雞胚小腸上皮細胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定

詹 康 左曉昕 貢笑笑 陳銀銀 占今舜 趙國琦（揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009）

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雞胚小腸上皮細胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定

詹 康 左曉昕 貢笑笑 陳銀銀 占今舜 趙國琦?
（揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009）

摘 要：本試驗旨在提供雞小腸上皮細胞的體外分離方法，為進一步研究雞腸道疾病的致病機理、雞腸道營養(yǎng)物質轉運吸收與免疫機理提供模型。本試驗采用組織塊培養(yǎng)法來分離培養(yǎng)雞小腸上皮細胞。運用刮除法、酶消化法、有限稀釋法純化雞小腸上皮細胞。利用噻唑藍（MTT）法來鑒定雞小腸上皮細胞生長情況。通過實時熒光定量PCR（RT?PCR）檢測雞小腸上皮細胞特異性基因的表達來鑒定雞小腸上皮細胞。結果表明：1）采用組織塊細胞培養(yǎng)法能夠成功獲得雞小腸上皮細胞系。2）接種組織塊8 h內雞小腸上皮細胞開始大量增殖。3）雞小腸上皮細胞的生長曲線為“S”形，符合細胞增殖規(guī)律。4）傳至第5代的雞小腸上皮細胞體積開始變大，細胞形態(tài)模糊并開始衰老凋亡；細胞傳代時進行接種，大量的細胞未貼壁。綜上所述，采用在6孔板內接種雞小腸組織快，能夠獲得具有穩(wěn)定性的雞小腸上皮細胞，為雞腸道疾病致病機理、雞腸道營養(yǎng)物質轉運吸收和永生化雞小腸上皮細胞提供細胞素材。

關鍵詞：雞小腸上皮細胞；營養(yǎng)免疫；穩(wěn)定性；永生化

腸道是抵御外來病原菌入侵體內的主要屏障和營養(yǎng)物質吸收的主要場所。雞小腸上皮細胞參與物質的消化吸收和免疫調控，并實時監(jiān)測外來入侵的病原微生物［1］。雞小腸上皮細胞是小腸組織內最重要的細胞，在消化吸收蛋白質、氨基酸以及轉運吸收小肽方面產(chǎn)生重要的作用。國外研究小腸上皮細胞生物學功能以及腸道免疫機理的較多［2－4］。目前，國外通過轉染猴空泡病毒40 （SV40）也建立了一些小腸上皮細胞系［5－8］，但不是轉化細胞并具有穩(wěn)定性功能，與正常的小腸上皮細胞系的消化吸收、免疫和分化都具有相似的功能。然而，雞小腸上皮細胞系的成功建立未見報道。同時，雞小腸上皮細胞未商品化，很難獲得細胞素材。因此，建立雞小腸上皮細胞系迫在眉睫。本研究旨在通過6孔板接種雞胚小腸組織塊，8 h內可獲得增殖旺盛的雞小腸上皮細胞，為導入SV40T致癌基因建立永生化雞小腸上皮細胞系奠定基礎。

1　材料與方法

1．1 試驗材料

對無特定病原（SPF）雞蛋破殼，無菌取雞胚小腸組織放入含有2倍青霉素和鏈霉素的完全培養(yǎng)基中。DMEM／F12完全培養(yǎng)基：10%澳洲胎牛血清、杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）、0．25%胰酶、5 mL胰島素－轉鐵蛋白－硒（ITS）均為Gibco產(chǎn)品；100 U／mL青霉素、100 μg／mL鏈霉素、4 mL L－谷氨酰胺溶液、2．8 μmol／L氫化可的松、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT）均為Sigma產(chǎn)品，15 ng／mL表皮生長因子（EGF）為Peprotech產(chǎn)品；Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉錄試劑盒為TaKaRa產(chǎn)品；熒光定量PCR試劑盒為Roche產(chǎn)品。

1．2 雞小腸上皮細胞原代培養(yǎng)

在超凈臺內無菌取出雞胚小腸，將小腸組織放入含有2倍青霉素和鏈霉素50 mL離心管中，用含有2倍青霉素和鏈霉素DPBS清洗小腸數(shù)次，剔除脂肪組織和腸系膜，將組織移至滅菌的培養(yǎng)皿中，用DPBS再進行清洗小腸，直至上清液清亮。用無血清的培養(yǎng)基反復清洗雞胚小腸組織，直至培養(yǎng)基上清液清亮無漂浮物，并轉移至50 mL小燒杯中，并用剪刀將小腸組織剪成碎片，靜置5 min自行沉淀，棄去上清液。繼續(xù)剪碎，加無血清培養(yǎng)基懸浮組織塊，再轉移至15 mL的離心管中清洗，1 000 r／min離心4 min，倒掉上清。反復清洗雞小腸組織，直至上清液澄清。加入含10%血清DMEM／F12完全培養(yǎng)基懸浮組織塊，用擴口移液管將小腸組織塊轉入6孔板中，放入二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)大約8 h之后，組織周圍出現(xiàn)小腸上皮細胞和成纖維細胞。

1．3 雞小腸上皮細胞的純化和克隆

將6孔板放在倒置顯微鏡下觀察，用記號筆圈出上皮細胞集落處，然后用一次性細胞刮刀將其他區(qū)域的細胞全部刮掉，并用DPBS清洗去除雜細胞。用胰酶分離消化細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞皺縮發(fā)亮的程度，一旦細胞開始漂浮，立即終止消化，用DPBS清洗除去雜細胞。完全培養(yǎng)基終止消化，吹打并懸浮細胞，計數(shù)，使細胞密度為500個／mL，取100 μL細胞懸液加入96孔板中，培養(yǎng)1周。

1．4 雞小腸上皮細胞的生長曲線的測定

取第2代雞小腸上皮細胞，按照4×103個／孔的密度接種到96孔板，24 h之后取8孔，每孔加入20 μL的MTT溶液放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出MTT溶液再用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞2～3遍并吸棄，每孔加入150 μL的DMSO，慢搖10 min。吸出8孔的液體并轉入96孔板中，490 nm測吸光度（OD）值，連續(xù)測7 d。

1．5 雞小腸上皮細胞特異性基因的表達

將雞小腸上皮細胞接種于6孔板內，待細胞密度至80%，進行總RNA的提取。吸掉培養(yǎng)基，按照每孔加1 mL Trizol裂解液并吹打細胞。操作程序按照Invitrogen說明書進行總RNA的提取。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取總RNA的完整性。按照羅氏反轉錄說明書進行cDNA的合成。以cDNA為模板進行目的基因的擴增，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳對目的基因的檢測。實時定量PCR（RT?PCR）引物序列和參數(shù)見表1。

表1　實時定量PCR引物序列和參數(shù)Table 1　Sequences and parameters of primers for RT?PCR

1．6 雞小腸上皮細胞凍存與復蘇

細胞凍存：待雞小腸上皮細胞密度生長至80%時，通過酶消化分離細胞，待細胞發(fā)亮時用完全培養(yǎng)基終止消化，這時用移液槍吹打細胞，此吹打過程一定要溫和操作，避免細胞機械性死亡，1 000 r／min離心5 min。用凍存液懸浮細胞并轉移細胞懸液到凍存管中，接下來放入細胞存程序降溫盒，直接放－80℃冰箱。

細胞復蘇：從－80℃冰箱取出雞小腸上皮細胞并在37、50、65℃的水浴中快速解凍，待凍存管還剩指甲大小的冰塊時停止解凍，酒精噴灑凍存管周圍并放入生物安全柜慢慢解凍。將凍存液轉入10 mL培養(yǎng)基中，此過程慢慢加入，避免滲透壓對細胞的損傷。100 g離心5 min，用預熱的培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)同時計算細胞的活力。

2　結 果

2．1 雞小腸上皮細胞的原代培養(yǎng)

由圖1可知，8 h內雞小腸組織塊即可貼壁，組織塊周圍首先分裂出小腸上皮細胞和少量的成纖維細胞。由圖2可知，第3天成纖維細胞迅速增殖并處于對數(shù)生長期，和小腸上皮細胞夾雜著生長。由圖3可知，第6天雞小腸上皮細胞增殖明顯，但也伴隨著一些細胞的衰老，細胞形態(tài)變得模糊。然而，雞小腸上皮細胞傳至第5代，細胞質變大，細胞開始凋亡，并從培養(yǎng)瓶底部脫落。

圖1　組織塊接種植8 h后貼壁，并分裂出小腸上皮細胞和少量成纖維細胞（物鏡，4×）Fig．1　The tissue starts the adherence to the plate 8 h after culture，and divides the intestinal epithelial cells and a few of fibroblast cells （objective，4×）

圖2　第3天成纖維細胞迅速增殖并和上皮細胞夾雜生長（物鏡，4×）Fig．2　The fibroblast cells grow rapidly in day 3，and they grow together with epithelial cells （objective，4×）

圖3　第6天雞小腸上皮細胞增殖明顯同時也有一些細胞開始衰老（物鏡，4×）Fig．3　At day 6 of culture，the chicken intestinal epithelial cells grow rapidly，and some cells start senescence（objective，4×）

2．2 雞小腸上皮細胞的純化和克隆

從圖4可知，利用有限稀釋法克隆雞小腸上皮細胞，成功獲得克隆的雞小腸上皮細胞株。雞小腸上皮細胞呈現(xiàn)出不同形態(tài)，細胞與細胞之間緊密相連，細胞形態(tài)呈單層“鋪石路”和蝌蚪形生長。

2．3 雞小腸上皮細胞生長曲線的測定

由圖5可知，第1天內雞小腸上皮細胞生長緩慢；第2～4天生長較快，進入對數(shù)生長期；第4～6天雞小腸上皮細胞生長緩慢達到平臺期。從圖5看出細胞生長曲線為“S”形，符合細胞生長的一般規(guī)律。

2．4 雞小腸上皮細胞特異性基因的表達與鑒定

本試驗選擇小腸上皮細胞特異性表達的細胞角蛋白19、E－鈣黏素、腸肽酶等蛋白質。細胞角蛋白是上皮細胞的骨架蛋白質，也是上皮細胞的特異抗原。因此，常用來鑒定上皮源細胞。E－鈣黏素是上皮細胞重要的分化標志，它也是構成上皮細胞間連接的關鍵蛋白質。腸肽酶是十二指腸上皮細胞分泌的一種蛋白質水解酶，能夠水解蛋白質形成小肽。腸肽酶的正常表達被認為是小腸上皮細胞標志性蛋白質，對動物小腸營養(yǎng)的吸收起重要作用。由圖6可知，細胞角蛋白19、E－鈣黏素、腸肽酶等蛋白質在雞小腸上皮細胞中能夠很好地表達。

圖4　利用96孔有限稀釋法獲得單克隆雞小腸上皮細胞系（物鏡，4×）Fig．4　Apply 96?well plates limiting dilution method to achieve monoclonal chicken intestinal epithelial cells line（objective，4×）

圖5　雞小腸上皮細胞生長曲線Fig．5　Growth curve of the chicken intestinal epithelial cells

圖6　雞小腸上皮細胞特異性基因表達分析Fig．6　Gene expression analysis of thechicken intestinal epithelial cells

2．5 細胞凍存與復蘇

本研究選擇37、50、60℃的水浴中快速解凍雞小腸上皮細胞。通過臺盼藍染色發(fā)現(xiàn)，在60℃的水浴中快速解凍雞小腸上皮細胞能夠提高雞小腸上皮細胞的成活率。慢慢融化，水分進入細胞內從而改變細胞的滲透壓，導致細胞損傷。然而，60℃的水浴能夠快速解凍細胞，最大限度降低雞小腸上皮細胞死亡率。

3　討 論

3．1 組織塊法培養(yǎng)原代雞小腸上皮細胞

培養(yǎng)原代細胞方法有多種，如酶消化和組織塊培養(yǎng)都能獲得所需要的細胞［9］。酶消化法獲得的細胞純度比較高，但是細胞活力較弱。組織塊細胞培養(yǎng)所獲得的細胞活力較強，增殖旺盛，但是大量含有成纖維細胞，純化步驟比較繁瑣。本試驗采用組織塊細胞培養(yǎng)法，由于此方法未經(jīng)任何酶的處理，雖然有成纖維細胞污染，但是通過幾步純化也能夠獲得活性很高且增殖旺盛的細胞，這為建立永生化細胞系奠定基礎。Kimmich［10］利用透明質酸酶消化雞小腸組織塊，分離出的小腸上皮細胞可以用于營養(yǎng)物質的轉運以及營養(yǎng)物質代謝試驗。本試驗采取組織塊細胞培養(yǎng)法，并成功獲得雞小腸上皮細胞株。利用組織培養(yǎng)細胞首先要避免組織不被微生物污染，尤其是細菌的污染。組織剪碎之后在吸取組織塊時，要預先濕潤組織塊，這是防止組織塊粘在管內壁。雞小腸組織塊接種到6孔板8 h之后，組織塊周圍就輻射出雞小腸上皮細胞和少量的成纖維細胞。李艷等［11］在培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞7 d之后，組織塊周圍才輻射出乳腺上皮細胞。這是由于雞小腸組織塊采集于雞胚，而乳腺組織采集于成年的奶牛，在時間上雞小腸還屬于胚胎時期，因此細胞分裂旺盛。組織塊接種到6孔板之后，培養(yǎng)基的用量是雞小腸上皮細胞能否成功培養(yǎng)的關鍵。接種的組織濕潤并貼在瓶底部即可，組織上表面也不能干涸。24 h之后可以適當增加完全培養(yǎng)基，絕不能使雞小腸組織塊飄起。從培養(yǎng)箱拿出6孔板時候，在觀察細胞時移動6孔板動作要緩和，防止組織塊從底部脫落。本試驗還研究結果表明，利用組織塊培養(yǎng)雞小腸上皮細胞能夠獲得大量的有活力的上皮細胞，為下游試驗提供了較好的素材。

3．2 雞小腸上皮細胞分離純化與克隆

利用組織塊細胞培養(yǎng)最大的缺點是成纖維細胞太多，上皮細胞與成纖維細胞夾雜生長，很難純化。本實驗室采用刮除法、相差消化、相差貼壁和有限稀釋法來純化克隆雞小腸上皮細胞。首先用細胞刮刀將大部分成纖維細胞刮掉，用PBS清洗以去除雜細胞。這時，生長在上皮細胞周圍的成纖維細胞不能用刮除法來去除雜細胞。此時，采用0．05%胰酶來消化貼壁細胞，置于倒置顯微鏡下觀察細胞皺縮發(fā)亮程度，并拍打培養(yǎng)瓶，一旦有細胞開始脫落就立即用完全培養(yǎng)基終止消化。這是由于成纖維細胞和上皮細胞對胰蛋白酶的敏感性不同，0．05%胰酶就可以輕松把成纖維細胞消化下來，而雞小腸上皮細胞只有一小部分脫落，仍繼續(xù)貼壁。接下來，用0．05%胰酶消化細胞，并使細胞完全脫落加完全培養(yǎng)基終止消化。洪智敏等［12］在分離雞胚小腸上皮細胞時采用酶消化獲得雞小腸上皮細胞，但是也存在成纖維細胞的污染，而且細胞活力比較低。然而，單克隆的雞小腸上皮細胞才是我們最終獲得的理想細胞系。許多國外的克隆細胞采用克隆環(huán)方法［13］，但是本試驗未獲得成功，可能是由于技術上不夠嫻熟，有待進一步研究。本試驗利用有限稀釋法克隆雞小腸上皮細胞，其中有6孔的細胞密度為50%，接下來消化孔內的細胞，轉入到24孔板中進行擴大培養(yǎng)。

3．3 雞小腸上皮細胞的生長曲線的測定

雞小腸上皮細胞的生長特性對于小腸上皮細胞的營養(yǎng)吸收至關重要。由于本試驗所培養(yǎng)的細胞并不是永生化的雞小腸上皮細胞，因此細胞增殖的速率要比永生化細胞增殖慢。一般來說，細胞每隔3 d傳代1次對于細胞的生長是合適的。但是，原代細胞增殖速率較慢，而且還伴隨著一些雞小腸上皮細胞的衰老。因此，本試驗接種的細胞數(shù)目為1×104個／cm2，3 d之后雞小腸上皮細胞密度為80%。由圖5可知，當細胞培養(yǎng)24 h，雞小腸上皮細胞并沒有出現(xiàn)明顯的增殖，反而細胞數(shù)變少。這可能是雞小腸上皮細胞并非是永生化細胞，在接種時已經(jīng)有一部分細胞死亡的原因。當雞小腸上皮細胞培養(yǎng)至2～4 d時，細胞增殖明顯，呈現(xiàn)對數(shù)生長期。培養(yǎng)至5～6 d時，雞小腸上皮細胞并不能增殖，細胞處于平臺期。我們的研究發(fā)現(xiàn)，傳至第5代之后細胞生長速度明顯減慢，無法增殖，細胞開始出現(xiàn)衰老，細胞間隙變大，細胞體積變大并伴隨著細胞從瓶底脫落。有研究認為，原代培養(yǎng)的細胞PD20之后，細胞經(jīng)過M0期，一部分細胞開始死亡。之后，細胞開始進入M1期和M2期，這時候細胞開始大量凋亡。然而一些致癌基因可以使原代細胞逃離M1期和M2期，這些致癌基因表達的致癌蛋白會使細胞的腫瘤抑制因子失活或控制細胞生長的信號通路失活從而使細胞永生化［14－15］。

Shamanin等［16］利用HPV16 E6致癌基因使腫瘤抑制因子p14ARF?p53通路失活并激活細胞內端粒酶活性，使染色體更加穩(wěn)定不被降解，細胞成功逃離M2期，細胞產(chǎn)生了無限增殖的永生化細胞。本試驗研究結果表明，培養(yǎng)的雞小腸上皮細胞具有一定的增殖能力，符合上皮源細胞的生長特性。然而，培養(yǎng)至第5代雞小腸上皮細胞完全無法增殖，因此，想要獲得連續(xù)增殖的雞小腸上皮細胞系，就必須導入SV40T致癌基因，使雞小腸上皮細胞永生化。

3．4 雞小腸上皮細胞特異性基因的表達與鑒定

鑒定小腸上皮細胞的方法，目前主要是細胞角蛋白18抗原、堿性磷酸酶染色、顯微鏡觀察法。國內外鑒定上皮細胞主要通過對上皮細胞的細胞角蛋白18抗原檢測［17－18］。但是，國外也通過對上皮細胞特異性表達的蛋白質進行檢測［19］。細胞角蛋白、E－鈣黏素、腸肽酶則是小腸上皮細胞特異性蛋白質，尤其是細胞角蛋白。細胞角蛋白在維持上皮細胞的結構和穩(wěn)定起到至關重要作用。E－鈣黏素也廣泛分布于細胞膜，它對細胞間和細胞與外界的聯(lián)系具有中間作用。E－鈣黏素與細胞一旦結合發(fā)生相互作用，從而改變細胞骨架重排，產(chǎn)生細胞間的分子信號轉導，并將這一信號傳遞給細胞質，引起胞內蛋白質的磷酸化。腸肽酶廣泛分布于十二指腸上皮細胞，主要分泌一種蛋白質水解酶，對蛋白質的水解和胰蛋白酶的形成起到至關重要的作用，并且腸肽酶的正常表達被認為是小腸上皮細胞標志性蛋白質［20］。同時，我們也可以通過顯微鏡來鑒別上皮細胞。但是，組織塊培養(yǎng)雞小腸上皮細胞的最大缺點是雜細胞較多。組織塊培養(yǎng)過程中，成纖維細胞占有絕對優(yōu)勢，可以進行大量的增殖。當成纖維細胞生長密度至100%時候，這時候成纖維細胞開始相互擠壓，原來梭形的成纖維細胞會改變自身的形態(tài)，形態(tài)似乎與上皮細胞呈現(xiàn)鋪路石。因此，細胞剛開始生長的時候，通過顯微鏡能夠很好地鑒定上皮細胞。一旦成纖維細胞密度很大時，就無法辨別上皮細胞。本試驗通過RT?PCR對雞小腸上皮細胞特異性角蛋白19、E－鈣黏素、腸肽酶表達分析，結果表明，角蛋白19、E－鈣黏素、腸肽酶能夠在雞小腸上皮細胞中很好地表達，進一步證實了培養(yǎng)的細胞為雞小腸上皮細胞。

4　結 論

本試驗利用組織塊細胞培養(yǎng)法成功培養(yǎng)了雞小腸上皮細胞且細胞活力較強，并能夠進行繼續(xù)傳代。原代雞小腸上皮細胞成功培養(yǎng)可為細胞的永生化、雞腸道營養(yǎng)吸收與免疫調控機制研究提供理想的試驗模型。

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Culture and Identification of the Chicken Intestinal Epithelial Cells Isolated from Chick Embryo in Vitro

ZHAN Kang ZUO Xiaoxin GONG Xiaoxiao CHEN Yinyin ZHAN Jinshun ZHAO Guoqi

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（責任編輯 陳 燕）

（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Abstract：This experiment was conducted to provide a stable model of chicken intestinal epithelial cell line for the study the pathogenesis of chicken intestinal diseases，chicken intestinal absorption of nutrients transport and immune mechanism．Our research applied the chicken intestinal tissue culture to successfully isolate and culture the chicken intestinal epithelial cell．We applied curettage，enzyme digestion，limiting dilution method to purify the chicken intestinal epithelial cell．MTT method was used to identify the growth curve of the chicken intestinal epithelial cell．The specific genes of chicken intestinal epithelial cells were detected by quantitative real?time PCR（RT?PCR）．The results showed as follow：1）the chicken intestinal epithelial cells could be successfully cultured by tissue culture cells．2）The chicken intestinal epithelial cells started the proliferation 8 h after see?ding the tissue．3）The“S”shape of the growth curve of the chicken intestinal epithelial cells was accordance with the law of cell proliferation．4）The chicken intestinal epithelial cells were swollen and started senescence and apoptosis after 5 passages．And many cells were not adherent to the bottom of the plate after seeded by pas?sage．In conclusion，seeding the chicken intestinal tissue in 6?well plate，we are able to obtain a stable chicken intestinal epithelial cells line，which provides a stable cell model to study the pathogenesis of chicken intestinal disease，the absorption of chicken intestinal nutrients transport，immortalized chicken intestinal epithelial cells line．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（7）：2150?2156］

Key words：chicken intestinal epithelial cell；nutrition and immunity；stability；immortalize

Corresponding author?，professor，E?mail：gqzhao＠yzu．edu．cn

通信作者：?趙國琦，教授，博士生導師，E?mail：gqzhao＠yzu．edu．cn

作者簡介：詹 康（1988—），男，江蘇南京人，博士研究生，從事動物分子營養(yǎng)研究。E?mail：zhankang0305＠163．com

基金項目：江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工作資助項目（PAPD）

收稿日期：2015－02－01

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．07．020

文章編號：1006?267X（2015）07?2150?07

文獻標識碼：A

中圖分類號：S852．2