殼寡糖對(duì)副溶血弧菌和溶藻弧菌抑制作用的研究

■ 袁香麗 宋 凱 王 玲 張春曉 李曉麗

(1.集美大學(xué)農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門(mén)361021；2.集美大學(xué)廈門(mén)市飼料檢測(cè)與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門(mén)361021)

殼寡糖(Oligochitosan，COS)是指2～10個(gè)氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的低聚糖，也是自然界中大量存在的唯一的堿性氨基寡糖[1]，研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖具有調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、抑制腫瘤生長(zhǎng)及抗炎反應(yīng)、增強(qiáng)骨強(qiáng)度、抗菌、抗瘧疾等作用[2-6]。研究認(rèn)為，殼寡糖分子中的游離氨基帶正電荷，可以與微生物表面的脂多糖和蛋白等陰離子物質(zhì)發(fā)生靜電相互作用，從而改變微生物細(xì)胞膜的通透性，阻止外界營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入和細(xì)胞內(nèi)成分的釋放，最終導(dǎo)致微生物死亡[7-8]。殼寡糖具有廣譜抑菌活性，可以抑制多種植物病原菌、食品微生物以及人體和其它動(dòng)物病原菌的生長(zhǎng)。

副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）和溶藻弧菌（V.alginolyticus）是對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中兩種重要的致病弧菌，發(fā)病率高，危害大。研究報(bào)道，溶藻弧菌會(huì)引起對(duì)蝦黑鰓病和褐斑病，副溶血弧菌則引起對(duì)蝦紅腿病等[9]。對(duì)于弧菌病的防治，以往一直采用抗生素和消毒劑等化學(xué)藥物治療，然而使用化學(xué)藥物會(huì)引起藥物殘留和抗藥性的問(wèn)題，不僅造成環(huán)境污染，而且給食品安全帶來(lái)危害。殼寡糖作為一種新型的綠色飼料添加劑，其資源豐富，且無(wú)毒、無(wú)副作用，并且可以抑制有害菌，應(yīng)用前景廣闊，而有關(guān)殼寡糖對(duì)副溶血弧菌和溶藻弧菌抑制作用的研究尚不深入。

本試驗(yàn)選用副溶血弧菌和溶藻弧菌做為研究對(duì)象，采用平板計(jì)數(shù)法確定殼寡糖的作用濃度，研究殼寡糖對(duì)蝦養(yǎng)殖中常見(jiàn)弧菌的抑制效果，旨在為殼寡糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌

副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）和溶藻弧菌（V.alginolyticus），由集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室從感染這兩種弧菌的凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)分離得到。

1.2 主要試劑

殼寡糖（所用殼寡糖分子量≤2 000 Da，脫乙酰度≥90%，聚合度2～8，來(lái)源于螃蟹殼，中泰和（北京）科技發(fā)展有限公司）、牛肉膏（上海源聚生物科技有限公司）、胰蛋白胨（北京陸橋技術(shù)有限公司）、瓊脂粉（上海捷瑞生物工程有限公司）、酵母提取物（英國(guó)OXOID）、氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）等。

1.3 殼寡糖溶液的配制

配制好的殼寡糖溶液，滅菌后備用。不同添加水平殼寡糖溶液的配制見(jiàn)表1。

表1 殼寡糖溶液的配制

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化

菌種活化所用的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，配好的培養(yǎng)基置于100 ml的錐形瓶中經(jīng)121℃滅菌20 min后從滅菌鍋里取出，放置在無(wú)菌操作臺(tái)里，通風(fēng)冷卻至室溫，接種副溶血弧菌和溶藻弧菌后于37℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，進(jìn)行第一次活化；第二次活化時(shí)將配好的LB液體培養(yǎng)基置于250 ml的錐形瓶進(jìn)行活化，方法同第一次。菌體第二次活化完成后以10倍梯度稀釋涂布法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4.2 殼寡糖對(duì)副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）的抑制試驗(yàn)

取菌液用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)比苎【♂屩?0-6，溶藻弧菌稀釋至10-5。試驗(yàn)時(shí)吸取1 ml的菌懸液與1 ml殼寡糖溶液置于5 ml離心管中混勻，放置培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，分別在0、2、4、6 h進(jìn)行平板涂布，24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±S.E.）”表示，采用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），若存在顯著的差異，則采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 殼寡糖對(duì)副溶血弧菌的抑制作用（見(jiàn)表2）

由表2可知，不同濃度殼寡糖組隨著濃度升高，副溶血弧菌活菌數(shù)均有所減少，且隨著殼寡糖濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)其對(duì)副溶血弧菌的抑制作用增強(qiáng)。殼寡糖濃度為0%時(shí)，作用時(shí)間0 h除外，在任何時(shí)間點(diǎn)的活菌落數(shù)均顯著高于其他添加殼寡糖水平組（P＜0.05），作用時(shí)間0 h，殼寡糖濃度為0.03%時(shí)，活菌落數(shù)顯著高于0.12%殼寡糖組（P＜0.05），與其他組差異不顯著（P＞0.05）；0.09%、0.12%的殼寡糖溶液作用時(shí)間在2、4、6 h時(shí)各組活菌數(shù)量顯著低于其他組（P＜0.05），作用時(shí)間為6 h時(shí)，殼寡糖溶液濃度為0.09%和0.12%試驗(yàn)組的活菌落數(shù)均低于其他各組。

表2 不同濃度的殼寡糖對(duì)副溶血弧菌數(shù)量的影響

2.2 殼寡糖對(duì)溶藻弧菌的抑制作用（見(jiàn)表3）

由表3可知，殼寡糖溶液對(duì)溶藻弧菌作用0 h時(shí)，0%、0.03%、0.06%組之間溶藻弧菌活菌數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），但與0.09%和0.12%組相比，活菌數(shù)量顯著高于這兩組（P＜0.05）；當(dāng)殼寡糖溶液對(duì)溶藻弧菌作用時(shí)間分別為2 h和4 h時(shí)，0%和0.03%組之間溶藻弧菌活菌數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），而0.09%和0.12%組溶藻弧菌活菌數(shù)顯著低于其他組（P＜0.05）；當(dāng)作用時(shí)間為6 h時(shí)，各組間均呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），且0.12%組殼寡糖組活菌數(shù)量最少。

表3 不同濃度的殼寡糖對(duì)溶藻弧菌數(shù)量的影響

3 討論

本研究結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)及殼寡糖濃度的增加，副溶血弧菌和溶藻弧菌活菌數(shù)量減少，意味著殼寡糖對(duì)兩種弧菌具有一定的抑制作用。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對(duì)大腸桿菌的抑制效果與作用時(shí)間具有顯著相關(guān)性，添加殼聚糖2 h后大腸桿菌數(shù)量顯著下降。王壽權(quán)等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度殼寡糖其抑菌時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)。閆海俠等[12]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)殼寡糖處理后大腸桿菌活菌數(shù)量在0～4 h內(nèi)明顯減少。本研究結(jié)果表明，時(shí)間顯著影響殼寡糖對(duì)兩種弧菌抑制效果，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)高濃度殼寡糖呈現(xiàn)出更好的抑菌效果。

有研究報(bào)道，殼寡糖的抑菌活性與其濃度密切相關(guān)。劉碧源等[13]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖和殼寡糖均具有明顯的抑菌作用，并且其抑菌活性隨著濃度的升高而增強(qiáng)。王壽權(quán)等[11]自制殼寡糖的抑菌試驗(yàn)表明，自制殼寡糖具有較強(qiáng)的抑菌活性，而且隨著濃度升高，抑菌活性不斷增強(qiáng)。謝勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度殼聚糖對(duì)幽門(mén)螺桿菌抑菌作用隨著殼聚糖濃度的增加而增強(qiáng)，但當(dāng)濃度大于4%時(shí),其抑菌作用不再增強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)，100～1 000 μg/ml殼聚糖能夠抑制R.solani和S.rolfsii孢子產(chǎn)生、萌發(fā)以及菌絲生長(zhǎng)，且抑制作用具有濃度依賴(lài)性[15]。Li等[16]發(fā)現(xiàn)，濃度為2 000 μg/ml殼聚糖能夠顯著抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，500 μg/ml殼聚糖乙酸鹽溶液反而能促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)，故而認(rèn)為低濃度殼聚糖可被微生物分解利用，并促進(jìn)其生長(zhǎng)。因此，目前研究者普遍認(rèn)為殼聚糖的抑菌性能是隨著濃度的增大而增強(qiáng)的[10，17-18]。本試驗(yàn)中所使用殼寡糖的分子量≤2 000 Da，脫乙酰度≥90%，聚合度為2～8，結(jié)果顯示，隨著殼寡糖濃度的增加，其具有較好的抑菌活性，這與上述研究結(jié)果類(lèi)似。

Pyo等[19]研究表明，雜殼聚糖及其寡糖對(duì)副溶血弧菌的抗菌效果與它們的分子量、脫乙酰度及所使用的菌株有關(guān)。Shin等[20]研究中處理非編織布料所用的殼寡糖分子量為1 814 Da，脫乙酰度為84%，當(dāng)濃度為0.01%時(shí)對(duì)普通變形桿菌的抑菌率就達(dá)到90%，而對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌需0.05%，對(duì)肺炎克雷伯桿菌和銅綠假單胞菌即使?jié)舛冗_(dá)到1.0%，抑菌率也只有30%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，殼寡糖對(duì)副溶血弧菌和溶藻弧菌的抑制作用皆隨其濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增強(qiáng)，但當(dāng)殼寡糖水平和作用時(shí)間不同時(shí)對(duì)兩種菌的抑制效果存在差異，說(shuō)明本試驗(yàn)條件下殼寡糖材料對(duì)副溶血弧菌和溶藻弧菌都有較好的抑制作用，且對(duì)不同病原菌的抑菌活性也存在一定差異。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中所用殼寡糖（分子量≤2 000 Da，脫乙酰度≥90%，聚合度為2～8）在體外對(duì)凡納濱對(duì)蝦致病菌——副溶血弧菌和溶藻弧菌皆有抑制作用，并且抑菌效果與殼寡糖濃度以及作用時(shí)間顯著相關(guān)，建議應(yīng)進(jìn)一步研究殼寡糖在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用。