HPLC—ELSD法同時測定馬鈴薯中α－茄堿和α－卡茄堿含量

商婷婷 鄺夢婷 胡新喜，2 熊興耀，2 陸 英，3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

馬鈴薯作為一種主要的經(jīng)濟(jì)作物在世界范圍內(nèi)廣為種植。馬鈴薯植株和塊根中含有一類甾體類糖苷生物堿，主要為α－茄堿和α－卡茄堿，在芽、幼葉、花、未成熟塊根以及成熟薯皮組織中含量均較高［1］。研究表明，這類糖苷生物堿在體內(nèi)外均具有較強(qiáng)的毒性［2，3］，有抗腫瘤［4］、抗瘧［5，6］、強(qiáng)心［7］、抗病毒［8］、降脂［9］等多種功效，因此，在食品安全和醫(yī)藥開發(fā)中都具有重要意義。近年來的研究［10］還發(fā)現(xiàn)，這類生物堿對抵御病原菌和病蟲害等有一定的作用，能抑制和殺滅某些真菌、細(xì)菌等病原微生物，因此，作為綠色農(nóng)藥的開發(fā)利用方面也具有廣闊前景。

蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）不依賴樣品的光學(xué)性質(zhì)，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，近年來被廣泛用于低紫外吸收物質(zhì)的檢測，同時ELSD對物理性質(zhì)相似的物質(zhì)可以給出一致的響應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線［11，12］，可在無對照品的情況下，采用另外一種結(jié)構(gòu)相似、含量已知的物質(zhì)作對照，從而測定未知物的含量［13］。目前對馬鈴薯中生物堿含量的測定主要采用高效液相色譜法（HPLC）［14－18］，在210nm 處進(jìn)行紫外檢測（UV），由于分子內(nèi)僅存在一個共軛雙鍵，屬于紫外末端吸收，溶劑對檢測的影響較大，基線不穩(wěn)，特別是當(dāng)樣品中生物堿含量低時，雜質(zhì)干擾顯得尤為嚴(yán)重。同時，α－卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴且難以獲得，很多研究僅測定了α－茄堿的含量，缺乏對α－卡茄堿的研究報道。由于α－茄堿和α－卡茄堿具有相同的母核結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)極相似，本試驗擬以α－茄堿為標(biāo)準(zhǔn)品，建立HPLC—ELSD同時檢測馬鈴薯中兩種主要生物堿的方法，并對馬鈴薯不同部位含量進(jìn)行測定，為馬鈴薯中生物堿安全評價及開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

α－茄堿標(biāo)樣：純度為99%，北京百靈威有限公司；

乙腈：色譜純，美國天地公司；

馬鈴薯及莖葉材料：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心提供。馬鈴薯植株采于2014年5月中旬（品種：金湘），于地面上10cm處割下并分別制備莖、葉、葉柄、全株樣品，馬鈴薯削皮約2～3mm厚，肉皮分離，所有鮮樣切成小段或薄片，置60℃烘箱中干燥，粉碎，密閉后置冰箱備用。

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：LC－20A型，日本島津公司；

ELSD檢測器：ELSD－400型，美國SOFTA公司；

色譜柱：ZORBAX SB－C18（250mm×4.6mm，5μm），美國安捷倫公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH型，金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 HPLC—ELSD分析條件 流動相 A：0.1%三氟乙酸水溶液；B：乙腈；梯度洗脫：0～20min，25%～35%B；流速1mL/min，柱溫35℃，ELSD霧化管溫度30℃，漂移管溫度98℃，載氣壓力6.90kPa。

1.3.2 α－茄堿標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精密稱取α－茄堿標(biāo)準(zhǔn)品9.90mg用甲醇超聲溶解定容至10mL，制成0.98mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取5，10μL進(jìn)樣，將該標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋10倍后再取2，5，10，20μL，每個進(jìn)樣體積重復(fù)進(jìn)樣3次，測定并記錄峰面積，以進(jìn)樣質(zhì)量（μg）的對數(shù)為橫坐標(biāo)（x），以化合物的平均峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，噪音3倍峰高質(zhì)量為檢出線。

1.3.3 α－卡茄堿定量方法 由于ELSD檢測器對結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)具有相同的響應(yīng)因子，因此具有相近的線性方程［11，12］，因此在無對標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，可采用α－茄堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算α－卡茄堿的含量。

1.3.4 樣品含量測定 精確稱取樣品1.0g，用100mL 1%甲酸甲醇于70℃回流提取90min，過濾，薯皮、薯葉提取液定容至100mL，其他部位提取液在50℃下濃縮，定容至25mL，得供試品溶液。樣液過膜，在1.3.1條件下進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算α－茄堿和α－卡茄堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC—ELSD分析條件的確定

文獻(xiàn)［15～18］采用HPLC—UV法測定α－茄堿的流動相為H3PO4水溶液—乙腈，由于H3PO4不具揮發(fā)性，不能作為HPLC—ELSD的流動相，因此選用具有揮發(fā)性的三氟乙酸水溶液與乙腈為流動相，同時考慮到色譜柱的pH耐受值，確定水溶液中三氟乙酸的用量為0.1%。本試驗首先考察并優(yōu)化了漂移管溫度、載氣壓力對色譜峰分離的影響，結(jié)果表明漂移管溫度升高，流動相蒸發(fā)趨于完全，信號響應(yīng)值變大，但溫度過高，信號響應(yīng)值變小，當(dāng)漂移管溫度為98℃時信號響應(yīng)值最大；載氣壓力不同使載氣流速不同，載氣流速影響霧化器中液滴的形成，從而影響檢測器的響應(yīng)，載氣壓力為6.90kPa時，噪聲信號小，色譜圖基線平穩(wěn)，目標(biāo)組分響應(yīng)值高。同時通過洗脫梯度的調(diào)整，在1.3.1色譜條件下兩目標(biāo)組分分離良好，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物確定峰1為α－茄堿，根據(jù)文獻(xiàn)［14］確定峰2為α－卡茄堿，見圖1。

圖1 α－茄堿及馬鈴薯皮提取液的HPLC—ELSD圖譜Figure 1 HPLC—ELSD chromatogram ofα－solanine and the extract of potato skins

2.2 α－茄堿標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按1.3.1方式進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量對數(shù)為橫坐標(biāo)x，峰面積對數(shù)為縱坐標(biāo)y（圖2）得回歸方程為y＝1.207 9x＋4.807 0，r2＝0.999 5，α－茄堿在0.196～9.800μg線性關(guān)系良好。最低檢出限為0.098μg。

圖2 α－茄堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve ofα－solanine

2.3 馬鈴薯生物堿提取條件的確定

2.3.1 提取溶劑的選擇 α－茄堿、α－卡茄堿屬于甾體類生物堿，只溶于甲醇、乙醇、吡啶等少數(shù)有機(jī)溶劑中，同時它們具有弱堿性，能在酸性條件下成鹽增加溶解度。文獻(xiàn)［14～16］均采用酸提堿沉等方式提取及凈化，本試驗采用提取液直接進(jìn)樣，不需富集、凈化等復(fù)雜前處理，并考慮ELSD檢測器對進(jìn)樣溶液的要求，以馬鈴薯皮為原料，首先考察不同溶劑的提取效果，由表1可知，提取溶劑甲醇優(yōu)于乙醇，甲酸優(yōu)于乙酸，1%甲酸甲醇對α－茄堿、α－卡茄堿提取效果均最好。

表1 提取溶劑比較Table 1 Comparison of extraction solvent mg/g

2.3.2 提取條件的確定 以馬鈴薯皮為原料，1%甲酸甲醇為提取溶劑，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對提取溫度、時間、溶劑用量進(jìn)行三因素三水平的正交試驗，因素水平表見表2，結(jié)果見表3。由表3可知：馬鈴薯生物堿最佳提取條件為A3B3C3。即提取溫度70℃，提取時間90min，料液比1∶100（m∶V）。由極差分析可知：影響α－茄堿提取效果的因素依次為：時間＞溫度＞溶劑用量，影響α－卡茄堿提取效果的因素依次為：溶劑用量＞溫度＞時間，但均無顯著性差異（方差分析表略）。驗證實驗（表4）表明，正交分析得到最佳提取條件A3B3C3優(yōu)于正交組中含量最高組合A3B3C2。

表2 因素水平表Table 2 Factor level table

表3 正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Orthogonal experiment results

表4 提取條件的驗證實驗Table 4 Verification test of extraction conditions（n＝2）mg/g

2.4 精密度試驗

取同一份樣品溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄α－茄堿、α－卡茄堿面積，結(jié)果見表5。由表5可知：同一樣品重復(fù)進(jìn)樣，RSD分別為1.13%，0.58%，說明儀器精密度良好。

表5 精密度試驗Table 5 Results of precision test

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一份樣品溶液，分別于0，1，2，3，4h進(jìn)樣，記錄α－茄堿、α－卡茄堿峰面積，結(jié)果見表6。由表6可知：樣品溶液在4h內(nèi)穩(wěn)定，RSD 分別為2.33%，2.94%。

表6 穩(wěn)定性試驗Table 6 Results of stability test

2.6 重復(fù)性試驗

取馬鈴薯皮樣品，按方法分別制得供試品溶液3份，分別進(jìn)樣測定，記錄α－茄堿、α－卡茄堿峰面積，結(jié)果見表7。由表7可知：峰面積RSD 分別為3.11%，1.10%，方法重現(xiàn)性好。

表7 重復(fù)性試驗Table 7 Results of repeated test

2.7 加標(biāo)回收試驗

精密取已知含量的馬鈴薯皮原料3份各1.0g，精確加入α－茄堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，按樣品制備方法提取并分析，結(jié)果見表8。由表8可知：α－茄堿的回收率在101.61%～97.44%，平均回收率為99.4%，RSD為1.1%，回收率高，達(dá)到測定要求。

表8 加標(biāo)回收率試驗Table 8 Results of recovery test

2.8 樣品含量測定

按1.3.4方法制備馬鈴薯不同部位供試品溶液，平行制備2次，測定結(jié)果見表9。由表9可知，馬鈴薯植物的不同部位均含有生物堿，且兩種生物堿含量差異很大，α－茄堿的含量為0.13～1.59mg/g，由高到低為薯皮＞葉＞地上全株≈薯肉＞莖；α－卡茄堿的含量為0.39～8.28mg/g，由高到低為葉＞薯皮＞地上全株＞薯肉＞莖；兩種生物堿總量為0.52～9.37mg/g，同一部位中α－卡茄堿的含量是α－茄堿含量的1.2～7.6倍。

3 結(jié)束語

本試驗通過對提取條件的優(yōu)化、檢測方法學(xué)考察等試驗建立了HPLC—ELSD測定馬鈴薯中兩種主要生物堿α－茄堿和α－卡茄堿的方法，樣品處理方法簡便，不需凈化直接進(jìn)樣，目標(biāo)組分的色譜峰形好，柱效高，分離度好。同時試驗基于ELSD檢測器對結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)具有相同響應(yīng)因子的特點，通過α－茄堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線完成α－茄堿和α－卡茄堿的含量測定，對一些標(biāo)準(zhǔn)品缺乏的物質(zhì)含量檢測具有一定的借鑒意義。

表9 馬鈴薯不同部位生物堿含量Table 9 Alkaloid content in different part of the potato plant（n＝2） mg/g

由試驗結(jié)果可知，馬鈴薯植物的不同部位均含有生物堿，葉、薯皮、地上全株部分含量較高，特別是馬鈴薯地上部分的產(chǎn)量遠(yuǎn)大于馬鈴薯皮，因此以地上部分特別是葉作為原料進(jìn)行糖苷生物堿的提取，并開發(fā)成為藥品、生物農(nóng)藥等具有廣闊的前景，也可為農(nóng)業(yè)資源廢棄物的深度開發(fā)利用開辟新的途徑。

1 Mendel Friedman，Carol E Levin.α－Tomatine content in tomato and tomato products determined by hplc with pulsed amperometric detection［J］.J.Agric.Food Chem.，1995，43（6）：1 507～1 511.

2 Friedman M.Analysis of biologically active compounds in potatoes（Solanum tuberosum），tomatoes （Lycopersicon esculentum），and jimson weed（Datura stramonium）seeds［J］.J.Chromatogr A，2004，1 054（1～2）：143～155.

3 Mendel Friedman.Tomato glycoalkaloids：role in the plant and in the diet［J］.J.Agric.Food Chem.，2002，50（21）：5 751～5 780.

4 Y O Son，J Kim，J C Lim，et al.Ripe fruits of solanum nigrium L.inhibits cell growth and induces apoptosis MCF－7cells［J］.Food and Chemical Toxicology，2003，41（10）：1 421～1 428.

5 Rajananthanan P，Attard GS，Sheikh NA，et al.Novel aggregate structure adjuvants modulate lymphocyte proliferation and Th1 and Th2cytokine profiles in ovalbumin immunized mice［J］.Vaccine，1999，18（1～2）：140～152.

6 Heal KG，Sheikh NA，Hollingdale MR，et al.Potentiation by a novel alkaloid glycoside adjuvant of a protective cytotoxic T cell immune response specific for a preerythrocytic malaria vaccine candidate antigen［J］.Vaccine，2001，19（30）：4 153～4 161.

7 Bergers W W，Alink G M.Toxic effect of the glycoalkaloids solanine and tomatine on cultured neonatal rat heart cells［J］.Toxicol.Lett.，1980，6（1）：29～32.

8 Thome H V，Clarke G F，Skuce R.The inactivation of herpes simplex virus by some Solanaceae glycoalkaloids［J］.Antiviral Res.，1985，5（6）：335～343.

9 M Friedman，T E Fitch，W E Yokoyama.Lowering of plasma LDL cholesterol in hamsters by the tomato glycoalkaloid tomatine［J］.Food Chemical Toxicology，2000，38（7）：549～553.

10 Alison M Fewell，James G Roddick.Interactive antifungal activity of the glycoalkaloidsα－solanine andα－chaconine［J］.Phytochemistry，1993，33（2）：323～328.

11 王明娟，胡昌勤，金少鴻.氨基糖苷類抗生素在蒸發(fā)光散射檢測器中響應(yīng)因子的一致性考察［J］.藥學(xué)學(xué)報，2002，37（3）：204～206.

12 洪建文，胡昌勤，盛龍生.喹諾酮類抗生素在蒸發(fā)光散射檢測器中響 應(yīng) 因 子 的 一 致 性 考 察 ［J］.藥 學(xué) 學(xué) 報，2003，38（9）：695～697.

13 Fang L，Wan M，Pennacchio M，et al.Evaluation of evaporative light－scattering detector for combinatorial library quantitation by reversed phase HPLC［J］.J.Comb Chem.，2000，2（3）：254～257.

14 Robert J Houben，Kommer Brunt.Determination of glycoalkaloids in potato tubers by reversed high－performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，1994，661（1～2）：169～174.

15 王守蘭，朱佳.高效液相色譜法測定馬鈴薯中α－茄堿的含量［J］.食品科學(xué)，1996，17（6）：60～61.

16 肖文，李勤，熊興耀，等.高效液相色譜法分析馬鈴薯中α－茄堿［J］.分析化學(xué)，2011，39（9）：1 459～1 460.

17 Lan Dao，Mendel Friedman.Comparison of glycoalkaloid content of fresh and freeze－dried potato leaves determined by HPLC and colormetry［J］.Agric.Food Chem.，1996（8）：2 287～2 291.

18 Sotelo A，Serrano B.High－performance liquid chromatographic determination of the glycoalkaloids alpha－solanine and alphachaconine in 12commercial varieties of Mexican potato［J］.Agric.Food Chem.，2000，48（6）：2 472～2 475.