利用雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)定飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)小尾寒羊瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響

■韓璐璐 劉仰知 叢玉艷

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

瘤胃是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的厭氧發(fā)酵罐，瘤胃內(nèi)的pH值、氨態(tài)氮（NH3-N）濃度、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的摩爾組成比例及菌體蛋白（BCP）等參數(shù)作為研究瘤胃發(fā)酵內(nèi)環(huán)境指標(biāo)，反映瘤胃內(nèi)部的環(huán)境狀況及飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵程度和模式。蛋白質(zhì)是動(dòng)物重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)瘤胃發(fā)酵起著重要作用。王春梅等[1]研究粗蛋白質(zhì)在8.4%、11.2%、14.0%、16.8%水平時(shí)，16.8% 粗蛋白質(zhì)水平對(duì)湖羊瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)有顯著影響。目前飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)小尾寒羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過(guò)體外發(fā)酵系統(tǒng)，研究飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)小尾寒羊瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響，為分析飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)小尾寒羊瘤胃消化代謝的影響奠定基礎(chǔ)，為優(yōu)化飼糧蛋白質(zhì)水平提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采集6月齡健康的小尾寒羊瘤胃液，利用DFCCS-Ⅱ型雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)。發(fā)酵罐恒溫水浴系統(tǒng)設(shè)定為39℃，固相食糜和液相食糜收集罐的制冷系統(tǒng)設(shè)定為4℃，二氧化碳通入的速度以40 ml/min，控制緩沖液流速的蠕動(dòng)泵設(shè)置為1.08 ml/min（10%/h），調(diào)節(jié)液相外流速度的蠕動(dòng)泵設(shè)置為0.43 ml/min（4%/h），電機(jī)控制發(fā)酵罐內(nèi)大小扇葉的轉(zhuǎn)速，設(shè)定間歇攪拌，儀器運(yùn)轉(zhuǎn)25 min，停止5 min，如此反復(fù)，使消化罐里的食糜間歇性分層，達(dá)到非常理想的攪拌效果。采用單因素4水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)水平設(shè)3個(gè)重復(fù)，預(yù)飼期7 d，正試期3 d。

1.2 試驗(yàn)飼糧

配制粗蛋白質(zhì)水平分別為12%、14%、16%、18%的4種飼糧，粗精比4∶6，各組飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。按照飼糧配方制成全混合顆粒料，風(fēng)干至水分含量10%左右，用封口袋分裝后于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。每?:00和20:00投料16 g/次。

1.3 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

正試期，每天在投料后2 h和下一次投料前2 h(投料后10 h)采集雙外流系統(tǒng)中瘤胃液食糜10 ml/次。用Sartorius PB-21型pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值；通過(guò)4層紗布過(guò)濾后，4 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 ml，加入9.5 ml 0.2 mol鹽酸溶液，搖勻，參照馮宗慈比色法[2]測(cè)定NH3-N；另取1 ml上清液，加入0.2 ml 25%的偏磷酸，混勻，應(yīng)用Agilent 7890B氣象色譜儀測(cè)定VFA；另取5 ml上清液，參照Cotta[3]、Broderick[4]差速離心法測(cè)定BCP濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因子方差分析（one-way ANOVA），并用Duncan's法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

表1 試驗(yàn)飼糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液pH值的影響

飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液pH值影響顯著（P＜0.05）（見(jiàn)表2）。各組瘤胃液pH值在6.38～6.70之間變化。投料后2 h，隨著粗蛋白質(zhì)水平的提高，pH值呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，18%水平顯著高于12%、14%、16%水平（P＜0.05），12%、14%、16%水平之間差異不顯著（P＞0.05）。投料前2 h，隨著粗蛋白質(zhì)水平的提高，pH值呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢(shì)，12%、16%、18%水平顯著高于14%水平（P＜0.05）。16%水平的pH值在投料后2 h顯著低于投料前2 h（P＜0.05），其它3組投料后2 h瘤胃pH值均低于下一次投料前2 h，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同粗蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)瘤胃pH值的影響

2.2 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃NH3-N濃度的影響

飼糧粗蛋白質(zhì)水平為14%時(shí)對(duì)瘤胃NH3-N濃度影響極顯著（P＜0.01）（見(jiàn)表3）。隨著粗蛋白質(zhì)水平提高，NH3-N濃度線性增加。投料后2 h，18%水平顯著高于14%、16%水平（P＜0.05），極顯著高于12%水平（P＜0.01），16%水平顯著高于12%水平（P＜0.05）。投料前2 h，18%水平顯著高于14%、16%水平（P＜0.05），極顯著高于12%水平（P＜0.05），14%、16%水平顯著高于12%水平（P＜0.05）。14%水平的NH3-N濃度在投料后2 h顯著高于投料前2 h（P＜0.05），其它3組投料后2 h瘤胃NH3-N濃度均高于下一次投料前2 h，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同粗蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)瘤胃NH3-N濃度的影響（mg/100 ml）

2.3 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃中VFA濃度的影響

投料后2 h，飼糧粗蛋白質(zhì)16%水平與粗蛋白質(zhì)12%、18%水平相比對(duì)瘤胃液總VFA濃度影響顯著（P＜0.05）；投料前2 h，飼糧粗蛋白質(zhì)14%水平與粗蛋白質(zhì)12%、18%水平相比對(duì)瘤胃液總VFA濃度影響顯著（P＜0.05）。粗蛋白質(zhì)12%水平與粗蛋白質(zhì)18%水平相比對(duì)乙丙比影響顯著（P＜0.05）（表4）。不同飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液乙酸、丙酸和丁酸濃度影響不顯著（P＞0.05）。除乙丙比外，投料后2 h乙酸、丙酸、丁酸及總VFA濃度均高于下一次投料前2 h。

2.4 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液BCP濃度的影響

飼糧粗蛋白質(zhì)水平為16%時(shí)對(duì)瘤胃液BCP濃度影響顯著（P＜0.05）（見(jiàn)表5）。隨著粗蛋白質(zhì)水平提高，BCP濃度先升高后降低，16%水平BCP濃度最高。投料后2 h，16%水平顯著高于其它水平（P＜0.05），其它水平之間差異不顯著（P＞0.05）。投料前2 h，16%、18%水平顯著高于12%、14%水平（P＜0.05）。投料后2 h瘤胃BCP濃度均高于下一次投料前2 h。

表4 不同粗蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)瘤胃VFA濃度的影響（mmol/l）

表5 不同粗蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)瘤胃BCP濃度的影響（mg/100 ml）

3 討論

3.1 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液pH值的影響

瘤胃液pH值是綜合反映反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵水平和內(nèi)環(huán)境的重要指標(biāo)，可以通過(guò)測(cè)量瘤胃pH值評(píng)定瘤胃發(fā)酵[5]。Hoover等[6]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃pH值在正常的范圍之內(nèi)有利于飼料的消化、降解和利用。一般情況下，瘤胃內(nèi)pH值的波動(dòng)范圍為6～7，本試驗(yàn)瘤胃液pH值在6.38～6.70之間，屬于正常范圍。提高飼糧粗蛋白質(zhì)水平導(dǎo)致瘤胃液NH3-N濃度增加，瘤胃液中VFA的吸收速度高于NH3-N，是pH值升高的主要原因[7]。本試驗(yàn)投料后隨著粗蛋白質(zhì)水平的提高，pH值呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)與王春梅[1]的研究結(jié)果一致。投料前隨著粗蛋白質(zhì)水平提高pH值呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，由于飼糧經(jīng)過(guò)10 h的消化和降解，各組瘤胃微生物對(duì)NH3-N和VFA的降解速度不同，導(dǎo)致pH值沒(méi)有明顯的規(guī)律性。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，投料后的瘤胃pH值小于下一次投料前，其中16%水平的pH值在投料前后差異顯著，說(shuō)明投料后微生物對(duì)飼糧的發(fā)酵作用較強(qiáng)烈，可產(chǎn)生大量的VFA等酸性物質(zhì)，瘤胃pH值較低，由于瘤胃具有較強(qiáng)的緩沖能力，使pH值在投料前又顯著升高。

3.2 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液NH3-N合成的影響

氨態(tài)氮是飼糧中含氮物質(zhì)的分解產(chǎn)物，同時(shí)也是瘤胃微生物發(fā)酵的主要氮源，影響微生物的活性。Lobley等[8]研究表明，瘤胃中NH3-N濃度與飼糧粗蛋白質(zhì)水平密切相關(guān)，瘤胃內(nèi)飼糧粗蛋白質(zhì)降解使NH3-N濃度升高，NH3-N濃度被瘤胃微生物攝取、瘤胃壁吸收以及隨食糜外排逐漸降低。Crawford等[9]認(rèn)為，NH3-N濃度升高表明粗蛋白質(zhì)含量和降解率高，兩者成正相關(guān)。本試驗(yàn)NH3-N的濃度范圍在13.52～21.76 mg/100 ml，符合Preston等[10]提出的微生物生長(zhǎng)對(duì)NH3-N耐受的臨界范圍（6～30 mg/100 ml）。隨著飼糧粗蛋白質(zhì)水平升高，瘤胃NH3-N濃度增加，主要是由于大部分NH3-N來(lái)自飼糧中粗蛋白質(zhì)的降解，與Dung[11]、Ghorbani[12]的研究結(jié)果一致。由于NH3-N被瘤胃微生物攝取并隨食糜排出，投料后的瘤胃NH3-N濃度高于下一次投料前，14%水平的NH3-N濃度在投料前后差異顯著，說(shuō)明該水平的飼糧在投料后，瘤胃微生物對(duì)含氮物質(zhì)的利用率高。

3.3 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃內(nèi)VFA生成的影響

乙酸、丙酸和丁酸等VFA主要來(lái)自瘤胃碳水化合物的降解，占總VFA的95%左右，其中乙酸占總VFA的70%～75%[13]。瘤胃VFA的生成及發(fā)酵類型主要與飼糧結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[14]。本試驗(yàn)，乙酸含量在34.62～41.54 mmol/l；丙酸含量在20.81～25.75 mmol/l；丁酸含量在9.19～13.75 mmol/l；乙丙比含量在1.52～1.81 mmol/l，總揮發(fā)性脂肪酸含量在66.45～77.50 mmol/l，除了乙酸濃度偏低，其它含量與Dung[11]的測(cè)定結(jié)果相近。16%水平總VFA濃度顯著高于12%、18%水平，由于飼糧粗蛋白質(zhì)水平較高，提供了充足的氮源，有利于瘤胃微生物的繁殖，而微生物增多加大了對(duì)碳水化合物的需要，因此導(dǎo)致了上述結(jié)果。盡管飼糧粗蛋白質(zhì)水平對(duì)乙酸、丙酸、丁酸含量影響不顯著，但其濃度隨粗蛋白質(zhì)水平的提高先升高后降低，與Dung[11]研究結(jié)果一致。隨著飼糧的降解、消化及食糜的外排，投料后乙酸、丙酸、丁酸及總VFA濃度均高于下一次投料前，12%水平的乙酸在投料前后差異顯著，說(shuō)明飼糧發(fā)酵時(shí)間對(duì)碳水化合物的降解和利用有一定的影響。

3.4 飼糧粗蛋白質(zhì)水對(duì)瘤胃內(nèi)BCP合成的影響

菌體蛋白是瘤胃微生物通過(guò)發(fā)酵過(guò)程合成的，瘤胃中BCP的合成量主要受VFA和NH3-N含量以及二者平衡程度的影響，能夠提供反芻動(dòng)物所需蛋白的40%～80%[15]。本試驗(yàn)粗蛋白質(zhì)水平升高，BCP合成增多，但18%水平BCP含量低于16%水平，是由于18%水平VFA濃度低，繼而影響了BCP的合成量。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)在體外培養(yǎng)條件下，粗蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液pH值、NH3-N、乙丙比、總VFA及BCP濃度均有顯著影響。隨著粗蛋白質(zhì)水平的提高，pH值、NH3-N濃度升高；乙酸與丙酸的比值降低；總VFA、BCP濃度呈先升高后降低的趨勢(shì)，其濃度以粗蛋白質(zhì)水平為16%的飼糧最高。飼糧的發(fā)酵時(shí)間對(duì)瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)也有顯著影響。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，粗蛋白質(zhì)水平為16%的飼糧最有利于小尾寒羊瘤胃內(nèi)環(huán)境發(fā)酵。