TNF-α 3′-UTR雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的構(gòu)建及丹參酮類藥物篩選

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.017.html

TNF-α 3′-UTR雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的構(gòu)建及丹參酮類藥物篩選

韋忠紅1,2，朱智杰1,2,劉玉萍1,2，劉兆國1,2，盛曉波1,2，汪思亮1,2，陶麗1,2，祝娉婷1,2，陳文星1,2,王愛云1,2，陸茵1,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,2.江蘇省藥效與安全性評價重點實驗室,江蘇 南京210046)

中國圖書分類號：R284.1；R329.2；R345；R394.2；R394.3；R965.1；R977.3

摘要:目的構(gòu)建并鑒定pGL3-TNF-α 3′端非翻譯區(qū)(UTR)雙熒光素酶報告基因(DLR)表達系統(tǒng)，以此基于調(diào)控TNF-α轉(zhuǎn)錄后水平對丹參酮類成分進行篩選。方法反轉(zhuǎn)錄人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC的mRNA成cDNA，以之為模板，PCR擴增含TNF-α 3′-UTR的DNA片段全長，經(jīng)酶切后連接至熒光素酶報告載體pGL3-control上，構(gòu)建出pGL3-TNF-α 3′UTR全長的熒光素酶報告基因載體并進行鑒定。將所構(gòu)建的pGL3-TNF-α 3′UTR與pSVRenilla質(zhì)粒組成雙熒光素酶報告系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染至單核巨噬細胞RAW264.7，經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)后利用該雙熒光素酶報告基因表達系統(tǒng)判定丹參酮類成分對TNF-α轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是否有影響。結(jié)果成功構(gòu)建pGL3-TNF-α 3′UTR熒光素酶報告基因，克隆獲得的DNA片段大小及序列與Genbank報道的一致。脂多糖(LPS)可以明顯誘導(dǎo)轉(zhuǎn)入pGL3-TNF-α 3′UTR載體細胞的熒光強度。丹參酮類成分中隱丹參酮可以明顯降低LPS誘導(dǎo)的pGL3-TNF-α 3′UTR載體細胞的熒光素酶活性。結(jié)論成功構(gòu)建含TNF-α 3′UTR區(qū)的雙熒光素酶報告基因表達系統(tǒng)，并以此從丹參酮類化合物中篩選出隱丹參酮，可以對TNF-α的轉(zhuǎn)錄后水平進行抑制調(diào)控。

關(guān)鍵詞:TNF-α；3′非編碼區(qū)；雙熒光素酶報告基因；轉(zhuǎn)錄后調(diào)控；隱丹參酮；藥物篩選

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.017

文章編號：

文獻標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0077-05

收稿日期:2014-09-01,修回日期:2014-10-10

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81173174，81202655)；教育部博士點基金(No 20113237110008); 江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目

作者簡介：韋忠紅(1989-)，女，碩士生，E-mail：adonis_1978@126.com;

通訊作者陸茵(1965-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，，Tel:025-85811239，E-mail：luyingreen@126.com

Abstract:AimTo screen the potential inhibitors of post-transcriptional activity of pro-inflammatory mediator TNF-α from the lipophilic constituents in Chinese Medicine Salvia miltiorrhiza Bunge (Danshen), we established dual luciferase reporter gene system pGL3-TNF-α 3′UTR (3′untranslated region) co-transfected with Renilla control gene. MethodsComplementary DNA (cDNA) template was obtained from human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). The full length DNA of TNF-α 3′-UTR was amplified through PCR, and then connected the luciferase reporter vector pGL3-control after enzyme digestion. pGL3-TNF-α 3′UTR constructs were co-transfected with pSVRenilla into the mononuclear macrophages RAW264.7 cells. The relative activity of reporter genes was measured by dual luciferase reporter (DLR) assay system after the stimulus of lipopolysaccharide (LPS) in presence or absence of tanshinones compounds.ResultsThe pGL3-TNF-α 3′UTR luciferase reporter gene was successfully constructed. The cloning DNA fragment and sequence were both consistent with the GENBANK database. LPS significantly induced the relative reporter activityof RAW264.7 cells transfected with pGL3-TNF-α 3′UTR. Among four tanshinones compounds, we found only cryptotanshinone could significantly decrease LPS-induced relative reporter activity. ConclusionThe pGL3-TNF-α 3′UTR construct combined with DLR assay system was successfully established, which can be used to discover the agents such as cryptotanshinone that regulate the post-transcription of TNF-α in treatment of inflammatory and malignant diseases.

TNF-α是一個典型的促炎癥細胞因子，包括可溶性的TNF-α (sTNF-α)和膜相關(guān)的TNF-α (mTNF-α)兩種形式，主要由巨噬細胞分泌，同時惡性腫瘤細胞、成纖維細胞以及內(nèi)皮細胞等也能分泌TNF-α[1]。TNF-α有兩種受體：p55 receptor (TNFR-1)和p75 receptor (TNFR-2)，TNF-α以三聚體的形式和細胞表面的兩種受體結(jié)合，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。TNF-α的表達調(diào)控分為轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[2-3]，TNF-α的mRNA的3′端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)存在富含腺嘌呤核苷與尿嘧啶核苷的元件(adenosine and uridine rich element，ARE)，可與多種ARE結(jié)合蛋白(ARE-binding proteins，ARE-BPs)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其基因的表達[4]。TNF-α參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其主要參與腫瘤血管生成過程[5]。更有研究顯示TNF-α在體內(nèi)[6]、體外[7]都是一個不可忽視的抗血管生成因子。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，不論是惡性腫瘤細胞自分泌還是通過腫瘤微環(huán)境中的炎性細胞的旁分泌都能產(chǎn)生TNF-α，誘導(dǎo)腫瘤血管生成[8-9]，促進腫瘤的惡性演進。

丹參作為臨床上抗腫瘤治療應(yīng)用最多的活血化瘀中藥，在中醫(yī)治療腫瘤中發(fā)揮著重要的作用，丹參的主要抗腫瘤活性成分包含脂溶性和水溶性成分兩大類，其中脂溶性成分主要包括含有鄰醌或?qū)︴Y(jié)構(gòu)的多種丹參酮，包括丹參酮I(TI)、丹參酮IIA(TIIA)、隱丹參酮(CT)、二氫丹參酮I(DTI)。本課題組長期從事活血化瘀中藥抗腫瘤的研究[10-11]，丹參中部分成分能夠明顯下調(diào)TNF-α的表達而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[12]。本研究通過構(gòu)建TNF-α 3′-UTR雙熒光素酶報告基因表達系統(tǒng)，體外轉(zhuǎn)染至高表達TNF-α的單核巨噬細胞RAW264.7細胞，旨在從隱丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、二氫丹參酮I中篩選出對TNF-α轉(zhuǎn)錄后水平進行調(diào)控的有效成分，為高通量篩選轉(zhuǎn)錄后調(diào)控TNF抗腫瘤藥物提供新的途徑和思路。

1材料與方法

1.1材料與試劑小鼠RAW264.7細胞、受體菌 E.eoli DH5α購于中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。丹參酮I純度為98%，西安和霖生物工程有限公司，貨號：568-73-0；隱丹參酮純度為98%，西安和霖生物工程有限公司，貨號：35825-57-1；丹參酮IIA純度為98%，西安和霖生物工程有限公司，貨號：35825-57-1；二氫丹參酮I純度為98%，西安和霖生物工程有限公司，貨號:87205-99-0；脂多糖(美國Sigma公司，Cat NO.L4130)；Dual-Luciferase?Reporter 1000 Assay System(Promega公司，Cat NO.E1960 Lot NO.0000026815);限制性內(nèi)切酶(EcoRI、BamHI) 、T4DNA連接酶、KOD保真酶(Sigma公司)； AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit(Axygen公司，Cat.NO.AP-MN-P-250G Lot.NO.05213KA1)；Endo-free Plasmid Mini Kit I(OMEGA公司，Cat.NO.D6948-01B Lot.NO.00D694801B0000J08L027)；AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit(Axygen公司，Cat.NO.AP-GX-250 Lot.NO.KE10120804-G)。Western blot所涉及抗體：GAPDH(Bioworld，AP0063)，TNF-α(Abgent，AO1131a)PCR儀(ABI公司，型號：Veriti 96 well Thermal Cycler)熒光素酶報告基因檢測儀(Promega公司，型號：GloMax20/20)凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad，型號：GelDoc 2000)

1.2實驗方法

1.2.1引物及其合成根據(jù)人TNF-α基因的3′UTR的片段(全長799 kb)，采用 Primer Premier 5.0軟件進行PCR 引物設(shè)計，引物由南京金斯瑞公司合成。引物序列如下：F: 5′-TCTAGAGGAGGACGAACATCCAACCT-3′;R: 5′-TCTAGATTTCTTTTCTAAGCAAACTTTATTTCTCGCC-3′。其中TCTAGA為XbaI酶切位點。

1.2.2基因組DNA的提取及PCR擴增按照試劑盒說明提取RAW264.7細胞基因組DNA作為PCR擴增模板，使用KOD保真酶進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL體系，其中，2×KOD buffer 10 μL，Primer (F&R) 2.4 μL，Template (HUVEC cDNA) 1 μL，KOD Fx 0.4 μL，dNTP 4 μL，MilliQ 2.2 μL。反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，65℃退火15 s，68℃延伸1 min，進行35個循環(huán)，68℃延伸10 min，16℃保存。取PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳分離，切膠回收。

1.2.3pGL-3-TNF-α 3′UTR熒光素酶報告基因的構(gòu)建及其鑒定對PCR產(chǎn)物進行過柱純化，獲得加A產(chǎn)物后，將加A產(chǎn)物與T4載體相，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌 DH5α，挑取單克隆進行PCR鑒定，將鑒定正確的克隆菌液送至金斯瑞公司測序。將測序正確的質(zhì)粒取出與pGL-3 control質(zhì)粒分別用XbaI酶切，其中pGL-3 control質(zhì)粒進行堿性磷酸酶處理，切膠回收目的片段，將切膠回收的產(chǎn)物與pGL-3 control載體相連，連接3 h后進行轉(zhuǎn)化涂板和質(zhì)粒小提，構(gòu)建成 pGL-3 control -TNF-α-3′UTR重組載體。PCR鑒定有pGL-3 control 質(zhì)粒是否含有所需片段。采用EcoRI、BamHI雙酶切鑒定插入方向，并進行去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取。

1.2.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染用含10%胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)RAW264.7，B16F10細胞，于 37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)、傳代，采用lipofectamine-2000 轉(zhuǎn)染試劑將上述所構(gòu)建的pGL-3-TNF-α 3′UTR質(zhì)粒和Rellina Luciferase內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入RAW264.7，B16F10細胞，并用optiMEM 10%，DMEM完全培養(yǎng)基90%對瞬時轉(zhuǎn)染的細胞進行培養(yǎng)。24 h后更換成DMEM+10%FBS完全培養(yǎng)基，加藥處理。

1.2.5熒光素酶活性測定按照雙熒光素酶檢測試劑盒提供的操作方法檢測在重組細胞RAW264.7細胞中pGL-3-TNF-α 3′UTR的熒光素酶的活性。用只含 PBS 的孔將熒光檢測儀校準(zhǔn)，測量螢火蟲熒光素酶活性(Rn)和海腎素?zé)晒馑孛富钚?Ff)，以螢火蟲熒光素酶活性/海腎素?zé)晒馑孛富钚?Rn/Ff)的值作為熒光素酶活性。以只轉(zhuǎn)染空載體的RAW264.7細胞作為對照，并將該組的熒光素酶活性值進行歸一化，轉(zhuǎn)染pGL-3-TNF-α 3′UTR質(zhì)粒組的熒光素酶活性為其相對值。

1.2.6Western blot檢測TNF-α蛋白表達水平藥物處理12h的B16F10細胞，采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白，-80℃冰箱過夜后對每個樣本進行蛋白定量，確定蛋白上樣量。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉，TBST清洗，一抗孵育4℃過夜，室溫孵育羊抗兔二抗1 h。免疫反應(yīng)的條帶使用相應(yīng)的化學(xué)發(fā)光試劑(Perkin-Elmer Life Science, Boston, MA, USA)顯色，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad，型號：GelDoc 2000)成像。

2結(jié)果

2.1TNF-α 3′UTR重組質(zhì)粒的酶切鑒定利用PCR技術(shù)擴增 TNF-α 3′UTR為799kb，瓊脂糖凝膠電泳顯示出的PCR產(chǎn)物片段大小符合(Fig 1)。挑取酶切鑒定正確的PGL3-TNF-α 3′UTR克隆進行測序。質(zhì)粒序列與Genbank報道一致，證明目的基因已成功轉(zhuǎn)入PGL3-Control載體中。

2.2熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果將所構(gòu)建的質(zhì)粒pGL3-TNF 3′UTR，pGL3-Control空載分別與pSVRenilla luciferase質(zhì)粒組成雙熒光素酶報告系統(tǒng)

Fig 1　The TNF-α 3′UTR fragments amplification

The molecular weight of obtained fragments is 799bp.

轉(zhuǎn)染到RAW264.7細胞。脂多糖(lipopolysacchar-ides,LPS)可以誘導(dǎo)TNF-α的表達和分泌，pGL3-TNF 3′UTR報告系統(tǒng)轉(zhuǎn)染組和空載對照組分別用終濃度為10 μg·L-1的LPS或者等體積的PBS刺激1 h，進行熒光素酶報告基因活性檢測。給予LPS后可以明顯增加TNF-α報告基因的表達，但是對空載對照的報告基因的表達沒有明顯影響(Fig 2)。

Fig 2　Increased expression of TNF-α-3′UTR luciferase

**P<0.01vsTNF-α-3′UTR(PBS).

2.3基于pGL3TNF-α3′UTR雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的丹參酮類成分篩選將構(gòu)建的pGL3-TNF-α3′UTR質(zhì)粒、pGL3-Control質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒pSVRenilla luciferase共轉(zhuǎn)染入RAW264.7細胞，24 h后分別給予10 μmol·L-1[13]濃度的隱丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ，作用2 h，再加入LPS(10 μg·L-1)刺激1 h后[14]，分別檢測 firefly/Renilla luciferase activity。結(jié)果顯示，只有隱丹參酮在10 μmol·L-1可以明顯抑制firefly/Renilla luciferase activity(Fig 3A)。并且隱丹參酮可以劑量依賴性地抑制firefly/Renilla luciferase activity(Fig 3B)。

Fig 3　Inhibition of the ratio of firefly/renilla luciferase

A: Tanshinone compounds screening based on the TNF-α-3′UTR luciferase activity in RAW264.7 cells.**P<0.01vsLPS; B: Dose-dependent inhibition of TNF-α-3′UTR luciferase activity by cryptotanshinone.**P<0.01vs0(LPS)

2.4隱丹參酮抑制B16F10細胞TNF-α的表達小鼠黑色素瘤細胞B16F10自然高表達TNF-α，隱丹參酮可劑量依賴性地抑制B16F10的firefly/Renilla luciferase activity(Fig 4A)。采用Western blot 法進一步對TNF-α蛋白水平進行分析，結(jié)果顯示TNF-α蛋白與其對應(yīng)的firefly/Renilla luciferase activity相一致，受到隱丹參酮的劑量依賴性抑制(Fig 4B)。

3討論

Fig 4　Inhibition of TNF-αexpression by cryptotanshinone

A:Dose-dependent inhibition of TNF-α-3′UTR luciferase activity by cryptotanshinone in B16F10 cells.**P<0.01vs0; B:Protein expression of TNF-α in B16F10 cells to reduce by cryptotanshinone (detected by western blot).

大量研究表明，由巨噬細胞分泌的細胞因子——TNF-α既參與了免疫調(diào)節(jié)和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時也與多種腫瘤如乳腺癌[15]、骨髓瘤[16]等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞以及腫瘤微環(huán)境中的炎性細胞分泌的TNF-α能夠促進腫瘤的血管生成，進而維持腫瘤的生長及惡性演進。與此同時，臨床上廣泛應(yīng)用的以TNF-α為靶標(biāo)的藥物，如沙利度胺[17]、英昔單抗[18]等，也是通過抑制腫瘤血管生成從而發(fā)揮抗腫瘤的效應(yīng)。

轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是指在基因轉(zhuǎn)錄起始后對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行的一系列加工和修飾的過程，通常位于成熟mRNA 的 5′ 或 3′ 端非翻譯區(qū)(UTR)的特異序列與相應(yīng)蛋白相互作用，介導(dǎo)mRNA的出核轉(zhuǎn)運、胞質(zhì)中的定位、翻譯起始以及mRNA的降解，于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達水平[19]。TNF-α mRNA 的 3′UTR富含AU元件(AREs)，可通過ARE介導(dǎo)的降解途徑調(diào)控TNF-α mRNA 的穩(wěn)定性[20]?；诖?，構(gòu)建了包含TNF-α 3′UTR全長(878-1676片段)的熒光素酶報告基因質(zhì)粒，并對其進行鑒定和活性檢測。并與Renilla luciferase 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)構(gòu)成雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，基于該報告基因系統(tǒng)在單核巨噬細胞RAW264.7上，對本實驗室所研究的丹參酮類化合物從影響TNF-α轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)進行篩選。實驗結(jié)果表明，丹參中四種脂溶性成分隱丹參酮、隱丹參酮I、丹參酮ⅡA和丹參酮ⅡB，只有隱丹參酮可以明顯抑制所構(gòu)建的TNF-α 3′-UTR 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的熒光素酶活性，即隱丹參酮可以在轉(zhuǎn)錄后水平對TNF-α 基因表達進行調(diào)控。但是，由于TNF-α 3′UTR的調(diào)控元件眾多，因此，本實驗室將進一步研究隱丹參酮對TNF-α轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的直接靶點。

本研究所構(gòu)建的pGL-3-TNF-α 3′UTR質(zhì)粒，可以用于研究藥物對TNF-α具體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用機制，同時利用該雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)篩選活血化瘀中藥中其他活性成分，以期發(fā)現(xiàn)中藥中以TNF-α為靶點的潛在抗腫瘤活性成分，為天然抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)提供有效的研究平臺。

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Construction of pGL3-TNF-α 3′UTR luciferase reporter gene

and tanshinone compounds screening

WEI Zhong-hong1,2, ZHU Zhi-jie1,2,LIU Yu-ping1,2,LIU Zhao-guo1,2,SHENG Xiao-bo1,2,

WANG Si-liang1,2,TAO li1,2,ZHU Pin-ting1,2,CHEN Wen-xing1,2,WANG Ai-yun1,2,LU Yin1,2

(1.SchoolofPharmacy,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China;2.Jiangsu

KeyLaboratoryforPharmacologyandSafetyEvaluationofChineseMateriaMedica,Nanjing210046,China)

Key words:TNF-α, 3′UTR; dual luciferase reporter; post-transcriptional regulation;cryptotanshinone;compounds screening

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