家兔Cep55基因與其生長(zhǎng)發(fā)育性狀的關(guān)聯(lián)性分析

陳定超 ，楊 嵩 ，沈峻宇 ，冉 強(qiáng)

（1.四川省閬中市畜牧食品局，四川 閬中 637400；2.四川省畜牧總站，四川 成都 610041；3.四川省南充市順慶區(qū)畜牧局，四川 南充 637000；4.四川省汶川縣農(nóng)業(yè)畜牧和水產(chǎn)局，四川 汶川 623000）

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料采集 選擇四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科研兔場(chǎng)飼養(yǎng)的新西蘭兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采集0.5cm2大小的耳組織為實(shí)驗(yàn)材料，將采集的耳組織投入盛有75%酒精的EP管內(nèi)，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20℃保存?zhèn)溆谩ｋS機(jī)采集了416個(gè)樣本，公母各半。

1.2 各種試劑盒及主要試劑 提取組織中的全基因組用美國(guó)Axyen公司的Genomic DNA Miniprep試劑盒，PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒為OMEGA公司的E.Z.N.A.TM膠回收試劑盒。Taq DNA聚合酶購(gòu)至北京 艾 德 萊 公 司 ，6×Loading Buffer、Golden View 和DNA Marker 2000購(gòu)至北京天根公司，瓊脂糖和DECP購(gòu)至大連寶生物公司。常規(guī)的氫氧化鈉、氯化鈉、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA的抽提及檢測(cè)

1.3.1.1 基因組DNA的抽提 采用Genomic DNA Miniprep Kit基因組提取試劑盒提取家兔全基因組DNA，抽提前對(duì)實(shí)驗(yàn)所需器材進(jìn)行高溫滅菌處理。抽提過程詳見試劑盒說明書。將抽提好的DNA進(jìn)行分裝，轉(zhuǎn)移50μL至新的EP管中用于檢測(cè)及近期使用。

1.3.1.2 DNA濃度和純度的檢測(cè) 使用Nano Vue超微量核酸蛋白儀對(duì)DNA濃度和純度進(jìn)行快速檢測(cè)。選擇用于檢測(cè)DNA濃度和純度的相應(yīng)程序后，取2.5μL Eluent緩沖液，直接在儀器的點(diǎn)樣表面點(diǎn)樣檢測(cè)，檢測(cè)后，用擦鏡紙擦拭干凈，重復(fù)3次，進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)零校正。每次取待測(cè)DNA樣品2.5μL進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，記錄DNA的濃度值和OD260/OD280比值。OD260/OD280比值是反映DNA純度的指標(biāo)，越純DNA樣品的OD260/OD280比值越接近1.8。質(zhì)量較好的DNA樣品，其OD260/OD280比值在1.6～1.8范圍之內(nèi)。如果比值大于1.8，說明還有RNA的存在，可用RNA酶進(jìn)行處理；若比值小于1.6則說明樣品中有蛋白質(zhì)或酚的殘存，可再用苯酚/氯仿或乙醚處理；可能還會(huì)出現(xiàn)比值為1.8，但實(shí)質(zhì)DNA中既有蛋白質(zhì)又含RNA的情況。因此，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果可以準(zhǔn)確地確定DNA的濃度和純度。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)NCBI上提供的家兔Cep55基因的DNA序列（ Genbank ID：XM_002718513.2），先針對(duì)該基因的部分功能區(qū)域用Primer 5設(shè)計(jì)引物進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)（表1），所有引物的合成都由華大基因公司完成。并且針對(duì)每對(duì)引物，根據(jù)公司預(yù)測(cè)的最適退火溫度設(shè)計(jì)恰當(dāng)?shù)臏囟忍荻冗M(jìn)行梯度PCR。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，先根據(jù)擴(kuò)增條帶和Maker的相對(duì)位置確定PCR產(chǎn)物是否為目的條帶，再觀察條帶的清晰度和亮度，選擇最佳的退火溫度。

1.3.3 PCR擴(kuò)增體系和程序 選擇好最佳退火溫度后，對(duì)DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，送測(cè)序，以期通過DNA水平檢測(cè)到SNP位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系10μL，包括2×Taq PCR Mix 酶 5 μL，上、下游引物（ 10 pmol/μL） 各0.4μL，DNA 模板 1μL，加去離子水（ ddH2O）至 10μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 3 min；95℃變性35 s，55℃退火 30s，72℃延伸 60s（ 共 38個(gè)循環(huán)）；72℃延伸10min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

表1 PCR引物序列

1.3.4 PCR產(chǎn)物的檢測(cè) 取2 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，同時(shí)加入DL2000 Marker共泳作分子量的對(duì)照，180V電泳7min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果，并拍照保存。

在抽提的DNA樣品中隨機(jī)選取16個(gè)樣進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)后，將PCR產(chǎn)物每4個(gè)樣混合在一起，進(jìn)行PCR產(chǎn)物混合測(cè)序，并檢測(cè)遺傳多態(tài)性。全部分裝好后，將4管樣送至華大基因公司測(cè)序。

1.3.5 產(chǎn)物基因型判定 凝膠電泳判定基因型是根據(jù)單鏈DNA片段的空間構(gòu)象不同來實(shí)現(xiàn)分離的，與DNA的分子量大小和帶電無關(guān)。PCR產(chǎn)物在被限制酶內(nèi)切后，野生型個(gè)體應(yīng)該產(chǎn)生被切斷的兩條電泳條帶，突變雜合子有3條帶，而突變純合子只有PCR產(chǎn)物一條帶。

1.3.6 序列測(cè)定 將分辨出來的不同基因型各選一個(gè)個(gè)體，進(jìn)行 30 μL體系的 PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為10 μL體系各試劑添加量的3倍，然后將得到的PCR產(chǎn)物送相關(guān)基因公司純化測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 主要分子生物學(xué)軟件 用Oligo7軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，運(yùn)用DNAman軟件進(jìn)行序列保存和查看，用Chromas軟件來看測(cè)序的峰圖，用Multiple sequence alignment軟件進(jìn)行多序列的相似性比對(duì)，用Statistics Analysis System 9.3軟件包和SPSS 12.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.2 結(jié)果分析指標(biāo) 基因型頻率和等位基因頻率的計(jì)算；遺傳多態(tài)性分析：遺傳純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的抽提與檢測(cè) 結(jié)果見圖1。只有當(dāng)紫外燈下觀察到單一且明亮的條帶時(shí)，才可順利進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 基因組DNA電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 外顯子 3、6、9的PCR擴(kuò)增及電泳 利用表 1的引物，以基因組DNA為模板分別擴(kuò)增得到外顯子3、6、9的 PCR產(chǎn)物。 外顯子3、6、9的 PCR產(chǎn)物的電泳圖結(jié)果如圖2所示。

2.3 DNA水平上的遺傳多態(tài)性研究

2.3.1 DNA上突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn) 在DNA水平上設(shè)計(jì)3對(duì)引物，檢測(cè)Cep55基因所有外顯子區(qū)域的多態(tài)性位點(diǎn)。經(jīng)序列比較分析，總共發(fā)現(xiàn)Cep55基因編碼區(qū)存在5個(gè)變異位點(diǎn)，均位于外顯子9的3′UTR區(qū)上， 分別為 c.1759G>A、c.1796C>T、c.2012C>G、c.2163G>A和c.2227A>G。

圖2 外顯子3、6、9的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3.2 家兔Cep55基因各突變位點(diǎn)基因型的確定 序列用Seqman軟件比對(duì)，在測(cè)序圖中找到相應(yīng)的突變位點(diǎn)，根據(jù)峰圖中突變位點(diǎn)的峰值以及單雙峰情況來確定基因型。純合子突變位點(diǎn)的測(cè)序峰為單一峰型，而雜合子突變位點(diǎn)的測(cè)序峰為套峰，雜合子的兩個(gè)峰比兩種純合子的峰都要低。其中c.2012C>G位點(diǎn)的峰圖如圖3所示。從圖中可以看出，該位點(diǎn)上存在一個(gè)C/G的突變，其中CC為野生型，CG為雜合突變型，GG為突變純合子。

圖3 外顯子9 c.2012C>G測(cè)序峰圖

對(duì)外顯子9重新隨機(jī)選取24個(gè)樣品進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為30 μL，之后將產(chǎn)物送往華大基因公司進(jìn)行單管測(cè)序。圖4為單管測(cè)序樣品的PCR電泳圖。

圖4 外顯子9 PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3.3 c.2012C>G位點(diǎn)與家兔不同生長(zhǎng)階段日齡重及35～84日齡平均日增重的關(guān)聯(lián)性分析 根據(jù)SNP位點(diǎn)周邊序列特點(diǎn)，在c.2012C>G位點(diǎn)采用PCRFRLP技術(shù)對(duì)416個(gè)個(gè)體進(jìn)行基因分型，得到三種基因型的個(gè)體數(shù)分別為 CC（ 114）、CG（ 269）、GG（ 33），其等位基因頻率、基因型頻率及多態(tài)信息含量見表2。由表2可知，C等位基因頻率為0.60，G等位基因頻率為0.40。三種基因型CC、CG、GG的基因型頻率分別為0.27、0.65和0.08。遺傳雜合度（He）、多態(tài)信息含量（ PIC）以及有效等位基因數(shù)（ Ne）分別為 0.4815、0.3025（中度多態(tài)）和1.9285。

表2 c.2012 C>G位點(diǎn)的等位基因、基因型頻率及多態(tài)信息含量

采用最小二乘法分析Cep55基因c.2012 C>G位點(diǎn)與家兔不同生長(zhǎng)階段生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，結(jié)果見表3。

表3 基因型與不同日齡體重的最小二乘均方計(jì)算結(jié)果

注:ADG為35～84日齡的平均日增重，數(shù)據(jù)用平均值±方差表示；同行肩標(biāo)不同字母表示不同的差異顯著性水平。

3 討論

3.1 候選基因的篩選 生長(zhǎng)性狀受多基因控制，目前已發(fā)現(xiàn)一些基因如GHR、FTO、MSTN等與家兔生長(zhǎng)性狀相關(guān)，但這只是影響生長(zhǎng)性狀的部分基因[1]。本實(shí)驗(yàn)首先通過檢測(cè)Cep55基因不同基因型與不同生長(zhǎng)階段的家兔生長(zhǎng)發(fā)育情況的關(guān)系，確認(rèn)Cep55可以作為家兔生長(zhǎng)發(fā)育性狀的候選基因。Cep55基因調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，對(duì)細(xì)胞的分裂速度和生長(zhǎng)因子反應(yīng)等多個(gè)方面都起著十分重要的作用。

3.2 基因型和生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析 從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)我們可以發(fā)現(xiàn)，56日齡以前，各基因型之間個(gè)體重的數(shù)值相差不多，但是到了生長(zhǎng)后期，不同基因型之間的差距就明顯表現(xiàn)出來了，但是同一基因型個(gè)體在不同階段的生長(zhǎng)速度比較均衡。

CG基因型的個(gè)體在40日齡前的個(gè)體重大于CC基因型的個(gè)體，但是40日齡之后，CC基因型的個(gè)體重就逐漸開始大于CG基因型的個(gè)體重，而且隨著日齡的增大差距越來越大。說明CG基因型個(gè)體的早期生長(zhǎng)速度較快，但是CC基因型個(gè)體的后期生長(zhǎng)速度明顯大于CG基因型的個(gè)體。而GG基因型的個(gè)體在出欄前的整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)，其生長(zhǎng)速度都很緩慢?？梢姷任换駽具有促進(jìn)家兔生長(zhǎng)發(fā)育的作用。

3.3 UTR區(qū)的相關(guān)研究 隨著后基因組時(shí)代的到來，非編碼區(qū)的研究已經(jīng)成為科學(xué)家面臨的挑戰(zhàn)，對(duì)基因非編碼區(qū)的一個(gè)主要研究方向就是對(duì)調(diào)控元件的研究。識(shí)別轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是理解基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制和表達(dá)模式的關(guān)鍵。雖然人們已經(jīng)了解了基因的結(jié)構(gòu)，掌握了遺傳密碼，但對(duì)于非編碼區(qū)還了解很少，普遍認(rèn)為它們與基因在四維時(shí)空的表達(dá)調(diào)控有關(guān)[2]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，3′UTR區(qū)對(duì)基因有調(diào)控表達(dá)作用[3-5]。

4 結(jié)論

通過本實(shí)驗(yàn)研究及統(tǒng)計(jì)分析，我們初步得出以下結(jié)論：

4.1 在新西蘭兔Cep55基因的外顯子9中共發(fā)現(xiàn)了5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，均位于外顯子9的3′UTR區(qū)，分別為 c.1759G>A、c.1796C>T、c.2012C>G、c.2163G>A 和c.2227A>G。

4.2 Cep55基因外顯子9上的5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)完全連鎖。

4.3 Cep55基因外顯子9的5個(gè)位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)。

4.4 關(guān)聯(lián)性分析表明，CC基因型在家兔的生長(zhǎng)后期有顯著的增重效應(yīng)，而GG基因型的幾乎所有生長(zhǎng)階段的個(gè)體重均顯著低于其他兩個(gè)基因型，說明Cep55基因外顯子9序列的突變位點(diǎn)可作為家兔生長(zhǎng)性狀的遺傳標(biāo)記。

4.5 3′UTR區(qū)可能作為調(diào)控元件影響家兔生長(zhǎng)的相關(guān)性狀。

[1]Peng J， ZhangW X， Zhang G W， et al.Papid genotyping of MSTN gene polymorphism using highresolution melting for association study in rabbits[J].Asian Austral J Anim，2013，26（1）:30-35.

[2]馬志強(qiáng),崔穎,馬雅楠，等.基因非編碼區(qū)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的識(shí)別研究[J].生物信息學(xué)，2008（4）:187-189.

[3]安雅臣,馮福民,袁聚祥.NRAMP1基因INT4和3′UTR位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的研究[J].中華流行病學(xué)雜志，2006，27（1）.

[4]趙巧輝,陳其新,李明，等.家兔 BMP7基因3′UTR的克隆及序列分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009（2）:28-34.

[5]楊具田,徐紅偉,臧榮鑫，等.五個(gè)地方綿羊品種FAS基因3′UTR區(qū)單核苷酸多態(tài)性研究 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（13）.