人參皂苷Rg1對寡聚肽Aβ 1-42增加JNK活性及誘導(dǎo)凋亡的影響

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.014.html

人參皂苷Rg1對寡聚肽Aβ1-42增加JNK活性及誘導(dǎo)凋亡的影響

黃天文,何饒麗,周夢,張靜,陳曉春

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科，福建省老年醫(yī)學(xué)研究所，福建 福州350001)

中國圖書分類號：R284.1；R322.81；R329.25；R341.6；R977.6

摘要：目的在寡聚肽Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過程中，探討人參皂苷Rg1的保護作用和可能機制；方法運用寡聚肽Aβ1-42來誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元損害 ，把神經(jīng)元分為空白對照組、Aβ組、sp600125與Aβ共同孵育組以及人參皂苷Rg1與Aβ共同孵育組，然后觀察JNK、p-JNK、caspase-3活性和TUNEL細胞數(shù)的變化。結(jié)果寡聚肽Aβ1-42作用15 min，皮層神經(jīng)元的JNK磷酸化水平明顯增加；經(jīng)過預(yù)先孵育24 h人參皂苷Rg1(2.5~10 μmol·L`(-1))后，再與寡聚肽Aβ1-42共同孵育15 min，JNK磷酸化水平明顯降低；寡聚肽Aβ1-42孵育24 h，caspase-3活性和TUNEL數(shù)明顯升高；人參皂苷Rg1(10 μmol·L`(-1))預(yù)處理24 h后，再與Aβ1-42共孵育24 h組中caspase-3和TUNEL陽性數(shù)目明顯下降。結(jié)論人參皂苷Rg1可通過JNK通路減輕寡聚肽Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

關(guān)鍵詞：人參皂苷Rg1；皮層神經(jīng)元；JNK；磷酸化；寡聚肽Aβ1-42；caspase-3；凋亡

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.014

文章編號：

文獻標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0060-04

收稿日期:2014-09-08,修回日期:2014-11-19

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81100812)

作者簡介：黃天文(1978-),男,博士,副主任醫(yī)師,Tel:83357896-8525, E-mail：huangtianwen2002@gmail.com；

通訊作者陳曉春(1963-),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師，研究方向：老年性癡呆基礎(chǔ)和臨床,,Tel:83357896-8525, E-mail：chenxc998@163.com

Abstract：AimTo explore the possible protective effect of ginsenoside Rg1 on oligomeric Aβ1-42 induced apoptosis and its possible mechanism. MethodsThe damage was induced by oligomeric Aβ1-42 in primary cortical neurons. Cells were incubated in the absence or presence of Aβ, or co-incubated in sp600125 with Aβ, or pre-incubated in ginsenoside Rg1 then co-incubated in Aβ. The p-JNK, JNK, caspase-3 activity and TUNEL-positive cells were detected. ResultsIn Aβ1-42 treated group, the ratio of p-JNK/JNK level was increased more than that in non-treated group for 15 min. However, in neurons preincubated with (2.5, 5, 10 μmol·L`(-1)) ginsenoside Rg1 and then co-incubated with 5 μmol·L`(-1) oligomeric Aβ1-42, the p-JNK/ JNK ratio, caspase-3 activity and TUNEL positive neurons were significantly decreased compared with those of Aβ1-42 treated group. ConclusionGinsenoside Rg1 can attenuate the oligomeric Aβ1-42-induced apoptosis by JNK pathway.

老年性癡呆(Alzheimer′s disease, AD)是以老年斑沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)形成和神經(jīng)元丟失為主要特征的疾病[1]。而Aβ(β-amyloid)是形成老年斑的主要組成成分，也是AD發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)。Aβ可誘導(dǎo)包括線粒體損傷的諸多的AD樣病理損害[2-3]。

JNK(c-Jun N-terminal kinase)是屬于MAPK(mitogen-activated protein kinase)超家族成員。在一些環(huán)境的應(yīng)激(如Aβ)中其Thr183和Tyr185位點發(fā)生磷酸化，活性增加?；罨腏NK可損害線粒體、激活caspase-3活性，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[4]。在AD的動物模型中，JNK活性是增高的；通過抑制JNKs活性，能減輕AD鼠的認知損害程度[5]。這說明JNKs參與AD病理損害過程。

人參是古老的中藥，其中Rg1是人參重要的單體成分。研究證明，人參皂苷Rg1具有神經(jīng)保護作用[6-9]。但是人參皂苷Rg1是否可通過JNKs信號來減輕寡聚肽Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性損害，尚未見報道。本研究運用寡聚肽Aβ1-42作用在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，以模擬AD的細胞病理改變。然后探討人參皂苷Rg1對JNK、caspase-3活性和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1試劑寡聚肽Aβ1-42由美國康薩斯大學(xué)嚴(yán)世都教授惠贈。胰蛋白酶、Neurobasal 培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺、B27均購自美國Gibco公司?；A(chǔ)神經(jīng)元培養(yǎng)基含有：Neurobasal Medium、青霉素G(0.1 IU·L-1)、鏈霉素(0.1 1U·L-1)、HEPES(1.19 g·L-1)和NaHCO3(2 g·L-1)。生長培養(yǎng)基：Neurobasal 培養(yǎng)基+2 mmol·L-1L-谷氨酰胺+B27添加劑(neurobasal：B27=1 ∶1)+青霉素+鏈霉素。解剖液：Neurobasal 培養(yǎng)基+B27添加劑+4.4 mmol·L-1碳酸氫鈉+2 mmol·L-1谷氨酰胺。人參皂苷Rgl，純度大于98%，由吉林大學(xué)提供。兔多克隆抗體JNK/SAPK和p-JNK/SAPK( Thr183 /185)多克隆抗體購自Cell Signaling 公司；β-actin是鼠單克隆抗體購自NeoMarkers公司；Western blot 試劑盒檢測化學(xué)發(fā)光，購自美國KPL公司；TUNEL檢測試劑盒( In situ apoptosis detecton kit)購自Trevigen，caspase-3 活性測定試劑盒購自Clonteck Laboratories 公司，免疫組化試劑盒購自Lab Vision 公司。

1.2儀器二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus，CK40型)。

1.2.1動物孕15～16 d的清潔級的C57BL/6鼠，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司。

參考文獻1.2.2胎鼠皮層神經(jīng)細胞培養(yǎng)詳見`([10])：C57BL/6小鼠，孕15～16 d，小心取出胎鼠、斷頭、去顱骨、剔除血管、腦膜，分離皮層組織，然后進行胰蛋白酶消化，分離出皮層神經(jīng)細胞，計數(shù)、接種。3～5 d的皮層神經(jīng)元比較穩(wěn)定，在這時間進行相關(guān)實驗。

1.2.3實驗設(shè)計分組①空白對照組：未予干預(yù)處理。②Aβ組：僅予寡聚肽片段Aβ1-42，濃度為 5.0 μmol·L-1作用不同時間。③人參皂苷Rg1預(yù)處理組：人參皂苷Rg1(不同濃度)預(yù)先孵育24 h，然后加入Aβ1-42寡聚肽片段 5.0 μmol·L-1共同孵育。 ④sp600125(JNK抑制劑)處理組：予10 μmol·L-1的sp600125和Aβ1-42寡聚肽片段 5.0 μmol·L-1共同孵育。

1.2.4蛋白印跡方法吸棄培養(yǎng)液，用冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)輕洗，加入細胞裂解液，冰面上裂解20 min，收集離心14 000×g，4℃，共10 min，獲取上清液，用Protein Assay法(Bio-rad)進行定量蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉液在室溫下封閉，一抗4℃下孵育過夜，抗兔或鼠IgG二抗(1 ∶1 000稀釋) 作用2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光。實驗重復(fù)3次。

1.2.5caspase-3 活性測定按照試劑盒說明書操作，大致步驟如下：經(jīng)處理后的細胞，刮下、計數(shù)，各個處理組取相同細胞，冰上裂解10 min后離心，取上清。 在96 孔測量板上，加入50 μL的2×Reation Buffer/DTT 液體，于37 ℃ 預(yù)孵預(yù)5 min。 加入50 μL的細胞裂解液，于37 ℃孵育1 h，上機檢測熒光強度。激發(fā)波長:380 nm；發(fā)射波長:460 nm。

1.2.6TUNEL 染色 按照試劑盒說明書操作，步驟如下：細胞接種在蓋玻片上，經(jīng)各種干預(yù)后，3.7 %甲醛固定10 min，再予100 %乙醇后固定20 min；用1×PBS 沖洗；先后予Neuropore 液體、Quenching solution作用，然后與TdT標(biāo)記液體[TdT Dntp Mix; TdT Enzyme;Mn2+] 于37 ℃條件下作用1 h；終止反應(yīng)、PBS沖洗、滴加streptavidin-HRP孵育10 min；再次PBS沖洗后DAB顯色。光鏡下計數(shù)。

2結(jié)果

2.1寡聚態(tài)Aβ1-42激活神經(jīng)元JNK 的活性本實驗用5.0 μmol·L-1濃度的寡聚肽Aβ1-42作用在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，Aβ作用5、15、30和60 min 后，通過Western blot方法檢測JNK在Thr183和Tyr185位點磷酸化水平。從Fig 1 所示，寡聚肽Aβ1-42作用于神經(jīng)元15或30 min，p-JNK/JNK 的比值明顯升高，這提示Aβ1-42可誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元內(nèi)的JNK活性升高。

Fig 1Oligomeric Aβ1-42increases the phosphorylation

of JNK in cortical neurons

The cortical neurons were treated with oligomeric Aβ1-42(5.0 μmol·L-1) at indicated time points. It showed an obvious increase in the ratio of p-JNK/JNK at 15 or 30 min. Studies were repeated three times. Densitometric analysis of p-JNK to total JNK was shown graphically.*P<0.05vscontrol group (0 min time point).

2.2人參皂苷Rg1 減輕寡聚肽Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元JNK 磷酸化前面研究發(fā)現(xiàn)，寡聚肽Aβ1-42可使得p-JNK/JNK 的比值升高，在15和30 min 時p-JNK/JNK 的比值升高最為明顯。所以選擇15 min 作為研究的時間點，來探討人參皂苷Rg1對JNK磷酸化 的可能影響。研究結(jié)果如Fig 2所示，10 μmol·L-1的sp600125 可阻斷寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的p-JNK/JNK 的比值升高；與Aβ處理組相比較，不同濃度(2.5、5、10 μmol·L-1)的人參皂苷Rg1預(yù)孵育24 h后再與Aβ1-42共同孵育15 min組，p-JNK/JNK比值不同程度的下降。而僅予人參皂苷Rg1(10 μmol·L-1)處理的皮層神經(jīng)元組中，p-JNK/JNK的比值與未予任何處理的空白對照組相似；這些提示人參皂苷Rg1 可減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的p-JNK/JNK 的比值升高。2.3人參皂苷Rg1減輕寡聚肽Aβ1-42對caspase-3 活性的升高作用如Fig 3所示，與空白對照組相比較，在Aβ作用24 h組的神經(jīng)元的caspase-3的活性明顯升高；而與Aβ處理組相比較，10 μmol·L-1的sp600125和5 μmol·L-1的Aβ1-42共同孵育24 h組的神經(jīng)元的caspase-3活性下降。同樣與Aβ處理組相比較，給予10 μmol·L-1的人參皂苷Rg1預(yù)處理24 h再與5 μmol·L-1的Aβ1-42共同孵育24 h組的caspase-3活性也是下降。這些提示人參皂苷Rg1與JNK抑制劑sp600125相似，可減輕Aβ誘導(dǎo)的caspase-3活性的作用。

Fig 2　Ginsenoside Rg1 attenuates Aβ 1-42-

1:Control; 2:Aβ for 15 min; 3:sp600125+Aβ; 4:Rg2.5+Aβ; 5:Rg5+Aβ; 6:Rg10+Aβ; 7:Rg10

Cortical neurons were incubated in the absence or presence of 5 μmol·L-1Aβ1-42for 15 min, or incubated with sp600125 with Aβ for 15min, or pre-incubated in ginsenoside Rg1 for 24 h and co-incubated in Aβ for 15 min, or only ginsenoside Rg1 respectively. The result showed that ginsenoside Rg1 decreased the p-JNK induced by Aβ1-42.Studies were repeated three times. Densitometric analysis of p-JNK to total JNK was shown graphically.*P<0.05vsAβ1-42group.

Fig 3　Ginsenoside Rg1 decreases caspase-3

Cortical neurons were incubated in the absence or presence of 5 μmol·L-1Aβ1-42for 24 h, or incubated with sp600125 and Aβ for 24 h, or pre-incubated in ginsenoside Rg1 for 24 h and co-incubated in Aβ for 24 h. The results showed that Aβ1-42increased caspase-3 activity. Whereas ginsenoside Rg1 attenuated that increase.*P<0.05vsAβ1-42group.

2.4人參皂苷Rg1 減輕寡聚肽Aβ1-42誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡如Fig 4所示，與空白對照組相比較，5 μmol·L-1Aβ作用24 h 的Aβ組中TUNEL陽性率明顯升高。與Aβ組相比較，sp600125組以及人參皂苷Rg1組中，TUNEL陽性細胞數(shù)明顯下降，并且接近空白對照組的水平。這些提示人參皂苷Rg1與JNK抑制劑sp600125都具有神經(jīng)保護作用，可減輕Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

Fig 4　Ginsenoside Rg1 attentuates the apoptosis induced by

Cells were incubated in the absence or presence of 5 μmol·L-1Aβ1-42for 24 h, or incubated with 10 μmol·L-1sp600125 and Aβ for 24 h, or pre-incubated in ginsenoside Rg1 for 24 h and co-incubated in Aβ for 24 h. The ginsenoside Rg1 treatment decreased the Aβ-induced TUNEL-positive neurons. TUNEL-positive cells were counted in five fields per well and averaged.*P<0.05vsAβ1-42group.

3討論

JNK又稱應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)，是應(yīng)激的反應(yīng)蛋白，在應(yīng)激條件下(如Aβ)，JNK活性被激活，然后JNK參與線粒體的應(yīng)激反應(yīng)[11，12]。線粒體的應(yīng)激反應(yīng)是AD的重要的病理機制[10]。所以早于線粒體應(yīng)激反應(yīng)的JNK的變化具有潛在的研究價值。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，具有神經(jīng)毒性的5 μmol·L-1寡聚肽Aβ1-42可誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元內(nèi)的ROS(reactive oxygen species)升高。Aβ1-42作用在皮層神經(jīng)元2 h就使得細胞內(nèi)的ROS升高。而JNK是應(yīng)激蛋白激酶，可參與介導(dǎo)線粒體的損害過程。為了探討ROS升高之前(即線粒體損傷之前)，JNK的可能改變，我們選擇0、15、30、60 min時間點，來探討JNK在線粒體氧化應(yīng)激損害之前的早期病理生化改變。

我們的研究過程中發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42作用15 min時JNK在Thr183和Tyr185位點磷酸化水平明顯升高，這也提示JNK活性升高。眾所皆知，AD是一種常見的緩慢的不可逆的老年性疾病，目前仍缺乏有效的藥物治療。在AD的典型臨床癥狀出現(xiàn)之前，已經(jīng)發(fā)生了明顯的病理生化改變。所以早期的干預(yù)可能是一種可行方法?；谶@種理念，我們尋找早期、甚至是超早期的病理生化改變的目的是尋找早期的治療干預(yù)的時間點。當(dāng)我們用人參皂苷Rg1預(yù)先孵育后再與Aβ共同作用15 min，JNK磷酸化水平下降。這提示人參皂苷Rg1可以降低早期JNK活性。人參皂苷Rg1抑制早期升高的JNK活性，是否具有神經(jīng)保護作用？我們接下來測定細胞內(nèi)的caspase-3活性和TUNEL。研究結(jié)果：人參皂苷Rg1可使得Aβ誘導(dǎo)的caspase-3活性下降、凋亡數(shù)目減少。這說明人參皂苷Rg1可降低早期Aβ誘導(dǎo)的JNK活性具有神經(jīng)保護作用。

總之，在我們的研究中再次證實了寡聚肽Aβ1-42誘導(dǎo)JNK活性增加和細胞凋亡的發(fā)生。另一方面也說明了人參皂苷Rg1可通過抑制JNK信號通路來減少Aβ1-42誘導(dǎo)的細胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。這也為人參皂苷Rg1運用到臨床提供有價值的實驗數(shù)據(jù)。

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Effect of ginsenoside Rg1 on JNK and oligomeric Aβ1-42-induced apoptosis

HUANG Tian-wen,HE Rao-li,ZHOU Meng,ZHANG Jing,CHEN Xiao-chun

(DeptofNeurology，F(xiàn)ujianMedicalUniversityUnionHospital，F(xiàn)ufianMedicalUniversity，

FujianInstituteofGeriatrics，F(xiàn)uzhou350001，China)

Key word：ginsenoside Rg1; cortical neuron；JNK; phosphorylation；oligomeric Aβ1-42; caspase 3; apoptosis