膜分離與大孔樹脂聯(lián)用技術(shù)純化茶皂素

程文娟 謝海榮 秦 永 劉 蓉 鄧澤元

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

茶皂素是一類以齊墩果烷型五環(huán)三萜為母核、旁支帶有不同糖苷和官能團(tuán)的皂苷化合物的總稱。它不僅具有抑菌、抗炎、止痛、降低血脂膽固醇等生物活性［1，2］，還有乳化、分散、潤濕、發(fā)泡、穩(wěn)泡等性能，是一種優(yōu)良的天然表面活性劑［3］，被廣泛應(yīng)用于建材、化工、生物醫(yī)藥及食品等行業(yè)，應(yīng)用前景十分廣闊。

由于茶皂素種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且相似，同分異構(gòu)體多，分離出單一結(jié)構(gòu)的茶皂素純品異常困難，導(dǎo)致目前中國市場上所銷售的茶皂素產(chǎn)品的純度普遍不高，使其在醫(yī)藥及化妝品等精細(xì)化工行業(yè)的應(yīng)用受到一定的限制。因此，高純度茶皂素的高效分離純化技術(shù)是油茶產(chǎn)業(yè)化過程中亟待解決的問題［4］。常見茶皂素的分離純化方法主要有正丁醇萃取法［5］、沉淀絮凝法［6］、鹽析法［7］、硅膠 柱層 析法［8］、大孔樹脂純化法［9］、膜分離法［10］等。但是這些方法都存在一些不足：采用正丁醇萃取法得到的茶皂素雜質(zhì)較多［11］；沉淀絮凝法和鹽析法消耗試劑多，對環(huán)境造成污染；硅膠柱層析法對茶皂素易造成死吸附，產(chǎn)量低，不適用于工業(yè)生產(chǎn)等［12］。而膜分離法具有物質(zhì)不發(fā)生相變、分離效果好、耗能低、工藝簡單、操作簡便、清潔無污染等優(yōu)點(diǎn)；樹脂純化法具有穩(wěn)定性高、選擇性好、條件溫和、低耗能、易于自動(dòng)化、有利于環(huán)境保護(hù)等優(yōu)點(diǎn)［13］。雖然已有單獨(dú)使用膜分離法、大孔樹脂純化法分離純化茶皂素的報(bào)道，但單獨(dú)使用膜分離法得到的產(chǎn)品純度不高，而單獨(dú)使用大孔樹脂法，存在耗時(shí)長等缺點(diǎn)。

本研究擬以茶粕中提取得到的粗茶皂素為原料，依次通過陶瓷膜和納濾膜進(jìn)行初步分離，然后經(jīng)大孔樹脂進(jìn)一步純化，優(yōu)化其工藝參數(shù)，以期得到純度較高的茶皂素，為實(shí)現(xiàn)茶皂素的工業(yè)化生產(chǎn)以及合理開發(fā)利用提供技術(shù)參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶粕：江西省高正生物科技集團(tuán)有限公司；

茶皂素標(biāo)品：阿拉丁試劑公司；

石油醚、乙醇、濃硫酸、香草醛：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

大孔 樹 脂：D101、NKA－2、AB－8、HPD450、HPD600、DM130、HPD－722、ADS－F8型，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；

大孔樹脂：Amberlite XAD7HP型，上海安瀾德生物科技有限公司；

大孔樹脂：HP20型，日本三菱樹脂株式會(huì)社。

1.2 儀器與設(shè)備

可見分光光度計(jì)：722型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

膜分離純化儀器：實(shí)驗(yàn)室型，上海朗極膜分離設(shè)備工程有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH－SII型，孔義市英峪華儀器廠；

多功能溢流循環(huán)超聲波萃取機(jī)：SJC－I－2L型，無錫市上佳生物科技有限公司；

電子天平：AR323CN型，奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 采用香草醛－濃硫酸法［14］。稱取0.0500g茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品，用80%（V/V）乙醇水溶液將其溶于50mL容量瓶中，定容，搖勻，得到濃度為1mg/mL的茶皂素溶液。分別取0.0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5mL于25mL具塞磨口試管中，超純水定容至2.5mL。再分別加入2.5mL 8%的香草醛乙醇溶液，移至冰水浴中，分別加入77%的硫酸水溶液（V/V）定容至25mL，搖勻，移入60℃恒溫水浴鍋中加熱40min，進(jìn)行顯色反應(yīng)。取出置于冰水浴中冷卻15min后，室溫放置10min。于550nm波長測定各反應(yīng)液的吸光度值。

1.3.2 茶皂素的提取制備 將茶粕粉碎，過40目篩，用4倍石油醚加熱回流脫脂2h［15］，脫溶干燥。稱取一定量的脫脂茶粕，配制70%的乙醇溶液，按一定的料液比，用微波輔助超聲波法［16］提取得到茶皂素粗品。

1.3.3 試驗(yàn)計(jì)算公式 膜分離試驗(yàn)中，膜分離茶皂素的效果通過膜通量、茶皂素透過率和截留率來表示，分別按式（1）～（3）計(jì)算：

式中：

J——膜通量，L/（m2·h）；

V——取樣體積，L；

S——膜有效面積，m2；

t——取樣時(shí)間，h；

Ts——茶皂素透過率，%；

m1——膜濾液總皂苷含量，g；

m0——原料中總皂苷含量，g。

Ti——茶皂素截留率，%。

大孔樹脂的吸附和解吸效果通過吸附率和解吸率來表示，分別按式（4）～（7）計(jì)算：

式中：

Q——比吸附量，mg/g；

θ——吸附率，%；

P——比解吸量，mg/g；

γ——解吸率，%；

C0、C1——吸附前后樣品液中茶皂素的濃度，mg/mL；

C2——解吸附液中茶皂素的濃度，mg/mL；

V0——樣品體積，mL；

V1——解吸附液體積，mL；

M——樹脂濃度，g；

a——樹脂含水量，%。

1.3.4 膜分離純化茶皂素

（1）茶皂素濃度的選擇：稱取一定量茶皂素粗品溶于一定體積的70%乙醇水溶液中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%，2%，3%，4%的茶皂素溶液，選取陶瓷膜采用全回流循環(huán)方式進(jìn)行試驗(yàn)，收集透過液，分別測定陶瓷膜膜通量、茶皂素透過率，以考察不同茶皂素濃度對膜分離效果的影響［17］。

（2）膜元件的選擇：稱取一定量茶皂素粗品溶于一定體積的70%乙醇水溶液中，配制成1%的茶皂素溶液，選取陶瓷膜、微濾膜（10.0，5.0，3.5kDa）、納濾膜（360Da）進(jìn)行試驗(yàn)，收集透過液，分別測定茶皂素透過率［18］。

1.3.5 大孔樹脂的選擇 所選擇的10種大孔樹脂的物理性質(zhì)：XAD7HP、HPD600、NKA－2、ADS－F8為極性大孔樹脂；DM130、HPD450為中極性大孔樹脂；HPD－722、AB－8為弱極性大孔樹脂；HP20、D101為非極性大孔樹脂。其平均孔徑以XAD7HP大孔樹脂最大，為45，ADS－F8為無孔樹脂，其他為80～100。比表面以 NKA－2為最大，達(dá)到1 200m2/g，其于大孔樹脂比表面為350～600m2/g。

（1）靜態(tài)吸附茶皂素用大孔樹脂的篩選：① 靜態(tài)吸附試驗(yàn)：根據(jù)大孔樹脂的物理性質(zhì)，選取10種大孔樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附篩選試驗(yàn)。分別稱取5g已預(yù)處理的大孔樹脂［19］，置于帶塞錐形瓶中，加入6g/L的茶皂素水溶液50mL，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為1 200r/min，靜態(tài)吸附6h，每隔一定時(shí)間取一定體積的樣液，測定其茶皂素含量，計(jì)算茶皂素的吸附率，比吸附量，并繪制茶皂素靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。②靜態(tài)解吸試驗(yàn)：將上述吸附完全的大孔樹脂用蒸餾水洗凈，置于帶塞錐形瓶中，加入70%的乙醇50mL進(jìn)行大孔樹脂解吸，將其置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為1 200r/min，靜態(tài)解吸6h，測定其上清液中茶皂素的含量，計(jì)算茶皂素的解吸率，比解吸量［13］。

（2）動(dòng)態(tài)吸附茶皂素用大孔樹脂的篩選：① 動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)：分別稱取20g已處理好的大孔樹脂，濕法裝柱，加入30mg/mL的茶皂素溶液50mL，靜置2h，用蒸餾水沖洗樹脂柱，直至流出液呈無色透明，收集流出液，并測定總流出液中的茶皂素濃度。計(jì)算樹脂的吸附率、比吸附量。② 動(dòng)態(tài)解吸試驗(yàn)：將上述充分吸附后的樹脂分別用70%乙醇溶液以相同的流速進(jìn)行洗脫，收集濾液，測定洗脫液中茶皂素的濃度，計(jì)算解吸率和比解吸量。

1.3.6 大孔樹脂純化茶皂素的條件優(yōu)化 根據(jù)大孔樹脂靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)的篩選結(jié)果，選擇效果最好的大孔樹脂用于茶皂素純化。通過考察不同的上樣濃度和上樣流速對茶皂素吸附率的影響，不同的洗脫劑（乙醇）濃度、洗脫劑流速和洗脫劑體積對茶皂素解吸率的影響，來優(yōu)化大孔樹脂純化茶皂素的條件。

1.3.7 大孔樹脂對茶皂素的純化 稱取100g已預(yù)處理好的大孔樹脂，濕法裝柱，用95%乙醇沖柱，然后用蒸餾水沖洗至無醇味。將上述經(jīng)過膜分離初步純化得到的茶皂素，配成濃度為30mg/mL的水溶液，以0.5mL/min流速上樣250mL，待上樣結(jié)束后靜置2h，使其吸附完全。用蒸餾水洗至流出液呈無色，然后用已優(yōu)化的大孔樹脂純化茶皂素的條件，進(jìn)行茶皂素的純化，計(jì)算茶皂素的得率和純度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以珚x±s表示，使用ANOVA方差分析進(jìn)行多組間差異顯著性檢驗(yàn)，使用t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間比較，當(dāng)P＜0.05，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)，茶皂素的濃度為橫坐標(biāo)繪制茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），回歸方程為：y＝0.481 8x－0.005 9，R2＝0.999 6。

2.2 膜分離純化茶皂素

圖1 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curves of tea saponin

2.2.1 茶皂素濃度的選擇 由圖2可知，隨著茶皂素濃度的增大，茶皂素的透過率和膜通量均降低，當(dāng)茶皂素濃度從1%增加到2%時(shí)，透過率從72.67%急劇下降至33.69%；茶皂素濃度繼續(xù)增加，下降趨勢變平緩。在膜分離過程中，溶質(zhì)被膜截留，在濾膜表面積累，導(dǎo)致溶質(zhì)在濾膜表面的濃度逐漸高于溶液主體中的濃度，在濃度梯度的作用下，溶質(zhì)由膜表面向本體溶液擴(kuò)散，從而形成邊界差，使流體阻力與局部滲透壓增大，導(dǎo)致膜通量降低。當(dāng)溶劑向膜面流動(dòng)時(shí)，溶質(zhì)向膜面流動(dòng)的速度與濃度梯度使溶質(zhì)向本體溶液擴(kuò)散的速度達(dá)到平衡時(shí)，在膜面形成濃差極化邊界層，該現(xiàn)象稱為濃差極化。高濃度時(shí)，容易形成多層吸附，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致濃差極化的加劇，會(huì)增加透過阻力，增加系統(tǒng)的運(yùn)行壓力，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致結(jié)晶析出，阻塞流道，從而導(dǎo)致膜通量降低和系統(tǒng)運(yùn)行惡化，影響膜分離的效果［19］。此外，由于三萜類皂苷具有表面活性劑的性質(zhì)，在溶劑中會(huì)締合形成膠束［20］，當(dāng)溶液超過某一濃度時(shí)，膠束形成，粒徑變大，從而影響膜分離的效果。因此在進(jìn)行膜分離純化時(shí)，宜選擇較低濃度的茶皂素進(jìn)行粗分離。

圖2 陶瓷膜對不同濃度茶皂素的分離效果Figure 2 The purification effect of tea saponin under different concentration

2.2.2 膜元件的選擇 按分離過程，膜分離可分為微濾、超濾、納濾、反滲透、滲析、電滲析、氣體分離、滲透蒸發(fā)、液膜等不同的類型，其中微濾、超濾和納濾為常見的依靠壓力差為推動(dòng)力的分離方式，操作簡單，耗能低，易于工業(yè)化應(yīng)用。茶皂素的平均分子量為1.2kDa左右，根據(jù)其特性及其粒徑大小，選 擇 微 濾（陶 瓷 膜）、超 濾 （10.0，5.0，3.5kDa）、納 濾（360Da）3種類型的膜元件來分離茶皂素，以獲得最優(yōu)的膜分離效果。將濃度為1%的茶皂素溶液分別通過不同類型和孔徑的膜，其茶皂素透過率和截留率的結(jié)果見圖3。試驗(yàn)結(jié)果表明，72.67%的茶皂素能夠透過陶瓷膜；使用超濾膜時(shí)，茶皂素的透過率很低，并且隨著膜孔徑的減小，透過率降低，截留率升高；使用納濾膜時(shí)，茶皂素的透過率為零。該試驗(yàn)結(jié)果與趙敬娟等［17］的一致，即孔徑越小，對粒子或溶質(zhì)的截留率越高。根據(jù)膜分離原理，陶瓷膜可以截留大部分的蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)，通過收集透過液即可達(dá)到純化目的，而360Da的納濾膜可以透過水、無機(jī)鹽等小分子物質(zhì)，通過收集納濾的截留液可以達(dá)到濃縮的目的，因此選取陶瓷膜和納濾膜相結(jié)合的方式純化茶皂素。取經(jīng)陶瓷膜分離的茶皂素透過液2 600mL，經(jīng)360Da納濾濃縮得到濃縮液750mL，濃縮倍數(shù)為3.5倍，濃縮試驗(yàn)歷時(shí)22min。膜純化后濃縮液經(jīng)噴霧干燥得到淡黃色粉末狀的茶皂素，其得率為62.1%，純度為79%。

圖3 不同的膜對茶皂素的純化效果Figure 3 The purification effet of tea saponin by different membrane

2.3 大孔樹脂的選擇

2.3.1 靜態(tài)吸附茶皂素用大孔樹脂篩選 不同的大孔樹脂因材質(zhì)、極性強(qiáng)弱、孔徑大小、比表面積等物理性質(zhì)不同，其對同種物質(zhì)的吸附純化效果也不同。試驗(yàn)中所選取的10種大孔樹脂，涵蓋范圍較廣，能夠初步考察不同極性、孔徑、比表面積的大孔樹脂對茶皂素純化效果的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，XAD7HP、HPD－600、AB－8、HP－20 4種大孔樹脂對茶皂素的吸附和解吸作用良好，吸附率和解吸率均達(dá)到85%以上，其中以XAD7HP大孔樹脂最高，吸附率和解吸率分別高達(dá)92%和94%，即經(jīng)純化后的茶皂素的得率（吸附率×解吸率）最高，為86.48%。

圖4 不同大孔樹脂對茶皂素的純化效果Figure 4 The purification effet of tea saponin by different membrane

選取效果較好的4種大孔樹脂繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線，見圖5。由圖5可知，4種大孔樹脂在0.5h內(nèi)吸附速度最快，隨著時(shí)間的推移，吸附速度逐漸變緩，最后趨于平衡，為典型的langmuir吸附等溫線，屬于單分子層吸附［8，21］。

圖5 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Figure 5 The curve of static adsorption kinetics

2.3.2 動(dòng)態(tài)吸附茶皂素用大孔樹脂的篩選 由于大孔樹脂對物質(zhì)的動(dòng)態(tài)吸附和靜態(tài)吸附存在一定差異，并且在實(shí)際的試驗(yàn)和生產(chǎn)過程中，都是采用動(dòng)態(tài)吸附洗脫方式，所以采用動(dòng)態(tài)吸附法進(jìn)一步篩選大孔樹脂。以靜態(tài)吸附試驗(yàn)篩選出的效果較好的4種大孔樹脂，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附篩選試驗(yàn)，結(jié)果見圖6。

圖6 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附篩選試驗(yàn)Figure 6 The screening experiment of macroporous resin dynamic adsorption

由圖6可知，XAD7HP大孔樹脂吸附率和解吸率分別高達(dá)70.81%和90.62%，均高于其他3種大孔樹脂，茶皂素的得率最高，為64.17%。結(jié)合靜態(tài)吸附篩選試驗(yàn)可知，XAD7HP型大孔樹脂用于茶皂素的純化，效果最佳。

大孔樹脂的吸附作用是依靠樹脂和被吸附的分子之間的范德華引力，通過樹脂巨大的比表面進(jìn)行物理吸附，根據(jù)有機(jī)物吸附力和分子量大小經(jīng)一定溶劑洗脫而達(dá)到分離純化、除雜的目的。茶皂素的平均分子量為1 200Da左右，極性強(qiáng)，易溶于熱水、甲醇水溶液、乙醇水溶液中。根據(jù)相似相容原理以及大孔樹脂吸附原理，適宜選用極性大，孔徑大，比表面大的大孔樹脂。XAD7HP屬于極性大孔樹脂，比表面積大，平均孔徑較大，適宜分離純化茶皂素。

2.4 大孔樹脂純化茶皂素的條件優(yōu)化

2.4.1 上樣液濃度對吸附效果的影響 由圖7可知，隨上樣液濃度的增加，吸附率先增加后減小，濃度為30mg/mL時(shí)吸附率最大。當(dāng)上樣液濃度過低時(shí)，茶皂素與大孔樹脂之間的吸附不充分，造成吸附率低；而上樣液濃度過高時(shí)，溶液中雜質(zhì)濃度升高，與茶皂素在樹脂上競爭吸附，同時(shí)濃度過高時(shí)，溶液易產(chǎn)生沉淀，影響其吸附率［22］。因此茶皂素濃度為30mg/mL時(shí)吸附效果最佳。

圖7 茶皂素濃度對吸附效果的影響Figure 7 The adsorption effect of the tea saponin concentration

2.4.2 上樣流速對吸附效果的影響 由圖8可知，流速為0.5mL/min時(shí)，茶皂素與大孔樹脂的吸附時(shí)間充足，吸附率最高；隨著流速增加，茶皂素與大孔樹脂的接觸時(shí)間減少，吸附率逐漸降低，吸附效果變差。因此選用0.5mL/min的流速進(jìn)行上樣。

圖8 上樣流速對吸附效果的影響Figure 8 The adsorption effect of the sample flow rate

2.4.3 洗脫劑濃度對解吸效果的影響 由圖9可知，隨著乙醇濃度增大，解吸率增加，當(dāng)乙醇濃度為70%，80%，90%時(shí)，解吸率幾乎不變，均為92%左右，對茶皂素洗脫效果較好，結(jié)合成本考慮，選用70%乙醇進(jìn)行洗脫。乙醇濃度為10%時(shí)，茶皂素的洗脫率低，色素等水溶性較好的雜質(zhì)首先被洗脫去除；乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)，洗脫率增加至43.96%，部分茶皂素被洗脫；乙醇濃度為70%時(shí)，茶皂素基本洗脫完全。綜合考慮，選取10%，40%，70%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，可以去除大部分雜質(zhì)，得到較高純度的茶皂素。

圖9 洗脫液乙醇濃度對解吸效果的影響Figure 9 The desorption effect of ethanol concentration

2.4.4 洗脫劑洗脫流速對解吸效果的影響 由圖10可知，隨著洗脫劑流速的增加，洗脫率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。洗脫流速為1mL/min時(shí)，洗脫率最大，洗脫效果較為理想。洗脫流速增大，乙醇與大孔樹脂吸附的茶皂素之間的作用時(shí)間減少，影響其解吸效果，但流速過慢，增加洗脫時(shí)間，將影響茶皂素解吸效率。

2.4.5 洗脫液體積對解吸效果的影響 大孔樹脂洗脫時(shí)，洗脫劑的體積越大洗脫效果越好，但成本也相應(yīng)增加。由圖11可知，洗脫劑用量為3BV時(shí)，茶皂素洗脫率已高達(dá)93%，洗脫劑用量繼續(xù)增加，洗脫率增加幅度很小，所以3BV的洗脫劑量最為適宜。

圖10 洗脫液流速對解吸效果的影響Figure 10 The desorption effect of eluent flow rate

圖11 洗脫液體積對解吸效果的影響Figure 11 The desorption effect of eluent volume

2.5 大孔樹脂對茶皂素的純化

采用優(yōu)選出的XAD7HP大孔樹脂以流速0.5mL/min、茶皂素濃度30mg/mL上樣，以10%，40%，70%的乙醇各3BV，在流速1mL/min下進(jìn)行梯度洗脫，收集40%和70%乙醇的洗脫液，濃縮、干燥后得到白色粉末狀茶皂素，其得率為55.3%，純度為95%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用膜分離和XAD7HP大孔樹脂聯(lián)用技術(shù)來純化茶皂素，其得率和純度均高于張新福［17］通過膜分離和AB－8大孔樹脂純化茶皂素的研究結(jié)果。同時(shí)結(jié)果表明，膜分離法與樹脂聯(lián)用技術(shù)純化茶皂素時(shí)，無需添加其他化學(xué)試劑，無污染，生產(chǎn)過程簡單，成本低，效率高，易于連續(xù)化生產(chǎn)，是一種可工業(yè)化推廣的方法。

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