糖尿病和糖尿病足潰瘍患者淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞改變及其影響因素研究

糖尿病和糖尿病足潰瘍患者淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞改變及其影響因素研究

魏民，陳存舉，馮進(jìn)，高玲

(中國(guó)人民武裝警察8730部隊(duì)醫(yī)院，廣東 廣州 510800)

摘要：目的 探討糖尿病患者和糖尿病足潰瘍患者外周血淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞的改變及其影響因素。 方法 采用RT-PCR檢測(cè)外周血白細(xì)胞中淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志物VEGFR3mRNA表達(dá)；采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)外周血白細(xì)胞VEGFR3蛋白表達(dá)，并計(jì)數(shù)VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量；檢測(cè)各組患者臨床指標(biāo)，分別和外周血VEGFR3表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析。 結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組外周血VEGFR3mRNA表達(dá)及VEGFR3蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。糖尿病1組(HbA1C<7%)與正常對(duì)照組比較，VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；糖尿病2組(HbA1C≥7%)和糖尿病足組與正常對(duì)照組比較，VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.01)。相關(guān)因素分析顯示： VEGFR3表達(dá)的影響因素為糖化血紅蛋白、空腹血糖、收縮壓、舒張壓。結(jié)論 糖尿病及糖尿病足潰瘍患者外周血淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志物VEGFR3表達(dá)減少，且和糖化血紅蛋白、空腹血糖、收縮壓、舒張壓呈負(fù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿病；糖尿病足；淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-4646(2015)04-0287-03

ABSTRACT：Objective To explore changs of lymphatic endothelial progenitor cells and its affecting factorsin peripheral blood leukocytes of diabetes patients and diabetic foot ulcer patients. Methods The gene expression of VEGFR3 was detected by RT-PCR，the protein expression of VEGFR3 was determined by immunohistochemistry，and the correlative factors were analyzed by statistical methods.Results Compared with normal control group，the gene and protein expression of VEGFR3 in diabetes group and in diabetic foot ulcer group were significantly decreased(P<0.01).Number of positive cells of VEGFR3 in peripheral blood of diabetes group and diabetic foot ulcer group was decreased than that of normal control group(P<0.01).The correlative analysis showed that factors decreasing VEGFR3 expression included HbA1C，systolic pressure，fasting blood-glucose and diastolic pressure.Conclusion The expression of VEGFR3 is decreased in peripheral blood of diabetes patients and diabetic foot ulcer patients，and there has negative correlation between VEGFR3 expression and HbA1C，systolic pressure，fasting blood-glucose and diastolic pressure.

收稿日期：(2015-05-13)

Changs of Lymphatic Endothelial Progenitor Cells and its Affecting

Factorsin Diabetes and Diabetic Foot Patients

WEI Min，CHEN Cun-ju，F(xiàn)ENG Jin，et al

(DepartmentofInternalMedicine，8730ArmyHospitalofCAPF，GuangzhouGuangdong510515，China)

KEY WORDS：Diabetes;Diabetic foot;Lymphatic endothelial progenitor cell

糖尿病足潰瘍是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，難愈合的潰瘍可能最終導(dǎo)致截肢，嚴(yán)重影響患者的生存和生活質(zhì)量。盡管2型糖尿病患者足部潰瘍皮膚神經(jīng)、血管病變顯著，但是潰瘍并不延遲愈合[1]，推測(cè)尚有其他因素參與潰瘍的修復(fù)。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)：在糖尿病足潰瘍組織中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VEGFR3和 LYVE-1表達(dá)減少，可能與潰瘍局部皮膚組織中淋巴管內(nèi)皮重建不足，并且和潰瘍難愈合相關(guān)[2，3]。為進(jìn)一步探討潰瘍皮膚淋巴管數(shù)量減少的原因，本研究以糖尿病患者和糖尿病足潰瘍患者外周血白細(xì)胞為研究對(duì)象，以期探討在糖尿病患者和糖尿病足潰瘍患者外周血淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志VEGFR3表達(dá)、淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的改變以及其影響因素。

1資料與方法

1.1一般資料收集我院住院部符合納入標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病足潰瘍患者以及同時(shí)期住院的糖尿病患者作為研究對(duì)象，正常對(duì)照采用同時(shí)期門(mén)診知情同意的健康體檢者。納入標(biāo)準(zhǔn)：足部創(chuàng)面形成大于1個(gè)月，內(nèi)科治療無(wú)愈合傾向[2，3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性潰瘍創(chuàng)面、特異性感染創(chuàng)面(結(jié)核、真菌及破傷風(fēng)創(chuàng)面)；嚴(yán)重的心、肝、腎功能不全者；使用糖皮質(zhì)激素治療者；踝肱比≤0.9，跨皮氧分壓<30mmHg。研究對(duì)象分為4組，分別為：糖尿病足潰瘍組(diabetic foot，DF組)10例，男5例，女5例；年齡(52.30±4.66)歲；糖尿病病程(5.94±1.44)年；糖尿病足潰瘍出現(xiàn)時(shí)間(64.00±10.38)d，平均潰瘍面積0.8cm×1.7cm。糖尿病1組，(HbA1C<7%，DM1組)10例，男6例，女4例；年齡(54.14±5.65)歲；糖尿病病程(5.80±1.62)年。糖尿病2組(HbA1C≥7%，DM2組)10例，男5例，女5例；年齡(54.22±6.38)歲；糖尿病病程為(6.10±1.73)年。以上患者糖尿病符合1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為2型糖尿病患者。正常對(duì)照組(NC組)10例，男7例，女3例；年齡(57.32±4.46)歲，為同時(shí)期門(mén)診知情同意的健康體檢者。

1.2檢測(cè)方法采用RT-PCR檢測(cè)各組患者外周血白細(xì)胞中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VEGFR3mRNA的表達(dá)。取各組標(biāo)本按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，凝膠分析系統(tǒng)分析結(jié)果。VEGFR3引物序列：上游TGTTGGAGGTTAAGGCATACG；下游CGGGCTCTAAAGGGAAGAA；擴(kuò)增長(zhǎng)度為526bp。內(nèi)參引物序列：上游AGCGAGCATCCCCCAAAGTT；下游GGGCACGAAGGCTCATCATT，長(zhǎng)度為285 bp(上海英駿公司合成)。

采用免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)各組研究對(duì)象的VEGFR3蛋白表達(dá)以及VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。取各組研究對(duì)象1ml，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×106/ml，分別取0.2ml制作成細(xì)胞貼片，每例研究標(biāo)本做成5張細(xì)胞貼片，參照免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和染色。采用MIAS2000高清晰度病理圖文報(bào)告系統(tǒng)分析各組VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞蛋白表達(dá)及VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(每例標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量)。

收集各組實(shí)驗(yàn)對(duì)象的臨床指標(biāo)，與外周血白細(xì)胞VEGFR3表達(dá)做相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間VEGFR3mRNA比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，其余多組之間比較采用one-way ANOVA方法，方差不齊則采用多組間非參數(shù)檢驗(yàn)，組間比較采用SNK比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1RT-PCR結(jié)果VEGFR3mRNA在各組中均有表達(dá)，因?yàn)楦鹘MVEGFR3mRNA表達(dá)數(shù)值方差不齊，故采用非參數(shù)檢驗(yàn)，四組比較VEGFR3mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1　各組外周血白細(xì)胞中VEGFR3mRNA表達(dá)的比較( ± s)

表1　各組外周血白細(xì)胞中VEGFR3mRNA表達(dá)的比較( ± s)

分組例數(shù)VEGFR3mRNAMeanRankNCDM1DM2DF101010101.292±0.0371.037±0.0670.634±0.073*0.5880±0.009*35.5025.5012.508.50

與NC組比較，*P<0.01

2.2VEGFR3蛋白表達(dá)結(jié)果VEGFR3蛋白在各組中均有表達(dá)。在顯微鏡下，每張載玻片分別選取5個(gè)視野，使用MIAS-2000高清晰度計(jì)算機(jī)病理圖文報(bào)告系統(tǒng)，以每例標(biāo)本表達(dá)量最強(qiáng)的 5個(gè)高倍視野(×400)的積分光密度值作為該例的測(cè)定值。DM2、DF和NC組比較，VEGFR3蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2　各組VEGFR3熒光強(qiáng)度積分光密度值比較( ± s)

表2　各組VEGFR3熒光強(qiáng)度積分光密度值比較( ± s)

分組例數(shù)積分光密度值NCDM1DM2DF10101010169.900±7.795111.600±5.66186.400±7.168*82.200±8.626*

與NC組比較，*P<0.01

2.3VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較結(jié)果在顯微鏡下，每張載玻片分別選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，以上結(jié)果由2個(gè)人完成，取2人結(jié)果的平均值。從細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分析：DM1組與NC組比較，VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)；DM2組和DF組與正常對(duì)照組比較，VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3　各組VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的比較( ± s)

表3　各組VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的比較( ± s)

分組例數(shù)細(xì)胞數(shù)量(個(gè))NCDM1DM2DF1010101037.24±6.0232.06±4.55*17.04±2.25**20.50±2.52**

與NC組比較，*P<0.05、**P<0.01

2.4外周血白細(xì)胞VEGFR3表達(dá)的相關(guān)臨床因素分析相關(guān)因素分析結(jié)果：外周血白細(xì)胞VEGFR3表達(dá)的相關(guān)影響因素為空腹血糖(Spearman's r=-0.518，P=0.003)；收縮壓(Spearman's r=-0.551，P=0.002);舒張壓(Spearman's r=-0.391，P=0.033)；糖化血紅蛋白(Spearman's r=-0.625，P=0.000)；與甘油三酯、膽固醇、空腹C肽，餐后2hC肽無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表4。

表4　VEGFR3表達(dá)和臨床指標(biāo)相關(guān)性分析(n=10， ± s)

表4　VEGFR3表達(dá)和臨床指標(biāo)相關(guān)性分析(n=10， ± s)

項(xiàng)目DM1DM2DF相關(guān)系數(shù)P空腹血糖(mmol/L)8.85±2.3213.88±6.8410.93±2.68-0.520.00甘油三酯(mmol/L)1.21±0.663.19±5.921.57±0.91-0.180.34膽固醇(mmol/L)3.72±1.356.37±4.843.90±1.07-0.220.24收縮壓(mmHg)119.80±7.32129.70±29.08139.50±22.45-0.550.00舒張壓(mmHg)71.50±8.2977.40±15.0377.40±7.40-0.390.03糖化血紅蛋白(%)6.59±0.2611.40±2.238.92±1.96-0.630.00空腹C肽(ng/L)1.69±1.361.26±0.971.18±0.840.060.75餐后2hC肽(ng/L)3.50±2.352.36±2.232.22±2.070.180.35

3討論

有研究發(fā)現(xiàn)，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞除了參與胚胎正常淋巴管發(fā)育[4]、腫瘤轉(zhuǎn)移等過(guò)程外，還參與組織修復(fù)、炎癥反應(yīng)[5]等過(guò)程。在創(chuàng)面組織修復(fù)過(guò)程中，無(wú)論是炎癥急性反應(yīng)階段，還是慢性反應(yīng)階段，淋巴管的形成都發(fā)揮了重要的作用[6]。VEGFR3是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，也是淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)志物。

本研究以糖尿病患者和糖尿病足非缺血性潰瘍患者外周血白細(xì)胞為研究對(duì)象，分別檢測(cè)各組外周血白細(xì)胞中的VEGFR3表達(dá)以及VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，并將VEGFR3表達(dá)和臨床指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析，進(jìn)一步探討糖尿病足潰瘍患者和糖尿病患者外周血中VEGFR3表達(dá)的影響因素。RT-PCR結(jié)果顯示：各組細(xì)胞均有VEGFR3mRNA表達(dá)。通過(guò)非參數(shù)檢驗(yàn)的Mean Rank分析：NC組和DM1組的VEGFR3mRNA表達(dá)高于DF組和DM2組(P<0.01)。表明外周血白細(xì)胞中VEGFR3mRNA表達(dá)減少對(duì)于DF組和DM2組更有意義。細(xì)胞免疫熒光化學(xué)的結(jié)果顯示：計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野中的積分光密度值，結(jié)果為DM2組、DF組與NC組比較，VEGFR3蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，DM1組和NC組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在相同細(xì)胞濃度和相同視野的細(xì)胞涂片中，我們計(jì)數(shù)了每組計(jì)數(shù)10個(gè)標(biāo)本，每張標(biāo)本分別計(jì)數(shù)了鏡下5個(gè)視野，NC組的VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最多，DM1組其次，DF組和DM2組最少。VEGFR3表達(dá)量的相關(guān)因素分析結(jié)果表明：空腹血糖、收縮壓、舒張壓和糖化血紅蛋白與VEGFR3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與甘油三酯、膽固醇、空腹C肽，餐后2hC肽無(wú)顯著相關(guān)性。我們的研究證實(shí)空腹血糖升高和糖化血紅蛋白與外周血中VEGFR3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)。在以往的研究中已經(jīng)證實(shí)[7]：糖尿病患者外周血中血管內(nèi)皮祖細(xì)胞減少，可能與氧化應(yīng)激、血紅素加氧酶表達(dá)以及脂聯(lián)素有關(guān)。而高血壓導(dǎo)致外周血管內(nèi)皮祖細(xì)胞減少的原因可能為：氧化應(yīng)激和炎癥等[8]。但是高血糖、高血壓導(dǎo)致淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞減少的具體原因有待今后的研究繼續(xù)探討。

綜上所述，我們推測(cè)糖尿病患者在血糖控制欠佳或者合并高血壓的情況下，骨髓淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞釋放減少，導(dǎo)致了外周血中的淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減少。如果此時(shí)合并足部潰瘍，則在潰瘍局部不能形成足夠的淋巴管，從而影響了局部創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，延長(zhǎng)了創(chuàng)面的愈合時(shí)間。所以，糖尿病患者淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減少是糖尿病足潰瘍皮膚淋巴管內(nèi)皮形成障礙的原因之一。

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