復(fù)雜生物樣品中馬來酸依那普利的快速分析新方法

復(fù)雜生物樣品中馬來酸依那普利的快速分析新方法

楊天鳴，黃國貞，付海燕，周蓉，李鶴東，姜杜

(中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

摘要：建立了復(fù)雜生物基質(zhì)中馬來酸依那普利的快速檢測新方法。運(yùn)用高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-DAD)檢測技術(shù)結(jié)合自加權(quán)交替三線性分解(SWATLD)二階校正算法直接快速測定血漿、唾液和尿液生物基質(zhì)中馬來酸依那普利的含量，獲得血漿、唾液和尿液3種生物基質(zhì)中馬來酸依那普利的平均回收率分別為(98.0±3.7)%、(98.1±6.0)% 和(100.8±3.4)%。通過分析品質(zhì)因子，包括靈敏度(SEN)、選擇性(SEL)、檢測限(LOD)、檢測量(LOQ)和預(yù)測均方差(RMSEP)評估了該方法的性能，利用t-檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行了校驗(yàn)。結(jié)果表明，該方法具有的“二階優(yōu)勢”可在不同生物基質(zhì)樣中內(nèi)源化學(xué)物質(zhì)干擾共存下，有效分辨和定量分析馬來酸依那普利，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞：馬來酸依那普利；HPLC-DAD；SWATLD；血漿；唾液；尿液

基金項(xiàng)目：國家“十二五”科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012BAI27B00)，國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21205145)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(CZZ10005，CZY12028，CZY13019)

收稿日期：2015-05-15

作者簡介：楊天鳴(1962-)，男，湖北黃岡人，教授，主要從事藥物分析、化學(xué)生物學(xué)方面的研究，E-mail：tm28y@aliyun．com；通訊作者：付海燕，副教授，E-mail：fuhaiyan@mail．scuec．edu．cn。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.09.017

中圖分類號：O 657.72文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

馬來酸依那普利(enalapril maleate)是Ⅱ代長效血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)，主要用于治療原發(fā)性高血壓,是一種前體藥物[1]，水解后轉(zhuǎn)化為活性藥物，具有藥理作用平穩(wěn)、持續(xù)時(shí)間長、不良反應(yīng)小、安全有效等特點(diǎn)[2-3]。

目前，馬來酸依那普利的常用分析方法有酶動(dòng)力學(xué)法[4]、RP-HPLC法[1]、GC-MS法[5]、LC-MS法和HPLC-UV法[3]等。由于馬來酸依那普利的最大吸收波長為末端吸收，HPLC-UV法受結(jié)構(gòu)相近的非待測藥物和代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，在分析生物樣品之前，通常要經(jīng)過分離純化等處理過程；GC-MS和LC-MS法的樣品處理步驟繁瑣，且成本較高，不適合快速分析。鑒于此，作者采用HPLC-DAD結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)自加權(quán)交替三線性分解(SWATLD)[6]二階校正算法，在不需化學(xué)分離的情況下，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜生物基質(zhì)中馬來酸依那普利的快速準(zhǔn)確定量分析。

1實(shí)驗(yàn)

1.1　算法理論簡介

1.1.1SWATLD算法及原理

SWATLD算法沿用ATLD算法思路，通過交替最小化3個(gè)新的具有內(nèi)在聯(lián)系且與三線性模型相關(guān)的目標(biāo)函數(shù)，來完成三維數(shù)據(jù)陣的分解。

SWATLD算法的目標(biāo)函數(shù)為：

其中，diag(sqrt(1./diagm(ATA)))、diag(sqrt(1./diagm(BTB)))和diag(sqrt(1./diagm(CTC)))3個(gè)權(quán)重矩陣，以平衡每個(gè)目標(biāo)函數(shù)中的2個(gè)部分。

SWATLD算法除具有其它算法的優(yōu)點(diǎn)外，如對組分?jǐn)?shù)不敏感、收斂速度較快(一般迭代100次以內(nèi)就可以收斂)，因有求平均值的計(jì)算步驟還具有對噪聲不太敏感的特征。與同類算法相比，SWATLD具有較好的分析性能。

1.1.2品質(zhì)因子

本實(shí)驗(yàn)所考察的分析方法的品質(zhì)因子包括靈敏度(SEN)、選擇性(SEL)、檢測限(LOD)[7]、檢測量(LOQ)[7]和預(yù)測均方差(RMSEP)，計(jì)算方程為：

SEN = λ﹛[(ATA)·(BTB)]-1﹜nnT-1/2

(1)

SEL =﹛[(ATA)·(BTB)]-1﹜nnT-1/2

(2)

LOD = 3.3s(0)

(3)

LOQ = 10s(0)

(4)

(5)

式中：下標(biāo)nn表示矩陣[(ATA)·(BTB)]-1中的第(n，n)個(gè)元素；λ為單位濃度下組分n的總信號，也稱為濃度得分參數(shù)；s(0)為采用二階校正算法平行分析3個(gè)空白背景之后得到預(yù)測濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差；cact和cpred分別為第i個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的真實(shí)濃度和預(yù)測濃度；I為預(yù)測樣品的組分?jǐn)?shù)。

1.2　材料、試劑與儀器

健康成年SD大鼠[SCXK(鄂)2008-0005]，購于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

馬來酸依那普利標(biāo)準(zhǔn)品(批號：100705-200902)，中國藥品生物制品檢定所；磷酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，色譜純，美國 Tedia 公司；肝素(150 U·mg-1,水分0.49%)；超純水。

Ultimate 3000型高效液相色譜儀(DAD二極管陣列檢測器，WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器，LPG-3400SD四元梯度泵，TCC-3000RS柱溫箱，DIONEX Chromeleon色譜工作站),美國賽默飛-戴安有限公司；色譜柱：Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm),美國Thermo有限公司;Allegra 64R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3　方法

1.3.1色譜條件

流動(dòng)相：65%甲醇-35%磷酸溶液(用磷酸調(diào)pH=3.5±0.1)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測器：DAD；檢測波長：190～400 nm。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取馬來酸依那普利標(biāo)準(zhǔn)品0.0501 g于燒杯中，甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，靜置，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.3校正樣和驗(yàn)證樣的配制

用馬來酸依那普利標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制濃度(μg·mL-1)為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100的10個(gè)校正樣和濃度(μg·mL-1)分別為30、40、50、60、70、80的6個(gè)不加任何干擾物質(zhì)的驗(yàn)證樣(T1～T6)。

1.3.4生物樣品的制備

1.3.4.1生物樣品的預(yù)處理

大鼠血漿生物樣制備：取健康成年SD雄性大鼠6只，禁食(不禁飲水)12 h后，于大鼠眼眶靜脈叢采血約0.5 mL轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管(用肝素潤濕并揮發(fā)干)，在4 ℃、4 000 r·min-1條件下離心5 min，用微量移液器吸取血漿，保存于-40 ℃冰箱，備用。

人唾液生物樣制備：收集未服藥的健康志愿者自然狀態(tài)下分泌的唾液，在4 ℃、4 000 r·min-1條件下離心5 min，用微量移液器吸取上層清液，備用。

人尿液生物樣制備：收集未服藥的健康男性志愿者晨尿，在4 ℃、4 000 r·min-1條件下離心5 min，用微量移液器吸取上層清液，備用。

1.3.4.2供試品的配制

配制9個(gè)含100 μL血漿的馬來酸依那普利濃度(μg·mL-1)分別為10、20、30、40、60、70、80、90、100的血漿基質(zhì)樣品(P1～P9)以及3個(gè)只含100 μL血漿的血漿空白樣品；配制8個(gè)含500 μL唾液的馬來酸依那普利濃度(μg·mL-1)分別為30、40、50、60、70、80、90、100的唾液基質(zhì)樣品(S1～S8)以及3個(gè)只含500 μL唾液的唾液空白樣品；配制10個(gè)含 100 μL尿液的馬來酸依那普利濃度(μg·mL-1)分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100的尿液基質(zhì)樣品(U1～U10)以及3個(gè)只含100 μL尿液的尿液空白樣品。

2結(jié)果與討論

2.1　三維數(shù)據(jù)陣校正模型的構(gòu)建和驗(yàn)證

采用HPLC-DAD檢測儀器，獲得物質(zhì)190～400 nm的檢測數(shù)據(jù)。已知馬來酸依那普利是一個(gè)復(fù)鹽，在HPLC檢測時(shí)會(huì)出現(xiàn)2個(gè)色譜峰。從馬來酸依那普利不同波長的高效液相色譜流出圖(圖1)中可以看到，在3.7 min有馬來酸的峰，依那普利則在4.4 min左右出峰。

為了用于數(shù)據(jù)解析，截取3.5～5.0 min和210～220 nm的色譜數(shù)據(jù)，組成451×11×16(校正樣+驗(yàn)證樣)的三維數(shù)據(jù)陣模型。用SWATLD算法校正結(jié)果見表1。

圖1　馬來酸依那普利不同波長的高效液相色譜流出圖 Fig.1　HPLC Chromatogram of enalapril maleate at different wavelengths

2.2　復(fù)雜生物基質(zhì)樣品中馬來酸依那普利的SWATLD定量解析

表1馬來酸依那普利驗(yàn)證樣SWATLD算法校正分析結(jié)果

Tab.1Results of enalapril maleate validation samples
based on calibration of SWATLD algorithm

樣品編號 加入馬來酸依那普利濃度 μg·mL-1 回收率 %T130106.2T240107.9T35096.1T460103.2T570100.2T680100.7平均回收率/%102.4±4.3RMSEP/(μg·mL-1)4.90T(t-test)t50.05=2.011.34

2.2.1血漿基質(zhì)樣品中馬來酸依那普利的解析

血漿基質(zhì)樣品的三維高效液相色譜如圖2所示。

圖2　血漿基質(zhì)樣品的三維高效液相色譜 Fig.2　Three-dimensional HPLC chromatogram of plasma matrix samples

由圖2可見，血漿空白樣品在實(shí)驗(yàn)所選區(qū)域內(nèi)對馬來酸依那普利的準(zhǔn)確測定有一定的干擾。如果不對樣品進(jìn)行化學(xué)分離，進(jìn)行常規(guī)色譜檢測會(huì)造成困難，對分析結(jié)果有較大的影響。HPLC-DAD結(jié)合SWATLD算法能很好地解決這一問題，可以在空白干擾明顯的情況下，不需對樣品進(jìn)行化學(xué)分離，直接實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)組分馬來酸依那普利的定量解析(表2)。

2.2.2唾液基質(zhì)樣品中馬來酸依那普利的解析

唾液基質(zhì)樣品的三維高效液相色譜如圖3所示。

圖3　唾液基質(zhì)樣品的三維高效液相色譜 Fig.3　 Three-dimensional HPLC chromatogram of saliva matrix samples

由圖3可見，唾液空白樣品在實(shí)驗(yàn)所選區(qū)域內(nèi)對馬來酸依那普利的準(zhǔn)確測定有一定的干擾，如果不對樣品進(jìn)行化學(xué)分離，進(jìn)行常規(guī)色譜檢測會(huì)造成困難，對分析結(jié)果有較大的影響。HPLC-DAD結(jié)合SWATLD算法不需對樣品進(jìn)行化學(xué)分離，可直接實(shí)現(xiàn)對其中目標(biāo)組分馬來酸依那普利的定量解析(表2)。

2.2.3尿液基質(zhì)樣品中馬來酸依那普利的解析

尿液基質(zhì)樣品的三維高效液相色譜如圖4所示。

圖4　尿液基質(zhì)樣品的三維高效液相色譜 Fig.4　Three-dimensional HPLC chromatogram of urine matrix samples

由圖4可見，尿液空白樣品在實(shí)驗(yàn)所選區(qū)域內(nèi)對馬來酸依那普利的準(zhǔn)確測定有一定的干擾，如果不對樣品進(jìn)行化學(xué)分離，進(jìn)行常規(guī)色譜檢測會(huì)造成困難，對分析結(jié)果有較大的影響。HPLC-DAD結(jié)合SWATLD算法不需對樣品進(jìn)行化學(xué)分離，可直接實(shí)現(xiàn)對其中目標(biāo)組分馬來酸依那普利的定量解析(表2)。

2.2.4不同生物基質(zhì)樣品中馬來酸依那普利的SWATLD定量解析結(jié)果

分別截取血漿基質(zhì)樣品、唾液基質(zhì)樣品、尿液基質(zhì)樣品3.5～5.0 min和210～220 nm的色譜數(shù)據(jù)與樣本(校正樣+預(yù)測樣)，組成451×11×19、451×11×18、451×11×20的三維數(shù)據(jù)陣模型，用SWATLD多維數(shù)據(jù)解析方法進(jìn)行定量解析，結(jié)果見表2。

表2不同生物基質(zhì)樣品中馬來酸依那普利的SWATLD定量解析結(jié)果

Tab.2Results of enalapril maleate in different biological matrices samples based
on calibration of SWATLD algorithm

血漿生物基質(zhì)樣品樣品編號預(yù)測值/(μg·mL-1)回收率/%唾液生物基質(zhì)樣品樣品編號預(yù)測值/(μg·mL-1)回收率/%尿液生物基質(zhì)樣品樣品編號預(yù)測值/(μg·mL-1)回收率/%P110.42104.2S128.4394.8U19.4094.0P220.28101.4S243.96109.9U219.8499.2P330.56100.6S346.6293.3U330.39101.3P439.5698.9S455.4192.4U442.27105.7P559.7799.6S563.9891.4U552.61105.2P665.8794.1S680.20100.3U662.41104.0P773.7492.2S789.6899.6U768.4497.8P888.0397.8S8103.09103.1U881.61102.0P993.5393.5U990.57100.6U1098.4398.4平均回收率/%98.0±3.798.1±6.0 100.8±3.4 RMSEP/(μg·mL-1)2.863.45 1.41 T(t-test)1.47

由表2可知，對血漿基質(zhì)樣品、唾液基質(zhì)樣品和尿液基質(zhì)樣品的平均回收率分別為(98.0±3.7)%、(98.1±6.0)%和(100.8±3.4)%；RMSEP分別為2.86 μg·mL-1、3.45 μg·mL-1和1.41 μg·mL-1，并且在95%的置信水平下，不同生物基質(zhì)樣品的回收率和理想值100%所對應(yīng)的t-檢驗(yàn)結(jié)果沒有顯著性差異，說明SWATLD算法對于這3種生物基質(zhì)樣品的預(yù)測結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.5品質(zhì)因子的考察

SWATLD算法預(yù)測3種不同生物基質(zhì)樣品中馬來酸依那普利的含量，其品質(zhì)因子(靈敏度SEN、選擇性SEL、檢測限LOD、檢測量LOQ)考察結(jié)果見表3。

表3SWATLD算法品質(zhì)因子考察結(jié)果

Tab.3Results of quality factors by SWATLD algorithm

樣品SELSENμg·mL-1LODμg·mL-1LOQμg·mL-1血漿0.0020.032.597.84唾液0.182.700.270.81尿液0.010.230.742.24

由表3可知，SWATLD算法對3種不同生物基質(zhì)樣品中馬來酸依那普利的預(yù)測性能良好，能在復(fù)雜生物基質(zhì)樣品中選擇性準(zhǔn)確檢測目標(biāo)組分。

3結(jié)論

運(yùn)用高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-DAD)檢測技術(shù)結(jié)合自加權(quán)交替三線性分解(SWATLD)二階校正算法直接快速測定血漿、唾液和尿液生物基質(zhì)樣品中馬來酸依那普利的含量，與普通色譜檢測相比，無需進(jìn)一步的提取分離以及優(yōu)化色譜分離條件等步驟，通過與SWATLD二階校正算法結(jié)合，利用該方法的“二階優(yōu)勢”，克服了血漿、唾液和尿液體系中未知組分的干擾，通過“數(shù)學(xué)分離”代替或部分代替“化學(xué)分離”，從而簡化了樣品預(yù)處理以及分析檢測的步驟，并減少有機(jī)溶劑的污染，同時(shí)也提高了分析效率，再次證明該方法的可行性及其在復(fù)雜生物樣品分析方面的巨大優(yōu)勢，為臨床實(shí)時(shí)快速準(zhǔn)確定量分析體液中馬來酸依那普利含量提供一種新型的方法。

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A Method for Fast Determination of Enalapril Maleate

in Complex Biological Matrices

YANG Tian-ming,HUANG Guo-zhen,FU Hai-yan,ZHOU Rong,LI He-dong,JIANG Du

(CollegeofPharmacy,South-CentralUniversityforNationalities,Wuhan430074,China)

Abstract：A method for fast determination of enalapril maleate in complex biological matrices was developed.The content of enalapril maleate in plasma，saliva and urine matrices were directly and rapidly determinated by HPLC-DAD combined with the second-order correction algorithm of SWATLD.The average recovery of enalapril maleate in three biological matrices of plasma，saliva and urine were (98.0±3.7)%，(98.1±6.0)% and (100.8±3.4)%,respectively.The performance of the method was evaluated by analyzing the quality factors，including sensitivity(SEN)，selectivity(SEL)，limit of detection(LOD),limit of quantitation(LOQ) and RMSEP.t-Test was used to check the results. This method had the “second-order advantage”.Enalapril maleate was distinguished efficiently and analyzed quantitatively in the presence of different biological matrixs with endogenous substances,and the analytical results were accurate and reliable.

Keywords：enalapril maleate；HPLC-DAD；SWATLD；plasma；saliva；urine