通補消積飲對人肺腺癌A549細胞Cyclin D1蛋白表達的影響

通補消積飲對人肺腺癌A549細胞Cyclin D1蛋白表達的影響

李義君1，全麗娜2，劉建秋3

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院，哈爾濱 150040；

3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040)

摘要：目的研究通補消積飲對A549細胞Cyclin D1蛋白表達的影響。方法應用Western-blot法觀察通補消積飲對A549細胞Cyclin D1蛋白表達的影響。結(jié)果通補消積飲低、中、高劑量組含藥血清作用A549細胞48 h后,Cyclin D1蛋白相對表達量分別為(0.739±0.051),(0.520±0.047)，(0.395±0.035)，通補消積飲各劑量組與空白血清組(0.881±0.062)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，在一定的時間內(nèi)表現(xiàn)出明顯的量-效關(guān)系。結(jié)論通補消積飲能明顯抑制A549細胞Cyclin D1蛋白的表達。

關(guān)鍵詞：通補消積飲；A549；Cyclin D1

DOI::10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.06.027

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)06-0617-02

基金項目:黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目(12521509)。

作者簡介:李義君(1979-)，男，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥治療惡性腫瘤的臨床與實驗研究。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2014-09-24)

Tongbu Xiaoji decoction on expression of Cyclin D1 in human lung adenocarcinoma cell line A549

LI Yijun1,QUAN Lina2,LIU Jianqiu3

(1.Heilongjiang University Second Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150001,China;

2.The Third Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150040,China;

3.Heilongjiang University First Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of the Tongbu-Xiaoji decoction to the expression of Cyclin D1 of A549 cells.MethodsThe protein expression of Cyclin D1 in A549 cells were evaluated by Western blot.ResultsTongbu-Xiaoji decoction with low、median and high dose medicated serum were used to affected A549 cell.After 48 h,the protein expression of Cyclin D1 of A549 cells significantly decreased and the values were (0.739±0.051),(0.520±0.047) and (0.395±0.035).Compared with that of blank group,Tongbu-Xiaoji decoction with low,median and high dose medicated serum (0.881±0.062) had a significant difference (P<0.05,P<0.01),and the affection shows a dose-dependent manner.ConclusionTongbu Xiaoji decoction inhibited the protein expression of Cyclin D1 in A549 cells significantly.

Keywords:Tongbu Xiaoji decoction;A549;Cyclin D1

中醫(yī)藥在中晚期肺腺癌的治療上有其獨特理念和實際優(yōu)勢[1]。通補消積飲是多年臨證中總結(jié)的經(jīng)驗方，筆者研究通補消積飲對A549細胞Cyclin D1蛋白表達的影響，總結(jié)報道如下。

1實驗材料

人肺腺癌A549細胞，Wistar雄性大鼠。二氧化碳孵育箱；醫(yī)用超凈工作臺；高速臺式離心機；低速離心機；電熱恒溫水槽；電泳儀；垂直電泳槽及制膠裝置；酶標儀。通補消積飲中藥復方由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬二院飲片藥局提供。RIPA裂解液；Bradford法蛋白定量試劑盒；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)；ECL試劑盒；Beta Actin antibody；Cyclin D1 antibody。

2實驗方法

2.1含藥血清制備Wistar雄性大鼠16只隨機分為4組，每組4只。通補消積飲低、中、高劑量組給藥劑量分別為28，56，112 g/(kg·d)，分2次灌胃;空白血清組：灌生理鹽水，分2次灌胃；連續(xù)給藥5 d，第5天灌服1 d劑量2 h后將大鼠麻醉，心臟穿刺采血取含藥血清，過濾除菌，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2Western-blot法檢測通補消積飲對A549細胞Cyclin D1蛋白表達的影響

2.2.1蛋白的提取將A549細胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入各組血清作用48 h后收集細胞,加入適量細胞裂解液充分混勻，充分裂解后離心5 min，取上清。

2.2.2Bradford法進行蛋白定量用Bradford 染色液測定樣品吸收值A(chǔ)595，根據(jù)測得的吸收值，在標準曲線上即可查得樣品的蛋白含量。

2.2.3Western-blot分析1)SDS-PAGE電泳；2)轉(zhuǎn)膜；3)封閉；4)孵育抗體；5)顯色；6)應用ImageJ圖像分析軟件對Western-blot圖片進行灰度分析。

3實驗結(jié)果

從結(jié)果分析以及Western-blot圖片(圖1)中可以看出，通補消積飲含藥血清作用A549細胞48 h后，Cyclin D1蛋白表達明顯降低，且隨著劑量的增加，Cyclin D1蛋白表達逐漸下調(diào)。各組Cyclin D1蛋白相對表達量分別為空白血清組(0.881±0.062)，通補消積飲低劑量組(0.739±0.051)，中劑量組(0.520±0.047)，高劑量組(0.395±0.035)。通補消積飲各劑量組與空白血清組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，并表現(xiàn)出明顯劑量依賴性。

A：空白血清組　B：通補消積飲低劑量組　C：通補消積飲中劑量組　D：通補消積飲高劑量組 圖1　通補消積飲含藥血清作用A549細胞48 h后Cyclin D1蛋白表達結(jié)果

4討論

細胞周期素D1(Cyclin D1)是重要的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白,在細胞周期的正常調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。Cyclin D1是G1期細胞周期素，其與細胞周期依賴性激酶4(CDK4)或細胞周期依賴性激酶6(CDK6)結(jié)合呈復合物,激活CDK4的蛋白激酶活性，促使Rb蛋白磷酸化，磷酸化的Rb蛋白釋放出與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，導致DNA合成，促進細胞由G1期進入S期[2]。因此，如果Cyclin D1發(fā)生過度表達，引起細胞增殖的周期失調(diào)，細胞過度增殖導致腫瘤發(fā)生。Cyclin D1基因結(jié)構(gòu)及表達異常常見于肺腺癌和鱗癌[3]。研究證實[4-8]，Cyclin D1在非小細胞肺癌組織中存在過度表達。

中晚期非小細胞肺癌的主要證型是氣陰兩虛型[9-10]。氣陰兩虛貫穿于肺癌的始終，與肺臟的生理特性有密切相關(guān)[11]。通補消積飲由生曬參、麥冬、黃芪、北沙參、全瓜蔞、貝母、薏苡仁、白術(shù)、半夏、陳皮、半枝蓮、白花蛇舌草、山慈菇、蚤休、大黃、莪術(shù)、甘草，共17味藥物組成。通補消積飲是針對中晚期肺腺癌病人以氣陰兩虛為主兼痰、瘀、毒結(jié)的病因病機而擬定的經(jīng)驗方。實驗結(jié)果表明，通補消積飲能明顯下調(diào)A549細胞中Cyclin D1蛋白表達。通補消積飲對A549細胞抑制增殖的可能機制是：通補消積飲能明顯降低Cyclin D1蛋白在A549細胞中的表達，減少Cyclin D1蛋白與CDK4或CDK6的結(jié)合，從而抑制CDK4的蛋白激酶活性和Rb蛋白的磷酸化，使DNA的合成受阻，最終表現(xiàn)為對A549細胞的增殖抑制，實現(xiàn)其治療肺癌的目的。

參考文獻：

[1]劉偉勝,徐凱.腫瘤科專病中醫(yī)臨床診治[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:168-181.

[2]張朝暉,徐正順,吉巧紅.非小細胞肺癌組織中cyclin D1、p16和Rb蛋白表達的意義[J].洛陽醫(yī)專學報,2001,19(1):10-12.

[3]WELCKER M,LUKAS J,STRUSS M,et al.Enhanced protein stability anovelm echanism of D-type cyclin over-abundance in dentified in human Sarcoma cells[J].Oncogene,1996,13(2):419-425.

[4]王鴻程,曹乃清,張程,等.cyclinD1,Bax及MDR1在非小細胞肺癌中的表達及生物學特性[J].細胞與分子免疫學雜志,2006,22(6):781-783.

[5]FU M F,WANG C G,LI Z P,et al.Cyclin D1:normal and abnormalfunctions[J].Endocrinology,2004,145(12):5439-5447.

[6]王鳳陽,常智杰.轉(zhuǎn)錄因子類癌基因-STAT3[J].生物化學與生物物理進展,2002,29(3):348-351.

[7]DWORAKOWSKA D,JASSEM E,JASSEM J,et al.Prognostic value of cyclin D1 overexpression in correlationwith pRb and p53 status in non-small cell lung cancer (NSCLC)[J].JCancerResClin Oncol,2005,131(7):479-485.

[8]梁瑞韻,廖增順,江山平,等.Cyclin D1和VEGF在非小細胞肺癌組織中的表達及其與預后的關(guān)系[J].癌癥,2003,22(1):86-90.

[9]孫建立,劉嘉湘,徐蔚杰.原發(fā)性支氣管肺癌中醫(yī)證的特征研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志,2007,13(7):536-537.

[10]劉嘉湘.中醫(yī)藥治療肺癌研究思路和臨床經(jīng)驗[J].世界中醫(yī)藥,2007,2(2):67-70.

[11]孫宏新,孫君.周宜強教授診治肺癌經(jīng)驗[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2000,7(4):68-69.