母嬰早期分離對(duì)成年大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究 ※

母嬰早期分離對(duì)成年大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究※

朱永棟張英博1王寧寧1葛晶1季亞成1戴坤鵬1鮑勇1李雙成△

(河北省正定縣人民醫(yī)院內(nèi)三科，河北正定050800)

※項(xiàng)目來(lái)源：河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：C2014-206471)

1河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北石家莊050017

【摘要】目的觀察母嬰早期分離對(duì)成年大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，并探討其可能的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。方法將出生后7 d的仔鼠24只隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組、母嬰部分分離組和母嬰完全分離組，各8只。大鼠出生后81~84 d，用Morris水迷宮觀察母嬰分離對(duì)成年大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，以尼氏染色顯示海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷情況，并檢測(cè)海馬丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。結(jié)果母嬰部分分離組大鼠逃避潛伏期(EL)比正常對(duì)照組延長(zhǎng)(P<0.05)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元輕度丟失，穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限游泳時(shí)間、海馬MDA和SOD含量與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；母嬰完全分離組大鼠EL較正常對(duì)照組延長(zhǎng)(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)象限的游泳時(shí)間比正常對(duì)照組和母嬰部分分離組均減少(P<0.05)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷較母嬰部分分離組加重，MDA含量比正常對(duì)照組升高(P<0.05)，SOD活性較正常對(duì)照組和母嬰部分分離組均降低(P<0.05)。結(jié)論母嬰早期分離程度越深，大鼠成年期學(xué)習(xí)記憶能力降低明顯，這可能是大鼠腦內(nèi)氧自由基過(guò)度堆積導(dǎo)致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷所致。

【關(guān)鍵詞】疾病模型，動(dòng)物；母嬰護(hù)理；大鼠；動(dòng)物

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.05.028

通訊作者：△河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北石家莊050017

作者簡(jiǎn)介：朱永棟(1978—)，男，主治醫(yī)師，學(xué)士。從事內(nèi)科臨床工作。

【中圖分類號(hào)】R-332；R338.64；R395

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-2619(2015)05-0717-04

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of early maternal separation on the learning and memory in rats and investigate the possible neurobiological mechanisms.Methods24 neonatal rats 7 days after birth were randomly divided into normal control group，partial maternal separation group (PMS) and complete maternal separation group (CMS)，8 rats in each group.The effect of early maternal separation on the learning and memory in rats at 81 to 84 days after birth was observed by Morris water maze，the damage of neurons in hippocampus CA1 area was detected by Nissl staining，and the content of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in hippocampus were detected.ResultsThe escape latent period of PMS rats was longer than that in normal control group(P<0.05).There were no statistical significance between PMS group and normal control group on times of crossing platform，swimming time in the platform quadrant and contents of MDA and SOD in hippocampus (P>0.05).There was neanon mild loss in the hippocampus CA1 area.The escape latent period in CMS group was longer than that in normal control group (P<0.05)，the times of crossing platform and the swimming time in the platform area were reduced as compared with those in normal control group and PMS group (P<0.05)，the damage of neurons in CA1 area was aggravated as compared with that in PMS group，the content of MDA was higher than that in normal control group (P<0.05)，the activity of SOD was decreased as compared with that in normal control group and PMS group (P<0.05).ConclusionThe deeper early maternal separation，the more learning and memory reducing in adult rats，which may be result from the neuron damage of the hippocampus CA1 area caused by excessive accumulation of oxygen free radical in rat brain.

收稿日期：(2014-09-25)

Experimental study of the effects and neurobiological mechanisms of early maternal separation on the learning and memory in ratsZHUYongdong*，ZHANGYingbo，WANGNingning，etal.*ThirdDepartmentofInternalMedicine，ZhengdingCountyPeople'sHospitalinHebeiProvince，Hebei，Zhengding050800

【Key words】Disease models，animals; Maternal-child nursing; Rat; Animals

現(xiàn)代生理學(xué)對(duì)腦的記載僅有200多年的歷史，迄今，由于解剖、生理學(xué)的發(fā)展，才開(kāi)始認(rèn)識(shí)了大腦的組織結(jié)構(gòu)、功能定位等，并創(chuàng)立了分析器學(xué)說(shuō)。研究表明，生命早期應(yīng)激可引起成年后不同形式的行為異常[1-3]，是精神分裂癥、抑郁、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、兒童注意缺陷障礙等精神疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[4-5]。精神疾病的遺傳因素、生命早期環(huán)境因素和成年后環(huán)境因素強(qiáng)調(diào)了生命早期環(huán)境因素在精神疾病發(fā)病中的作用。大量的臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn)，早期創(chuàng)傷性應(yīng)激事件，如年幼喪親、長(zhǎng)期與父母分離以及兒童期受虐或忽視等，可增加成年后抑郁、躁狂、精神分裂癥等精神疾病的發(fā)病率。因此，我們以母嬰分離大鼠建立早期應(yīng)激動(dòng)物模型，觀察母嬰早期分離對(duì)大鼠成年期學(xué)習(xí)記憶的影響，并通過(guò)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元損傷及丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的檢測(cè)，探討生命早期應(yīng)激的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年SD大鼠(由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)1311143)48只，按雄雌1∶2合籠，待其繁殖。將雄性新生大鼠24只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、母嬰部分分離組、母嬰完全分離組，各8只。

1.2方法母嬰部分分離組和母嬰完全分離組均于生后第8 d每日分3個(gè)階段(9：00~12：00；14：00~17：00；19：00~21：00)總共隔離9 h，隔離期間母嬰分離，母嬰部分分離組仔鼠飼養(yǎng)在一起，母嬰完全分離組仔鼠單籠單只飼養(yǎng)。正常對(duì)照組和母鼠飼養(yǎng)在一起，不加任何處理。各組大鼠均在生后21 d離乳，在出生后第80~84 d進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，行為學(xué)結(jié)束后處死大鼠，每組大鼠各4只分別用于尼氏染色和氧化應(yīng)激測(cè)試。

1.3Morris水迷宮檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠出生后第81~84 d進(jìn)行，包括①定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前1 d大鼠在水池內(nèi)自由游泳3 min，熟悉環(huán)境。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 d，每日上、下午各1次，每組次每只大鼠隨機(jī)從每個(gè)象限的中點(diǎn)面壁式入水1次，共4次，記錄找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latency，EL)。如90 s仍未找到平臺(tái)，由操作者將大鼠引上站臺(tái)休息30 s，并將潛伏期記為90 s。每日8次成績(jī)的平均值為當(dāng)日成績(jī)。②空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe test)：第4 d上午將平臺(tái)撤除，選定和平臺(tái)區(qū)域相對(duì)的象限中點(diǎn)為入水點(diǎn)，記錄大鼠在90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)象限的次數(shù)和在平臺(tái)象限的游泳時(shí)間。

1.4尼氏染色行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠均取4只，以10%水合氯醛深麻醉，以4%的多聚甲醛(4 ℃)經(jīng)心灌注固定，取腦置于新鮮配制的相同固定液，4 ℃固定4 h，30%蔗糖液4 ℃過(guò)夜。選前囟后1.5~5.0 mm 腦組織做冠狀面冰凍切片，片厚40 μm。將切片裱于涂有3-氨丙基-3-甲氧基硅烷(3-Aminopropyl-Triethoxysilane，APES)處理的載玻片上，置于0.5%硫堇溶液中，于50 ℃恒溫下浸染20 min；以蒸餾水速洗，用95%酒精分化，至鏡檢神經(jīng)元尼氏體清晰為止；常規(guī)酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.5MDA和SOD檢測(cè)各組剩余大鼠迅速斷頭，并于冰板上分離海馬結(jié)構(gòu)，制成組織勻漿，檢測(cè)MDA和SOD的含量。其中MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定，SOD采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，試劑盒均購(gòu)自南京建成科技有限公司。

2結(jié)果

2.13組水迷宮實(shí)驗(yàn)EL、穿越平臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)象限游泳時(shí)間比較見(jiàn)表1。

表1　3組水迷宮實(shí)驗(yàn)EL、穿越平臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)象限游泳時(shí)間比較　 ± s

由表1可見(jiàn)，母嬰部分分離組大鼠在第1 d和第2 d EL與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第3 d EL比正常對(duì)照組延長(zhǎng)(P<0.05)；母嬰完全分離組大鼠第1 d、第2 d和第3 d EL比正常對(duì)照組延長(zhǎng)(P<0.05，P<0.01)，且在第3 d EL比母嬰部分分離組延長(zhǎng)(P<0.05)。正常對(duì)照組與母嬰部分分離組大鼠在90 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)象限游泳時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；母嬰完全分離組大鼠在90 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)低于正常對(duì)照組和母嬰部分分離組(P<0.05)，平臺(tái)象限游泳時(shí)間比正常對(duì)照組和母嬰部分分離組減少(P<0.01)。

2.23組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色比較正常對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)完整，排列緊實(shí)，細(xì)胞邊界清晰，尼氏體豐富，核仁清晰可見(jiàn)(見(jiàn)封3，圖1)；母嬰部分分離組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞與正常對(duì)照組相比有輕度丟失，細(xì)胞排列較緊密，細(xì)胞邊界較清晰，胞漿內(nèi)尼氏小體較豐富清晰(見(jiàn)封3，圖2)；與正常對(duì)照組和母嬰部分分離組相比，母嬰完全分離組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞丟失更嚴(yán)重，細(xì)胞排列散亂，邊界模糊，胞漿內(nèi)大量尼氏體丟失(見(jiàn)封3，圖3)。

2.33組海馬MDA含量和SOD活性比較見(jiàn)表2。

表2　3組海馬MDA含量和SOD活性比較

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與母嬰部分分離組比較，△P<0.05

由表2可見(jiàn)，母嬰部分分離組大鼠海馬MDA含量比正常對(duì)照組升高，SOD活性降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。母嬰完全分離組大鼠海馬MDA含量比正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，SOD活性比正常對(duì)照組和母嬰部分分離組明顯降低(P<0.01，P<0.05)。

3討論

嬰兒期是腦發(fā)育最快、最重要的時(shí)期，作為嬰兒最初接觸到的外界環(huán)境刺激，母嬰關(guān)系在哺乳動(dòng)物早期的生長(zhǎng)發(fā)育、認(rèn)知能力和社交行為中發(fā)揮著重要作用。關(guān)于靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類的研究表明，母愛(ài)剝奪(early maternal deprivation，ED)是哺乳動(dòng)物生命早期嚴(yán)重應(yīng)激事件之一，會(huì)影響個(gè)體神經(jīng)發(fā)育和行為表現(xiàn)，而且這些影響可能會(huì)持續(xù)一生。

由于臨床研究的周期長(zhǎng)、生物材料難以獲得和人體研究道德要求等的局限性，生命早期應(yīng)激動(dòng)物模型將為該領(lǐng)域的研究提供平臺(tái)。目前被認(rèn)可的應(yīng)用于嚙齒類動(dòng)物的生命早期應(yīng)激是母愛(ài)剝奪模型，其能較好地模擬人類在生命早期母愛(ài)的喪失，并能觀察到成年后行為的改變。母愛(ài)剝奪模型主要分為2種，第1種是短期剝奪，如母子僅分離24 h；第2種是長(zhǎng)期剝奪，一般分為2個(gè)階段，即母嬰分離階段(母乳期)、隔離飼養(yǎng)階段(斷乳后至成年)。其中母嬰分離相當(dāng)于人類在生命早期母愛(ài)的喪失，隔離飼養(yǎng)則相當(dāng)于人類在成年前社會(huì)交往行為的減少或喪失。盡管母愛(ài)剝奪對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶影響的研究較多，但仍然存在很大爭(zhēng)議。研究發(fā)現(xiàn)，不同程度的母嬰早期分離可以導(dǎo)致子代成年后認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等多種行為異常[1-3]。

本研究通過(guò)建立母嬰早期分離大鼠模型，利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，母嬰部分分離組大鼠在第3 d定位航行實(shí)驗(yàn)中尋找平臺(tái)的EL比正常對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，第1 d和2 d雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但存在延長(zhǎng)趨勢(shì)，提示大鼠的學(xué)習(xí)能力損傷；母嬰完全分離組大鼠在第1 d和2 d EL比正常對(duì)照組顯著延長(zhǎng)(P<0.05，P<0.01)，在第3 d EL比正常對(duì)照組和母嬰部分分離組明顯延長(zhǎng)(P<0.01，P<0.05)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)母嬰分離和隔離飼養(yǎng)雙重應(yīng)激的大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間更長(zhǎng)，提示母嬰完全分離組大鼠學(xué)習(xí)能力受損，比母嬰部分分離組有加重趨勢(shì)。空間探索實(shí)驗(yàn)中，母嬰完全分離組大鼠穿越平臺(tái)象限次數(shù)和平臺(tái)象限游泳時(shí)間比正常對(duì)照組和母嬰部分分離組明顯減少(P<0.05，P<0.01)，提示大鼠的記憶能力損傷。因此，本研究認(rèn)為母嬰早期分離可損害大鼠成年期學(xué)習(xí)記憶，與國(guó)外研究結(jié)果一致[6-7]。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，母嬰早期分離程度的加深可加重大鼠成年期學(xué)習(xí)記憶損傷。

有研究顯示，學(xué)習(xí)記憶與海馬CA1區(qū)密切相關(guān)[8]。本研究尼氏染色發(fā)現(xiàn)，母嬰部分分離組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞少量脫失，尼氏體減少；母嬰完全分離組錐體細(xì)胞脫失更嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)大量尼氏體丟失。國(guó)外也有研究報(bào)道，在大鼠出生后19 d進(jìn)行一次長(zhǎng)時(shí)間的母嬰分離，大鼠表現(xiàn)為CA1區(qū)神經(jīng)元減少[9]。提示母嬰部分分離組和母嬰完全分離組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存在損傷，這可能是母嬰早期分離大鼠產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶能力損傷的原因之一。動(dòng)物早期的生活經(jīng)歷對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育、認(rèn)知、情緒以及行為方面起著至關(guān)重要的作用。眾多研究表明，幼年時(shí)期經(jīng)歷過(guò)喪母、家庭暴力或者父母患抑郁癥的兒童，長(zhǎng)大后患精神疾病和認(rèn)知障礙的可能性更大。大量相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，母嬰分離能導(dǎo)致行為學(xué)和神經(jīng)內(nèi)分泌的異常而出現(xiàn)抑郁和焦慮樣反應(yīng)。這些研究結(jié)果表明，生命早期應(yīng)激可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生深遠(yuǎn)而持續(xù)的影響，這些影響會(huì)導(dǎo)致各種行為學(xué)異常和大腦內(nèi)長(zhǎng)時(shí)期的生物化學(xué)改變。

有研究表明，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量氧自由基可通過(guò)介導(dǎo)神經(jīng)元損傷而影響腦的發(fā)育[10]。MDA是氧自由基發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量的變化可間接反應(yīng)組織中氧自由基含量的變化；SOD可將體內(nèi)O2-轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O，其含量的變化可直接反應(yīng)組織清除氧自由基能力。本研究發(fā)現(xiàn)，母嬰部分分離組大鼠海馬MDA含量與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但存在升高的趨勢(shì)；母嬰完全分離組大鼠海馬MDA含量比正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。母嬰部分分離組大鼠海馬SOD活性與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但存在降低趨勢(shì)；母嬰完全分離組大鼠海馬SOD活性比正常對(duì)照組和母嬰部分分離組明顯降低(P<0.01，P<0.05)。我們推測(cè)，腦內(nèi)氧化應(yīng)激異常損傷了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，這可能是母嬰早期分離大鼠成年期學(xué)習(xí)記憶能力降低的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制之一。

對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行分析我們可以得出結(jié)論，即母嬰早期分離程度越深，大鼠成年期學(xué)習(xí)記憶能力降低越明顯，這可能是大鼠腦內(nèi)氧自由基過(guò)度堆積導(dǎo)致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷引起的。

至目前為止，全世界已有數(shù)萬(wàn)只動(dòng)物因?yàn)槟笎?ài)剝奪導(dǎo)致沮喪、絕望、焦慮、心理殘傷和死亡。出于倫理原因，我們不可能對(duì)人類母嬰進(jìn)行母愛(ài)剝奪實(shí)驗(yàn)，但對(duì)于那些經(jīng)歷過(guò)母愛(ài)剝奪的個(gè)體，我們卻能夠通過(guò)對(duì)其心理健康水平的測(cè)定，以此來(lái)了解他們可能存在的心理問(wèn)題。以后的研究工作中，我們應(yīng)當(dāng)把關(guān)注的焦點(diǎn)盡可能集中于那些經(jīng)歷過(guò)母愛(ài)剝奪或者正經(jīng)歷著母愛(ài)剝奪的個(gè)體，通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查、團(tuán)體施測(cè)等方式，探析母愛(ài)剝奪可能產(chǎn)生的危害，以便為后期心理危機(jī)干預(yù)提供有效措施和依據(jù)。

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(本文編輯：董軍杰)