人臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療缺血缺氧性腦病的有效性

·論著·

人臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療缺血缺氧性腦病的有效性

王彥永，王銘維

作者單位：050031河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

通信作者：王銘維，050031河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；E-mail：mwwang2007@hotmail.com

【摘要】目的探討人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSCs)移植治療缺血缺氧性腦病(HIE)的有效性。方法選取2012年12月—2013年12月河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院收治的HIE患者25例為研究對象，根據(jù)患者意愿將患者分為對照組(15例)和移植組(10例)。兩組患者均進行常規(guī)基礎臨床處理，包括脫水降顱壓、營養(yǎng)神經(jīng)及高壓氧、針灸、功能訓練等。于本院婦產(chǎn)科健康足月胎兒的臍帶中提取并分離培養(yǎng)hUCMSCs，采用流式細胞儀進行細胞免疫表型鑒定。移植組患者通過外周靜脈滴注移植hUCMSCs 1.0×107個/次，移植3次，每次間隔1周。兩組患者分別在治療前及治療結(jié)束后14、90、180 d采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)、Barthel指數(shù)量表、帕金森病統(tǒng)一評分量表(UPDRS)、漢密爾頓抑郁14項量表(HAMD14)、漢密爾頓焦慮24項量表(HAMA24)及簡易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)評價各項功能。結(jié)果治療前，兩組患者NIHSS、Barthel指數(shù)、UPDRS、HAMD14、HAMA24及MMSE評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同干預對兩組各量表評分的影響比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且干預與時間對兩組各量表評分的影響存在交互作用(P<0.05)。移植組患者hUCMSCs移植過程及移植后72 h內(nèi)均未出現(xiàn)發(fā)熱、血壓改變、過敏反應。結(jié)論hUCMSCs移植可改善HIE患者神經(jīng)功能、錐體外系功能、情緒反應及認知功能。

【關(guān)鍵詞】缺血缺氧，腦；臍血干細胞移植；間質(zhì)干細胞

基金項目：河北省科技計劃項目(12276102D)

【中圖分類號】R 743

收稿日期：(2015-03-24；修回日期：2015-08-20)

王彥永，王銘維.人臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療缺血缺氧性腦病的有效性[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(35)：4293-4297.[www.chinagp.net]

Wang YY，Wang MW.Effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation on the treatment of hypoxic-ischemic encephalopathy[J].Chinese General Practice，2015，18(35)：4293-4297.

Effects of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Transplantation on the Treatment of Hypoxic-ischemic EncephalopathyWANGYan-yong，WANGMing-wei.DepartmentofNeurology，theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050031,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the efficacy of human umbilical cord mesenchymal stem cell(hUCMSCs) transplantation on the treatment of hypoxic-ischemic encephalopathy(HIE).MethodsWe enrolled 25 HIE patients who received treatment in the First Hospital of Hebei Medical University from December 2012 to December 2013.According to the will of the patients,we divided them into control group(n=15) and transplantation group(n=10).The two groups of patients were all administrated with conventional basic clinical treatment,including intracranial decompression by dehydrating agents,trophic nerve,high pressure oxygen,acupuncture and moxibustion,etc.hUCMSCs were extracted from the umbilical cords of full-term fetuses in the gynaecology and obstetrics department of our hospital and were cultured.Flow cytometry was employed to conduct immunophenotype identification of the cells.In transplantation group,the transplantation was conducted by 1.0×107per time for three times with one-week interval through peripheral intravenous drip.NIHSS,Barthel scale,UPDRS,HAMD14,HAMA24and MMSE were used to evaluate various functional parameters of the two groups before treatment,and 14 days,90 days and 180 days after treatment.ResultsBefore treatment,the two groups were not significantly different in the scores of NIHSS,Barthel scale,UPDRS,HAMD14,HAMA24and MMSE (P>0.05).The different intervention were significantly(P<0.05) in the influence on the scores of NIHSS,Barthel scale,UPDRS,HAMD14,HAMA24and MMSE,and there was interaction between intervention and time on the scores of above scales(P<0.05).Transplantation group didn′t occur fever,changes in blood pressure and allergic reaction when and within 72 h after transplantation.ConclusionTransplantation of hUCMSCs can significantly improve the neurological function,extrapyramidal function,emotional reaction and cognitive function.

【Key words】Hypoxia-ischemia,brain；Cord blood stem cell transplantation；Mesenchymal stem cells

間充質(zhì)干細胞是Friedenstein等[1]于1966年首次發(fā)現(xiàn)的一類多能干細胞，其來源于發(fā)育早期的中胚層，具有高度自我更新能力和多向分化潛能。來源于新生兒臍帶的間充質(zhì)干細胞克服了胚胎干細胞來源缺乏、異體排斥難題，無道德倫理學限制，與目前研究較多的骨髓間充質(zhì)干細胞相比，高度病毒污染的風險極大降低，且不會隨供體年齡的增長而出現(xiàn)細胞擴增、分化能力明顯下降趨勢，成為目前干細胞領(lǐng)域新的研究熱點[2]。已有體外實驗證實，在不同的誘導條件下，人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSCs)不僅可向成骨、軟骨、脂肪細胞等多種中胚層來源的組織細胞分化，還可向外胚層和內(nèi)胚層來源的神經(jīng)元樣細胞和肝細胞樣細胞分化[3]。目前臨床缺血缺氧性腦病(HIE)暫無有效的根治性干預措施，本研究采用hUCMSCs對臨床HIE患者進行移植治療，并進行6個月的隨訪，評價其有效性與安全性，現(xiàn)報道如下。

1對象與方法

1.2方法

1.2.1常規(guī)治療兩組患者均進行常規(guī)基礎臨床處理，包括脫水降顱壓、營養(yǎng)神經(jīng)及高壓氧、針灸、功能訓練等康復治療。

1.2.2hUCMSCs的提取及分離培養(yǎng)hUCMSCs取自本院婦產(chǎn)科健康足月胎兒臍帶，產(chǎn)婦分娩前體健，無HIV、乙型肝炎病毒、梅毒螺旋體等感染，并征得其知情同意。臍帶采集后，置于無菌0.9%氯化鈉溶液中，在4 ℃條件下迅速轉(zhuǎn)移至無菌細胞房，采用組織塊貼壁法進行原代干細胞的分離培養(yǎng)，操作在12 h內(nèi)完成。將臍帶外膜與血管剔除，取臍帶沃頓膠剪碎接種于無血清培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2孵箱進行培養(yǎng)，3 d后換液。培養(yǎng)第6～7天鏡下可見貼壁生長的單個梭形細胞從組織塊中游離出來，再次換液。培養(yǎng)第10～14 天，貼壁細胞融合至70%～80%，用0.1%膠原酶進行消化并傳代。取第4代處于對數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液，分別加入抗體CD34-PE、CD44-PerCP-Cy5.5、CD45-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、HLA-DR FITC，流式細胞儀進行細胞免疫表型鑒定。臺盼藍染色鑒別活細胞，調(diào)整細胞懸液的濃度至1.0×105/ml。

1.2.3hUCMSCs移植移植組患者通過外周靜脈滴注移植hUCMSCs 1.0×107個/次，移植3次，每次間隔1周。移植過程及移植后72 h內(nèi)密切監(jiān)測患者各項基本生命體征，并注意有無發(fā)熱、血壓升高、過敏等不良反應發(fā)生。

1.3臨床評價兩組患者分別在治療前及治療結(jié)束后14、90、180 d對各項功能指標進行評價。采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)、Barthel指數(shù)量表評價其神經(jīng)功能；采用帕金森病統(tǒng)一評分量表(UPDRS)的運動部分評價其錐體外系功能；采用漢密爾頓抑郁14項量表(HAMD14)、漢密爾頓焦慮24項量表(HAMA24)及簡易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)評價情緒反應及認知功能。

2結(jié)果

2.1hUCMSCs鑒定結(jié)果hUCMSCs傳至第4代生長良好，呈長梭形，具有典型的成纖維細胞形態(tài)(見圖1)。流式細胞儀檢測顯示，hUCMSCs高表達間充質(zhì)干細胞的標志CD44、CD73，不表達造血干細胞標志CD34、CD45及主要組織相容性復合體標志HLA-DR，說明hUCMSCs分離培養(yǎng)成功且免疫原性低。

2.2兩組治療前各量表評分比較治療前，兩組患者NIHSS、Barthel指數(shù)量表、UPDRS、HAMD14、HAMA24及MMSE評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

圖1　 顯微鏡下見hUCMSCs呈典型成纖維細胞形態(tài)

Figure 1hUCMSCs showing typical fibroblast morphology under a microscope

2.3臨床評價

2.3.1兩組患者神經(jīng)功能比較不同干預對兩組NIHSS、Barthel指數(shù)量表評分的影響比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且干預與時間對兩組NIHSS、Barthel指數(shù)量表評分的影響存在交互作用(P<0.05,見表2)。

2.3.2兩組患者錐體外系功能比較不同干預對兩組UPDRS評分的影響比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且干預與時間對兩組UPDRS評分的影響存在交互作用(P<0.05,見表3)。

Table 1Comparison of score of each scale between the two groups before treatment

組別例數(shù)NIHSS評分Barthel指數(shù)量表評分UPDRS評分HAMD14評分HAMA24評分MMSE評分對照組1512.6±5.044.5±15.428.9±12.711.7±5.710.5±5.719.7±5.5移植組1013.1±6.643.5±19.928.0±14.411.1±5.910.6±5.818.4±9.1t值0.2160.1420.1650.2540.0430.447P值0.8310.8890.8710.8020.9660.660

注：NIHSS=美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表，UPDRS=帕金森病統(tǒng)一評分量表，HAMD14=漢密爾頓抑郁14項量表，HAMA24=漢密爾頓焦慮24項量表，MMSE=簡易精神狀態(tài)檢查量表

表3　兩組錐體外系功能比較 ±s，分)

2.3.3兩組患者情緒反應及認知功能比較不同干預對兩組HAMD14、HAMA24及MMSE評分的影響比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且干預與時間對兩組HAMD14、HAMA24及MMSE評分的影響存在交互作用(P<0.05,見表4)。

表2　兩組神經(jīng)功能比較 ±s，分)

表4　兩組情緒反應及認知功能比較 ±s,分)

2.4不良反應移植組患者hUCMSCs移植過程及移植后72 h內(nèi)均未出現(xiàn)發(fā)熱、血壓改變、過敏反應，未出現(xiàn)特殊異常反應。

3討論

hUCMSCs是臨床移植治療各種疾病新的干細胞來源，具有來源廣泛、取材方便、免疫原性低、感染病毒的機會小、分化潛力大、增殖能力強、無道德倫理限制等諸多優(yōu)點。目前，hUCMSCs向神經(jīng)元方向分化的體外實驗及將其用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療成為臨床研究的熱點問題。

Wexler等[4]于2003年首次報道間充質(zhì)干細胞在特定條件下可向神經(jīng)元樣細胞進行分化，為間充質(zhì)干細胞的應用奠定了基礎。Mitchell等[5]發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs經(jīng)誘導可形成神經(jīng)元特有的尼氏體結(jié)構(gòu)，并表達神經(jīng)絲蛋白(NF)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)等神經(jīng)特異性標志物。Ma等[6]發(fā)現(xiàn)hUCMSCs誘導后可表達神經(jīng)干細胞的相關(guān)基因Nestin及Pleiotrophin，免疫組織化學染色可見神經(jīng)膠質(zhì)細胞(GFAP)和神經(jīng)微管蛋白(β-Tubulin Ⅲ)及NF的陽性表達。

Weiss等[7]將hUCMSCs移植入帕金森病(PD)模型大鼠，12周后大鼠行為明顯改善，雙側(cè)黑質(zhì)和腹側(cè)中腦均發(fā)現(xiàn)酪氨酸羥化酶陽性細胞。Fu等[8]將向多巴胺能神經(jīng)元誘導后的hUCMSCs直接移植入PD模型大鼠紋狀體內(nèi)，觀察大鼠阿撲嗎啡誘導的旋轉(zhuǎn)行為改善，移植4個月后發(fā)現(xiàn)移植細胞在大鼠腦內(nèi)向頭尾側(cè)各遷移1.4 mm，說明移植細胞不僅可以存活，并具有正常細胞樣的遷移功能。實驗發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs移植到脊髓損傷模型大鼠的損傷區(qū)頭尾兩側(cè)，可刺激損傷區(qū)皮質(zhì)脊髓束再生和增加損傷周圍區(qū)軸突的數(shù)量，脊髓內(nèi)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)表達增高，大鼠運動功能明顯增強[9]。國內(nèi)有報道將hUCMSCs移植入脊髓損傷模型大鼠中，28 d后在大鼠脊髓發(fā)現(xiàn)移植細胞遷移、聚集于損傷組織的周圍，NSE與GFAP陽性細胞的比例分別為3.6%和12.7%[10]。Ding等[11]將hUCMSCs移植入卒中模型大鼠，大鼠神經(jīng)功能改善，移植細胞分化為神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細胞及GFAP，神經(jīng)營養(yǎng)因子表達及局部腦皮質(zhì)血流量增加，皮質(zhì)神經(jīng)元活性提高。國內(nèi)有研究學者已初步將hUCMSCs移植應用于臨床其他疾病的治療并進行短期的隨訪，取得了一定的療效[12]。

上述動物實驗可見，hUCMSCs移植具有神經(jīng)保護作用，一方面可能是其分化替代機制，通過替代原損傷、凋亡或壞死的神經(jīng)元改善神經(jīng)功能；另一方面，hUCMSCs可能通過細胞接觸并抑制外周血淋巴細胞分泌細胞因子從而抑制T細胞、B細胞、NK細胞的增殖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；通過減少損傷區(qū)域白細胞的浸潤及下調(diào)小膠質(zhì)細胞的活性而減輕炎癥損傷[13]；通過分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)促進新生血管的生成或在出血區(qū)周圍直接分化為血管內(nèi)皮細胞；通過在局部損傷微環(huán)境中分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、GDNF、NT-3等促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的活化、移行及分化，多種途徑共同作用，激活機體本身的內(nèi)源性修復發(fā)揮保護作用。

本研究結(jié)果顯示，將體外培養(yǎng)的hUCMSCs通過靜脈滴入的方法植入HIE患者，采用各量表分別對其神經(jīng)功能、錐體外系功能、情緒反應及認知功能進行評價，通過移植后14 、90及180 d隨訪，移植組患者各項功能均優(yōu)于對照組，且無明顯不良反應，提示hUCMSCs治療HIE安全有效，為未來臨床進一步擴大應用提供依據(jù)。

本研究也存在一定局限性，樣本量較少，設立的對照組僅限于未進行移植的患者，而未進行蛛網(wǎng)膜下腔注射等其他途徑治療方式的比較；臨床醫(yī)生可能對移植組患者的常規(guī)治療更加重視，從而夸大hUCMSCs的治療效果。未來對hUCMSCs治療HIE的效果仍需長期、大樣本、多途徑移植的研究，并深入探討其相關(guān)機制，為改善患者的預后提供新的治療方法。

參考文獻

[1]Friedenstein AJ,Piatetzky-ShapiroⅡ,Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells[J].J Embryol Exp Morphol,1966,16(3):381-390.

[2]Jaing TH.Umbilical cord blood:a trustworthy source of multipotent stem cells for regenerative medicine[J].Cell Transplant,2014,23(4/5):493-496.

[3]Nagamura-Inoue T,He H.Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells:their advantages and potential clinical utility[J].World J Stem Cells,2014,6(2):195-202.

[4]Wexler SA,Donaldson C,Denning-Kendall P,et al.Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal ′stem′ cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not[J].Br J Haematol,2003,121(2):368-374.

[5]Mitchell KE,Weiss ML,Mitchell BM,et al.Matrix cells from Wharton′s jelly form neurons and glia[J].Stem Cells,2003,21(1):50-60.

[6]Ma L,Feng X,Cui B,et al.Human umbilical cord Wharton′s Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells[J].Chin Med J(Engl),2005,118(23):1987-1993.

[7]Weiss ML,Medicetty S,Bledsoe AR,et al.Human umbilical cord matrixstem cells:preliminary characterization and effect of transplantation in arodent model of Parkinson′s disease[J].Stem Cells,2006,24(3):781-792.

[8]Fu YS,Cheng YC,Lin MY,et al.Conversion o f human umbilical cord mesenchymal stem cells in wharton′s jelly to dopaminergic neurons in vitro:potential therapeutic application for Parkinsonism[J].Stem Cells,2006,24(1):115-124.

[9]Hu SL,Luo HS,Li JT,et al.Functional recovery in acute traumatic spinal cord injury after transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells[J].Crit Care Med,2010,38(11):2181-2189.

[10]Wang GS,Zhang QJ,Han ZC.Evaluation of neurological function recovery following human umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation to injured spinal cord in rats[J].Chinese Journal of Neurosurgery,2006,22(2):18-21.(in Chinese)

王革生,張慶俊,韓忠朝.人臍帶間充質(zhì)干細胞移植對大鼠脊髓損傷神經(jīng)功能恢復的評價[J].中華神經(jīng)外科雜志,2006,22(2):18-21.

[11]Ding DC,Shyu WC,Chiang MF,et al.Enhancement of neuroplasticity through upregulation of betal-integrin in human umbilical cord-derived stromal cell implanted stroke model[J].Neurobiol Dis,2007,27(3):339-353.

[12]李丹,王易,胡紹燕.人臍帶間充質(zhì)干細胞治療白血病患兒異基因造血干細胞移植術(shù)后急性移植物抗宿主病療效觀察[J].中國實用兒科雜志,2012,27(12):937-939.

[13]Zhou JY,Zhang QJ.Effect of ILK expression on differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into neural stem-like and neural cells[J].Chinese Journal of Neurosurgery,2008,24(3):216-219.(in Chinese)

周劍云,張慶俊.人臍帶間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化過程中ILK的表達變化及意義[J].中華神經(jīng)外科雜志,2008,24(3):216-219.

(本文編輯：吳立波)