種神經(jīng)體液代謝紊亂有關(guān)，其中神經(jīng)生長因子(nerve growth factor， NGF)含量異常是引起DPN的重要原因之一[2-4]。在周絡(luò)通臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，該藥對(duì)糖尿病患者的某些外周神經(jīng)并發(fā)癥，如:麻木、肢體感覺異常、疼痛等具有明顯的改善作用。而我們前期的研究發(fā)現(xiàn)[5]，周絡(luò)通對(duì)神經(jīng)組織多元醇代謝通路的增強(qiáng)具有明顯的抑制作用，并可降低神經(jīng)組織中損傷性多元醇物質(zhì)的生成。因此，本文以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠為模型，對(duì)周絡(luò)通防治DPN進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

1儀器與材料

1.1儀器MK3酶標(biāo)儀(上海雷勃分析儀器有限公司)；H8-202AN顯微鏡(美國Nikon公司)；Polaroid數(shù)字顯微照相機(jī)(Polaroid DMC公司)。

1.2試藥周絡(luò)通(河北以嶺醫(yī)藥研究院)；鏈脲佐菌素(Sigma公司)；甲鈷胺片(日本衛(wèi)材株式會(huì)社)；兔抗鼠神經(jīng)生長因子抗體(Santa Cruz公司)；二抗及SABC試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)公司)；大鼠神經(jīng)生長因子酶聯(lián)免疫試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3動(dòng)物Wistar大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量150～280 g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場提供，動(dòng)物合格證號(hào)：醫(yī)京動(dòng)字第3008號(hào)。

2方法

2.1動(dòng)物模型制備、分組和給藥將鏈脲佐菌素溶于0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液(pH 4.5)配成10 g·L-1的溶液，備用。取Wistar大鼠，分為空白對(duì)照組和造模組，造模組腹腔注射40 mmol·L-1的鏈脲佐菌素70～75 mg·kg-1，空白對(duì)照組注射相同劑量的檸檬酸緩沖液。給藥后72 h，從造模組大鼠的眼眶取血，測(cè)定血糖值，選擇血糖水平在16 mmol·L-1以上的動(dòng)物為模型成功動(dòng)物。將模型成功動(dòng)物隨機(jī)分為5組：模型組、甲鈷胺對(duì)照組(175 μg·kg-1)、周絡(luò)通6.0，3.0 和1.5 g·kg-1組。藥物溶解于5 g·L-1CMC-Na溶液中，大鼠每天灌胃給藥，給藥劑量0.01 mL·g-1，連續(xù)給藥8周?？瞻讓?duì)照組和模型組每天灌胃給予相同劑量的CMC-Na溶液。

2.2坐骨神經(jīng)病理變化的定性及定量觀察

2.2.1鋨酸染色及HE染色大鼠連續(xù)給藥8周后，取左側(cè)坐骨結(jié)節(jié)以下約3 cm的坐骨神經(jīng)，其中的1.5 cm放入40 mmol·L-1鋨酸溶液中染色12 h，用石蠟包埋并切片，以觀察坐骨神經(jīng)髓鞘的變化情況。另外的1.5 cm以1.33 mol·L-1甲醛溶液固定后，蘇木素-伊紅進(jìn)行染色(HE染色)，石蠟包埋并切片，以觀察坐骨神經(jīng)形態(tài)的變化。

2.2.2坐骨神經(jīng)形態(tài)的半定量觀察觀察鋨酸染色的坐骨神經(jīng)縱切面上25～30根有髓神經(jīng)纖維，統(tǒng)計(jì)發(fā)生神經(jīng)病變(結(jié)間隙增多、磷脂過度褶皺、節(jié)段性脫髓鞘、結(jié)周脫髓鞘、髓鞘發(fā)生潰變)的纖維數(shù)量，計(jì)算其占總纖維數(shù)的百分率[1]。在HE或鋨酸染色的坐骨神經(jīng)橫切面上，隨機(jī)取2～3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)神經(jīng)纖維最密集區(qū)0.025 mm×0.025 mm范圍內(nèi)的神經(jīng)纖維數(shù)。每一視野在不同方向上重復(fù)測(cè)3次，計(jì)算平均數(shù)[6]。

2.3大鼠血清中NGF的含量測(cè)定大鼠麻醉后，頸總動(dòng)脈取血并分離血清。依照NGF酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說明書上的操作方法進(jìn)行NGF含量測(cè)定。

2.4坐骨神經(jīng)組織中NGF的含量測(cè)定

2.4.1免疫組織化學(xué)染色(漂染ABC法)以1.33 mol·L-1甲醛固定的大鼠坐骨神經(jīng)石蠟切片，常規(guī)脫蠟，經(jīng)0.88 mol·L-1H2O2滅活、復(fù)合消化液酶修復(fù)、山羊血清封閉、一抗、二抗孵育后，加SABC試劑顯色，后漂洗、脫水，透明后封片。

2.4.2坐骨神經(jīng)組織中NGF的含量測(cè)定依據(jù)文獻(xiàn)中的方法[7]進(jìn)行：按照2.4.1中的方法進(jìn)行染色后，在橫向切片上，顯微鏡隨機(jī)選2個(gè)視野，數(shù)字顯微照相機(jī)采集圖像，對(duì)坐骨神經(jīng)著色分別進(jìn)行光密度分析，對(duì)比各組之間平均光密度值。另外，在每一坐骨神經(jīng)橫向切片上隨機(jī)選2個(gè)視野，每一視野觀察50根神經(jīng)纖維，根據(jù)髓鞘內(nèi)神經(jīng)軸突NGF染色由深、較深、淺到無染色的不同進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別按3，2，1和0進(jìn)行評(píng)分，統(tǒng)計(jì)各標(biāo)本的分值，并進(jìn)行組間比較。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化影響的定性觀察在鋨酸染色的坐骨神經(jīng)組織切片上，與空白對(duì)照組相比，模型組神經(jīng)纖維某些部位有神經(jīng)纖維發(fā)生潰變或斷裂現(xiàn)象；朗飛氏結(jié)的結(jié)間隙變寬；部分神經(jīng)纖維髓鞘局部發(fā)生腫脹；神經(jīng)髓鞘內(nèi)出現(xiàn)許多小塊狀類脂變性的凝集小塊，髓鞘在多數(shù)染色較淡，顯示存在一定的損傷反應(yīng)。周絡(luò)通6.0,3.0和1.5 g·kg-1組和甲鈷胺組均仍可見到有神經(jīng)纖維髓鞘變性發(fā)生，但較模型組有不同程度地減輕。結(jié)果見圖1。

圖1周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)的影響(×40)

A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.周絡(luò)通6.0 g·kg-1組； D.周絡(luò)通5.0 g·kg-1組；E.周絡(luò)通1.5 g·kg-1組

Fig.1 Effects of Zhouluotong on morphology of sciatic nerve in STZ-D rats(×40)

A.control group； B.model group； C.Zhouluotong group(6.0 g·kg-1)；D.Zhouluotong group(3.0 g·kg-1)； E.Zhouluotong group(1.5 g·kg-1)

3.2周絡(luò)通對(duì)STZ-D大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化影響的半定量觀察糖尿病大鼠模型組坐骨神經(jīng)纖維發(fā)生潰變等病變的比例明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)。而周絡(luò)通各給藥組和甲鈷胺組與模型組比較，均具有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)纖維變性發(fā)生率的影響

Tab.1 Effect of Zhouluotong on degeneration incidence in sciatic nerve of STZ-D rats

± s)

注：與模型組比較**P<0.01。

神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面上單位面積中的坐骨神經(jīng)纖維數(shù)明顯增多，神經(jīng)纖維直徑顯著縮小，表明糖尿病大鼠神經(jīng)纖維存在萎縮現(xiàn)象(P<0.01)。各給藥組大鼠的坐骨神經(jīng)纖維數(shù)少于模型組(P<0.05或P<0.01)，表明周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)纖維的萎縮具有一定的保護(hù)作用。結(jié)果見表2。

3.3周絡(luò)通對(duì)STZ-D大鼠血清中NGF含量的影響酶聯(lián)免疫方法測(cè)定結(jié)果表明，模型組糖尿病大鼠血清NGF含量為21.3±2.4 pg·mL-1，較正常組30.6±9.4 pg·mL-1有明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，周絡(luò)通6.0和3.0 g·kg-1組和甲鈷胺組血清NGF含量有明顯升高(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表2周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)的影響

Tab.2 Effect of Zhouluotong on the count of sciatic nerve fiber in STZ-D rats

± s)

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

表3周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠血清中NGF含量的影響

Tab.3 Effects of Zhouluotong on the contents of NGF in serum of STZ-D rats

± s, n=11)

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

3.4周絡(luò)通對(duì)STZ-D大鼠坐骨神經(jīng)組織NGF含量的影響

3.4.1免疫組織化學(xué)染色正常組大鼠坐骨神經(jīng)束髓鞘和髓鞘內(nèi)神經(jīng)軸突均被明顯深染，顯示神經(jīng)束髓鞘和髓鞘內(nèi)NGF含量較高。在神經(jīng)束之間可見到染色很深的Schwann細(xì)胞，表明Schwann細(xì)胞內(nèi)富含NGF。模型組大鼠的坐骨神經(jīng)橫切片上，被深染的Schwann細(xì)胞較少，神經(jīng)束髓鞘雖被染色，但髓鞘內(nèi)神經(jīng)軸突部位染色很淺甚至未染色，并出現(xiàn)許多空腔樣結(jié)構(gòu)。各給藥組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面上雖然被深染的Schwann細(xì)胞較少，但神經(jīng)束髓鞘明顯被染色；髓鞘內(nèi)神經(jīng)軸突染色雖然較淺，但顏色要深于模型組，空腔樣的纖維束數(shù)量較模型組明顯要少。表明周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)軸突內(nèi)NGF的減少有一定的抑制作用。結(jié)果見圖2。

圖2周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中NGF質(zhì)量濃度的影響(×40)

A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.周絡(luò)通6.0 g·kg-1組；D.周絡(luò)通3.0 g·kg-1組；E.周絡(luò)通1.5 g·kg-1組

Fig.2 Effects of Zhouluotong on the contents of NGF in sciatic nerve of STZ-D rats(×40)

A.control group； B.model group； C.Zhouluotong group(6.0 g·kg-1)； D.Zhouluotong group(3.0 g·kg-1)； E.Zhouluotong group(1.5 g·kg-1)

3.4.2坐骨神經(jīng)組織中NGF的含量測(cè)定對(duì)坐骨神經(jīng)橫斷面NGF免疫組織化學(xué)染色平均光密度測(cè)定結(jié)果顯示，模型組平均光密度值明顯小于正常組(P<0.01)。與模型組相比，各給藥組坐骨神經(jīng)NGF染色的平均光密度值無明顯變化(P>0.01)；坐骨神經(jīng)軸突內(nèi)NGF含量評(píng)分結(jié)果表明，模型組大鼠NGF含量評(píng)分明顯低于正常組(P<0.01)，與模型組比較，各給藥組NGF含量評(píng)分值明顯增加(P<0.05或P<0.01)，顯示周絡(luò)通對(duì)神經(jīng)束軸突內(nèi)的NGF含量有明顯升高作用。結(jié)果見表4。

表4周絡(luò)通對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中NGF含量和NGF含量評(píng)分的影響

Tab.4 Effects of Zhouluotong on the contents and scores of NGF in sciatic nerve of STZ-D rats

組別 劑量n平均光密度神經(jīng)軸突內(nèi)NGF評(píng)分空白對(duì)照組-8 0.196±0.019**128.1±10.7**模型組 -80.091±0.01381.0±16.8甲鈷胺 175μg·kg-180.092±0.019104.1±14.1**周絡(luò)通 6.0g·kg-190.089±0.018100.6±19.9*周絡(luò)通 3.0g·kg-180.088±0.01596.0±10.2*周絡(luò)通 1.5.g·kg-190.092±0.010100.9±11.5*

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

4討論

NGF是胚胎感覺、交感神經(jīng)生長發(fā)育必不可少的物質(zhì)，對(duì)成年神經(jīng)組織有營養(yǎng)作用。有人認(rèn)為NGF是經(jīng)神經(jīng)末梢逆轉(zhuǎn)運(yùn)至核周質(zhì)，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)絲蛋白 mRNA的合成、維持軸索直徑而發(fā)揮作用[8]。此外，NGF對(duì)神經(jīng)髓鞘的Schwann細(xì)胞也有調(diào)節(jié)作用[9]，可維持神經(jīng)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)功能的完整性，并能促進(jìn)神經(jīng)損傷后的再生。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病神經(jīng)病變患者和動(dòng)物的血液、組織中的NGF水平均明顯降低[10-11]，NGF在感覺和交感神經(jīng)軸索中的逆轉(zhuǎn)運(yùn)也降低[12]，這種NGF合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的缺陷在糖尿病時(shí)除可造成神經(jīng)的營養(yǎng)障礙外，還可能使神經(jīng)組織對(duì)其他的損傷因素更為敏感。此外，應(yīng)用外源性NGF和內(nèi)源性NGF刺激物可預(yù)防糖尿病神經(jīng)功能的改變。因此，NGF缺乏與DPN的發(fā)生密切相關(guān)。血清中的NGF含量反映了機(jī)體的NGF水平，神經(jīng)組織軸突內(nèi)NGF的含量反映神經(jīng)組織靶器官的NGF合成和輸送能力。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模8周后，糖尿病大鼠的外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減慢，并出現(xiàn)糖尿病外周神經(jīng)病變的一系列癥狀[5]。而該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模后8周，糖尿病大鼠血清中的NGF明顯下降，與模型組比較，周絡(luò)通6.0和3.0 g·kg-1組和甲鈷胺組可明顯增加血清NGF含量，顯示對(duì)DPN具有一定的防治效果。

與功能變化和生化指標(biāo)異常改變相比，鏈脲佐菌素所致的糖尿病大鼠的組織形態(tài)學(xué)改變程度稍輕一些，很難看到明顯的神經(jīng)纖維丟失或神經(jīng)纖維變性，但依然可見纖維變小、萎縮等現(xiàn)象。在病程較長時(shí)可觀察到部分神經(jīng)纖維發(fā)生腫脹和脫髓鞘，在超微結(jié)構(gòu)檢查中甚至可發(fā)現(xiàn)結(jié)周軸-神經(jīng)膠質(zhì)脫失的現(xiàn)象[13-14]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，鏈脲佐菌素所致的糖尿病大鼠神經(jīng)纖維髓鞘損傷發(fā)生率明顯增加，部分神經(jīng)纖維髓鞘甚至發(fā)生變性。周絡(luò)通雖不能完全逆轉(zhuǎn)神經(jīng)病變的發(fā)生，但可明顯降低神經(jīng)纖維變性損傷的發(fā)生率，對(duì)坐骨神經(jīng)纖維的萎縮、變小均表現(xiàn)出明顯抑制作用，顯示藥物對(duì)外周神經(jīng)組織的形態(tài)學(xué)改變也具有明顯保護(hù)作用。

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